【基地班生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)講義】酸性磷酸酯酶的提取

【基地班生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)講義】酸性磷酸酯酶的提取實(shí)驗(yàn)一、酸性磷酸酯酶的提取分離純化一、目的掌握胞內(nèi)酶的分離提取方法，學(xué)會(huì)離心機(jī)的使用。二、原理酸性磷酸酯酶(AcidPhosphatase，EC3．1．3．2)存在于植物的種籽、霉菌、肝臟和人體的前列腺之中，能專一性地水解磷酸單酯鍵。本實(shí)驗(yàn)選用綠豆芽的酸性磷酸酯酶為材料，磷酸苯二鈉為底物。磷酸苯二鈉經(jīng)過酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和無機(jī)磷，其反應(yīng)式如下：由上式可見，當(dāng)有足量的底物磷酸苯二鈉存在時(shí)，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的產(chǎn)物酚和無機(jī)磷也越多。根據(jù)酶活力單位的定義，在酶促反應(yīng)的最適條件下每分鐘生成1微摩爾(μmo1)產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)活力單位，因此可用Folin一酚法測定產(chǎn)物酚或用定磷法測定無機(jī)磷來表示酸性磷酸酯酶的活力。本實(shí)驗(yàn)采用的是Folin-酚法。實(shí)驗(yàn)前將綠豆芽細(xì)胞破碎，釋放出酸性磷酸酯酶，離心除去細(xì)胞碎片和植物纖維等雜質(zhì)，得到酸性磷酸酯酶的粗酶溶液，為下面的酶學(xué)性質(zhì)研究及SDS電泳法測分子量等系列生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。三、實(shí)驗(yàn)器材1．LGl0—2.4A高速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)，1臺(tái)／組2．托盤天平：1臺(tái)／組。3．滴管：1支／組。4．100mL燒杯：2只／組。5．100mL三角燒瓶：1只／組。6．漏斗：1只／組。7．紗布：若干。8．濾紙：若干。9．碾缽：1套／組。10．培養(yǎng)皿：1個(gè)／組。11．100mL量筒：1支／組。12．塑料手套：多雙／組。13．記號(hào)筆：公用。14．綠豆芽：當(dāng)日采摘，50克／組。15.SephadexG-150均為pharmaeia產(chǎn)品。四、實(shí)驗(yàn)試劑1.0.01mol/LHAc一NaAc緩沖液：2.0.2mol/LNaOH溶液3.5.5mmol/LPNPP（對(duì)硝基苯磷酸二鈉）五、操作1．勻漿：戴上手套，將綠豆芽掐去根和葉得綠豆芽莖，稱取50g的綠豆芽莖，在碾缽中用碾錘徹底搗碎，室溫靜置0.5h，在培養(yǎng)皿中用雙層紗布擠濾，得到濾液。2．平衡：將2只100mL燒杯分別放到托盤天平的2只托盤上進(jìn)行平衡。將濾液倒人2支離心管中，再把離心管連同其蓋子分別放入托盤上的2只燒杯中，用滴管增、減離心管中的溶液使其在托盤天平上進(jìn)行平衡，平衡后蓋上離心管的蓋子，用記號(hào)筆做好標(biāo)記。3．離心：4000r／min離心20min。4．保存：將離心管中大部分上清液倒人量筒中，少部分接近沉淀物的上清液經(jīng)濾紙過濾，一并收入量筒中以測量體積，然后倒入三角燒瓶中．做好標(biāo)記，用塑料薄膜密閉，作為“原酶液”在冰箱中保存?zhèn)溆谩?、將原酶液精確等分，一部分在冰箱中保存?zhèn)溆?。另一部分用于?shí)驗(yàn)六的sephadexG-150柱層析。6.酶活力的測定將pNPP溶于0.1mmol/LHAc-NaAc緩沖液中配成5.5mmol/L底物溶液，每lmL底物溶液加入0.2mL酶液，37oC保溫1小時(shí)，再加入4mL0.2mol/LNaOH溶液終止反應(yīng)，混勻后測405nm光吸收值。以先在底物溶液中加入4mL0.2mol/LNaOH溶液后再加入0.2mL酶液作對(duì)照。在此條件下，以每小時(shí)催化釋放1umol對(duì)硝基苯酚的酶量定義為1個(gè)活力單位。五、計(jì)算上清液體積（mL）粗酶液得率（mL）=上清液體積綠豆芽莖質(zhì)量×100%六、注意事項(xiàng)1．使用離心機(jī)前必須將離心管(連同其蓋子)精確平衡。2．離心過程中，若聽到異常響聲，可能是出現(xiàn)了離心管破碎或離心管不平衡等情況，應(yīng)立即切斷電源，停止離心，檢查原因3．在離心機(jī)高速運(yùn)轉(zhuǎn)過程中切勿打開離心機(jī)蓋，以防造成意外事故。4．避免離心機(jī)連續(xù)使用時(shí)間過長，一般使用60min后要隔20~30min再使用。5．有機(jī)溶劑會(huì)腐蝕離心管，酸、堿、鹽溶液會(huì)腐蝕金屬，若發(fā)現(xiàn)滲漏現(xiàn)象應(yīng)及時(shí)擦洗干凈．以免損壞離心機(jī)。思考題1．實(shí)驗(yàn)操作過程中為什么需戴上手套？2．豆芽在碾缽中用碾錘徹底搗碎對(duì)酶液提取起到什么作用?3．離心管中的沉淀物可能是哪些成分？實(shí)驗(yàn)二、酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線的制作一、目的學(xué)會(huì)制作酶促反應(yīng)的進(jìn)程曲線，掌握可見分光光度計(jì)的使用。二、原理要進(jìn)行酶的活力測定，首先要確定酶的反應(yīng)時(shí)間。酶的反應(yīng)時(shí)間并不是任意規(guī)定的，應(yīng)該在初速度范圍內(nèi)進(jìn)行選擇。要求出代表酶促反應(yīng)初速度的時(shí)間范圍就必須制作酶促反應(yīng)的進(jìn)程曲線。所謂進(jìn)程曲線是指酶促反應(yīng)時(shí)間與產(chǎn)物生成量(或底物減少量)之間的關(guān)系曲線。它表明了酶促反應(yīng)隨反應(yīng)時(shí)間變化的情況。本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程曲線是在酶促反應(yīng)的最適條件下采用每間隔一定的時(shí)間測定產(chǎn)物生成量的方法，以酶促反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物生成量為縱坐標(biāo)繪制而成的。從進(jìn)程曲線可以看出，曲線的起始部分在某一段時(shí)間范圍內(nèi)呈直線，其斜率代表酶促反應(yīng)的初速度。但是，隨著反應(yīng)時(shí)問的延長，曲線的斜率不斷下降，說明反應(yīng)速度逐漸降低。反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間的延長而降低這一現(xiàn)象可能是由于底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的增高使逆反應(yīng)加強(qiáng)等原因所致。因此，要真實(shí)反映出酶活力的大小，就應(yīng)該在產(chǎn)物生成量與酶促反應(yīng)時(shí)間成正比的這一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測定。換言之，測定酶活力應(yīng)該在進(jìn)程曲線的初速度時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行。制作進(jìn)程曲線，求出酶促反應(yīng)初速度的時(shí)間范圍是酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)分析中的組成部分和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。三、實(shí)驗(yàn)器材1．VIS-7220型可見分光光度計(jì)2．HH一2型數(shù)顯恒溫水浴鍋3．取樣器：請(qǐng)參見實(shí)驗(yàn)一，5mL、1mL。各1支／組。4．試管：20支／組。5．試管架：1個(gè)／組。四、實(shí)驗(yàn)試劑1．酸性磷酸酯酶酶液：取原酶液用0.2mol／L的pH5．6乙酸鹽緩沖液稀釋10～20倍。2．5mmol／L磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)：精確稱取磷酸苯二鈉(C6H6Na2PO4·2H2O，相對(duì)分子質(zhì)量254.10)2.54g，加蒸餾水溶解后定容至100mL，即配成了100mmol／L磷酸苯二鈉水溶液，密閉保存?zhèn)溆?。?.2mol／L的pH5.6的乙酸鹽緩沖液稀釋20倍，即得5mmol／L磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)。3．0.2mol／L的pH5.6乙酸鹽緩沖液。4．Folin-酚試劑：于2000mL磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100g，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g，水700mL，85％磷酸50mL，濃鹽酸100mL。微火回流10h后加入硫酸鋰150g，蒸餾水50mL和溴數(shù)滴搖勻。煮沸約15min，以驅(qū)逐殘溴，溶液呈黃色，輕微帶綠色；如仍呈綠色，須重復(fù)滴加液體溴的步驟。冷卻后定容到1000mL，過濾，置于棕色瓶中可長期保存，使用前，用蒸餾水稀釋3倍。5．1mol／L碳酸鈉溶液。6．0.4mmol／L酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：精確稱取分析純的酚結(jié)晶0.94g溶于0.1mol／L的HCl溶液中，定容至1000mL，即為酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液，貯存于冰箱可永久保存，此時(shí)的酚濃度約為0.01mol／L。使用前將上述的酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液用蒸餾水稀釋25倍，即得到0.4mmol／L酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。五、操作檢查試管是否干燥、潔凈；若否，將其洗凈并置于干燥箱內(nèi)120℃烘干。1．加樣與酶促反應(yīng)：取試管12支，按0到11的順序逐管編號(hào)，空白為0號(hào)。各管加0.5mL5mmol／L磷酸苯二鈉溶液，在35℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱2min后，在1～11管內(nèi)各加入0.5mL預(yù)熱的酶液。酶液一加入立即精確計(jì)時(shí)井搖勻，按時(shí)間3、5、7、10、12、15、20、25、30、40和50min在35℃恒溫下進(jìn)行定時(shí)酶促反應(yīng)(酶液加入時(shí)為起始時(shí)間，碳酸鈉溶液加人時(shí)為終止時(shí)間)，參見圖8—2一4。當(dāng)酶促反應(yīng)進(jìn)行到上述相應(yīng)的時(shí)間時(shí)，加入1mol/L碳酸鈉溶液5mL終止反應(yīng)，時(shí)間控制詳見表。管號(hào)1234567891011109876543210酶液加入時(shí)刻（min11號(hào)試管最先加樣）1314151718202428324150碳酸鈉加入時(shí)刻（min）2．顯色：加完1mol／L碳酸鈉溶液5rnL后再向試管中加入0.5mLFolin一酚稀溶液，混勻，保溫約10min即可顯色?？瞻坠芩釉噭┫嗤?，但酶液最后加入。3．測定：冷卻后以0號(hào)管作空白，在可見光分光光度計(jì)上680nnl波長處測定各管的吸光度A680。酶促反應(yīng)操作安排管號(hào)123456789101105mmol/L磷酸苯二鈉溶液各0.5ml酶液（35℃預(yù)熱過的）各0.5ml，一加入就計(jì)時(shí)，注意合理安排各管的加入時(shí)間，最好先加第11管，隔1min再加第10管（詳見表8-2-1）35℃精確反應(yīng)時(shí)間（min）35710121520253040501mol/L碳酸鈉溶液各5mL（用于終止反應(yīng)）Folin-酚稀溶液各0.5mL0號(hào)試管加入酶液0.5mL35℃保溫顯色10min以上A68004．畫圖：以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，A680為縱坐標(biāo)繪制進(jìn)程曲線，并將其貼在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，由進(jìn)程曲線求出酸性磷酸酯酶反應(yīng)初速度的時(shí)間范圍(直線部分涵蓋的時(shí)間)。5．清潔：將用過的玻璃儀器和取樣器套頭洗凈，清潔分光光度計(jì)(尤其是比色槽內(nèi))、清洗比色皿，整理好桌面上的儀器和試劑，并注意清潔自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)報(bào)告當(dāng)場交給老師。六、計(jì)算試管1234567891011A680初速度的時(shí)間范圍：0～min七、注意事項(xiàng)1．酶促反應(yīng)應(yīng)保持溫和條件，反應(yīng)液要避免劇烈攪拌或震蕩。2．實(shí)驗(yàn)前要設(shè)計(jì)好每支試管的加樣順序，確保反應(yīng)時(shí)間的準(zhǔn)確性。3．酶促反應(yīng)的加樣順序不得搞錯(cuò)，否則無法顯色。思考題1．隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，曲線的斜率不斷下降，說明反應(yīng)速度逐漸降低，這是為什么？2．如果酶促反應(yīng)在一個(gè)較大的體系中，如在燒杯中進(jìn)行，每隔一定的時(shí)間從燒杯中取樣測定該體系中產(chǎn)物的生成量，并繪制酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線，該方法和本書采用的方法結(jié)果會(huì)一致嗎?哪個(gè)更好一些？實(shí)驗(yàn)三、酸性磷酸酯酶的酶活力測定一、目的通過對(duì)酶促反應(yīng)速度的測定，計(jì)算出酶的活力，掌握可見分光光度計(jì)的使用。二、原理請(qǐng)參見實(shí)驗(yàn)一三、實(shí)驗(yàn)器材請(qǐng)參見實(shí)驗(yàn)二四、實(shí)驗(yàn)試劑請(qǐng)參見實(shí)驗(yàn)二五、操作檢查試管內(nèi)是否干燥、潔凈；若否，將其洗凈并置于干燥箱內(nèi)120℃烘干。1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取試管6支，按0到5的順序逐管編號(hào)，空白為0號(hào)。按照表8—3—1，向各試管中依次加入0.4mmol／L酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、0.2mol／L的pH5.6的乙酸鹽緩沖液、1mol／L碳酸鈉溶液和Folin一酚試劑，注意加樣順序不得搞錯(cuò)，否則顯不了色。搖勻，在35℃保溫10min以上(先用燒杯盛35℃的水，置于水浴鍋中，再將試管放人燒杯中保溫，以防試管滑落人水中)，參見實(shí)驗(yàn)八(2)的圖8—2—4。以0號(hào)試管為空白，在可見光分光光度計(jì)上680nm波長處讀取各管的吸光度A680，以A680為橫坐標(biāo)、酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的毫升數(shù)為縱坐標(biāo)作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，它應(yīng)該是一條直線。保留該數(shù)據(jù)，以便實(shí)驗(yàn)八(4)直接引用。以上操作總結(jié)為表標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試管1234500.4mmol/L酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.10.20.30.40.500.2mol/LpH5.6的乙酸鹽緩沖液（mL）0.90.80.70.60.511mol/L碳酸鈉溶液（mL）5Folin-酚試劑（mL)0.5搖勻，在35℃保溫顯色10min以上A68002．酶活力的測定取2支試管，編號(hào)1’,0’，將0’號(hào)試管作為空白。在2支試管中備加人0.5mL的5mmol／L磷酸苯二鈉溶液，35℃預(yù)熱2min，再向1’號(hào)試管中加人35℃預(yù)熱過的酶液0.5mL，立即計(jì)時(shí)，搖勻，35℃精確反應(yīng)10min(酶液加入時(shí)為起始時(shí)間，碳酸鈉溶液加入時(shí)為終止時(shí)間后立即向2支試管中各加入1mol／L碳酸鈉溶液5mL，再各加人Folin-酚稀溶液0.5mL，混勻，最后向0’號(hào)試管中加入酶液0.5mL，2支試管搖勻后在35℃保溫顯色約10min以上，將0’號(hào)試管作為空白，用可見光分光光度計(jì)測1導(dǎo)試管在680nm處的光吸收值A(chǔ)680，以上詳細(xì)的加樣順序和操作見表，注意加樣順序不得搞錯(cuò)，否則顯不了色。管號(hào)1’0’5mmol/L磷酸苯二鈉溶液（mL）0.50.535℃預(yù)熱2min酶液（35℃預(yù)熱過的）（mL），一加入就計(jì)時(shí)0.50搖勻，35℃精確反應(yīng)10min后立即加入1mol/L碳酸鈉溶液5mL（終止反應(yīng)用）Folin-酚稀溶液（mL）0.50.50’號(hào)試管加入酶液0.5mL搖勻，35℃保溫顯色10min以上A6800酶活力測定3．酶活力的計(jì)算酶活力單位的定義為：在酶促反應(yīng)的最適條件下每分鐘生成1微摩爾(μmol)產(chǎn)物所需要的酶量規(guī)定為一個(gè)活力單位。用1號(hào)試管的A680在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對(duì)應(yīng)的酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的毫升數(shù)V，根據(jù)公式：2×0.4×V×1000/10可計(jì)算出lmL酶液中所含有的酶的活力。4．清潔將用過的玻璃儀器和取樣器套頭洗凈，清潔分光光度計(jì)(尤其是比色槽內(nèi))、清洗比色皿，整理好桌面上的儀器和試劑，并注意清潔自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)報(bào)告當(dāng)場交給老師。六、計(jì)算試管00’123451’A68000V（mL）1mL酶液的活力（U）七、注意事項(xiàng)參見實(shí)驗(yàn)二的注意事項(xiàng)。思考題1．用Folin-酚法測定產(chǎn)物酚或用定磷法測定無機(jī)磷都可以用來測定酸性磷酸酯酶的活力，你認(rèn)為哪種方法的適應(yīng)面更廣?2．測定酶活力為什么要在進(jìn)程曲線的初速度時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行?3．空白管中為什么最后才加酶液?你還可以設(shè)計(jì)出另一種空白管嗎?實(shí)驗(yàn)四凝膠層析法純化酸性磷酸酯酶一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆漳z過濾層析測定原理和實(shí)驗(yàn)方法，掌握凝膠過濾柱的使用以及葡聚糖凝膠G-150的使用及保存。二．實(shí)驗(yàn)原理（一）凝膠過濾層析原理凝膠過濾（gelfiltration），又稱為凝膠層析（gelchromatography）、分子篩過濾（molecularsievefiltration）、凝膠滲透層析（gelosmoticchromatography）等。它是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種層析技術(shù)。其基本原理是利用被分離物質(zhì)分子大小不同及固定相（凝膠）具有分子篩的特點(diǎn)，將被分離物質(zhì)各成分按分子大小分開，達(dá)到分離的方法。凝膠是由膠體粒子構(gòu)成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)眼里吸滿水后凝膠膨脹呈柔軟而富于彈性的半固體狀態(tài)。人工合成的凝膠網(wǎng)眼較均勻地分布在凝膠顆粒上有如篩眼，小于篩眼的物質(zhì)分子均可通過，大于篩眼的物質(zhì)分子則不能，故稱為“分子篩”。凝膠之所以能將不同分子的物質(zhì)分開是因?yàn)楫?dāng)被分離物質(zhì)的各成分通過凝膠時(shí)，小于篩眼的分子將完全滲入凝膠網(wǎng)眼，并隨著流動(dòng)相的移動(dòng)沿凝膠網(wǎng)眼孔道移動(dòng)，從一個(gè)顆粒的網(wǎng)眼流出，又進(jìn)入另一顆粒的網(wǎng)眼，如此連續(xù)下去，直到流過整個(gè)凝膠柱為止，因而流程長、阻力大、流速慢；大于篩眼的分子則完全被篩眼排阻而不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)眼，只能隨流動(dòng)相沿凝膠顆粒的間隙流動(dòng)，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出層析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能進(jìn)入或完全滲入凝膠篩眼之間的物質(zhì)分子，則居中流出。這樣被分離物質(zhì)即被按分子的大小分開。見下圖：用于凝膠層析的凝膠均為人工合成的產(chǎn)品，主要有交聯(lián)葡聚糖（商品名為Sephadex）、瓊脂糖（商品名為Sepharose）、聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio–gel）及具有一定網(wǎng)眼的細(xì)玻璃珠等和這些凝膠的衍生物。下面主要介紹葡聚糖凝膠，這是由葡萄糖的多聚物與1–氯–2、3–環(huán)氧丙烷交連而成。環(huán)氧丙烷引入丙三醇基將鏈狀的多聚葡萄糖單位交聯(lián)起來，凝膠網(wǎng)眼的大小由多聚葡萄糖的分子和環(huán)氧丙烷的比例（交聯(lián)度）來控制。葡聚糖具有較強(qiáng)的親水性，在水和電解質(zhì)溶液中膨脹成為柔軟而富于彈性的凝膠，其吸水能力與葡聚糖凝膠的交聯(lián)度有密切關(guān)系。交聯(lián)度大的，孔徑小，吸水少，膨脹的程度?。唤宦?lián)度小的，孔徑大，吸水多，膨脹的程度大。因此，葡聚糖凝膠孔徑的大小可以其吸水量的大小來表示，常以G–10至G–200號(hào)碼標(biāo)記。G后面的數(shù)字是其吸水量（毫升水/克干膠）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量為2.5ml/2干膠。市售有G–10、G–5、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型號(hào)。G–75以上的膠因吸水量大，膨脹后形態(tài)柔軟易變，統(tǒng)稱為軟膠。G–75以下的稱為硬膠。葡聚糖凝膠可分離的分子大小從幾百到數(shù)十萬?？筛鶕?jù)被分離物質(zhì)的分子大小及目的選擇使用。一般說SephadexG–l0～15通常用于分離肽及“脫鹽”。SephadexG–75～200用以分離各類蛋白質(zhì)。凝膠層析是一種物理分離法。葡聚糖凝膠基本上不帶電荷呈多惰性，不與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，所以分離的效果較好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羥基，能吸附少量蛋白質(zhì)等被分離的物質(zhì)。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，一般使用含有離子強(qiáng)度達(dá)0.08的NaCl等中性鹽緩沖液作洗脫液。（二）層析操作（1）凝膠溶脹（水化）商品葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠均為干燥顆粒。使用前必須水化溶脹。商品瓊脂糖凝膠呈懸浮膠體可直接用，玻璃球不用溶脹。凝膠溶脹有兩種方法：一種是將所需葡聚糖凝膠浸入蒸餾水中于室溫下溶脹；另一種是置于沸水浴中溶脹。各種葡聚糖在上述溶脹方法中所需的時(shí)間見下表：必須浸泡足夠的時(shí)間以使凝膠充分溶脹。兩種方法中，沸水浴溶脹不但節(jié)省時(shí)間，還可以殺滅凝膠中污染的細(xì)菌并排出網(wǎng)眼中氣體。凝膠溶脹后，需用蒸餾水洗滌幾次，每次應(yīng)將沉降緩慢的細(xì)小顆粒隨水傾倒出去，以免在裝柱后產(chǎn)生阻塞現(xiàn)象，降低流速。洗后將凝膠浸泡在洗脫液中待用。一支層析柱中應(yīng)該裝入的干膠量可以用下法推算：稱取1g所需型號(hào)的葡聚糖干膠，放在5ml量筒中，用室溫溶脹的方法充分溶脹，觀察溶脹后凝膠的體積。然后在層析柱中加水到所需柱床高度，將水倒出，量取柱床體積。根據(jù)1g干膠溶脹后的體積和所需柱床體積，即可推算出干膠的需要量。（2）裝柱將層析劑裝入柱中進(jìn)行層析的方法稱柱層析法。作層析用的柱子稱層析柱。層析柱有玻璃和透明塑料的兩種。柱子的一端為進(jìn)口，另一端為出口，出口端底部有燒結(jié)玻璃砂板或尼龍布，能阻止層析劑流出，溶劑則可流過。如果沒有市售的層析柱，可以選用粗細(xì)均勻，長短合適的玻璃管，在兩端塞上合適的膠塞，膠塞中插人細(xì)玻璃管，在一端放一層尼龍布為出口，即可作為層析柱使用。層析柱的長短粗細(xì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的而定，一般說來，凝膠層析時(shí)柱越長，分離效果越好。但柱過長，層析時(shí)間長，樣品易稀釋造成擴(kuò)散，反而影響分離效果。柱的內(nèi)徑不宜較細(xì)，直徑1cm以下的柱易發(fā)生“管壁效應(yīng)”，即柱中部分的物質(zhì)組分移動(dòng)較快，管壁周圍的則移動(dòng)較慢，造成分離混亂。當(dāng)然柱的內(nèi)徑也不宜過粗。凝膠層析中，在把小分子物質(zhì)（mw<1500），如無機(jī)或其他物質(zhì)與大分子物質(zhì)（mw<20000）分離時(shí)，層析柱的體積一般約為樣品的4–10倍，高度與直徑的比例為5：1至15：1之間。這類柱也稱為“脫鹽”柱，常用網(wǎng)孔很小的凝膠如G–25。用以將生物大分子物質(zhì)彼此分開的分級(jí)層析柱，體積應(yīng)為樣品體積的25～100倍。柱長度與直徑的比例為20：1～100：1。裝柱的操作過程如下：將層析柱垂直固定在支架上，打開柱下口開關(guān)。將溶脹好的凝膠放在燒杯中，使凝膠表面上的水層與凝膠體積相等。用玻璃棒攪勻凝膠液，順玻璃棒灌入柱內(nèi)。此時(shí)柱下口一邊排水，上口一邊加入攪勻的凝膠，可見凝膠連續(xù)均勻地沉降，逐步形成凝膠柱。當(dāng)?shù)竭_(dá)所需凝膠柱高度時(shí)，立即關(guān)閉下口，待凝膠自然沉降形成凝膠柱床。凝膠柱床一般應(yīng)離柱頂3~5cm，并覆蓋一層溶液。灌注凝膠時(shí)要求將均勻的凝膠一直加到所需柱床高度，不能時(shí)斷時(shí)續(xù)，否則將出現(xiàn)分層或“紋路”等毛病。若中途出現(xiàn)這些現(xiàn)象，可以用玻璃棒將已形成的柱床逐步攪起，直至出毛病的部分再讓凝膠重新沉降或繼續(xù)加入攪勻的凝膠懸液。若在灌好膠后才發(fā)現(xiàn)“紋路”、分層等現(xiàn)象時(shí)，要重新裝柱，以免影響層析效果。在做大型的凝膠柱時(shí)，灌注的凝膠是否均勻往往從表面上看不出來。所以使用前應(yīng)該用一些帶色的大分子物質(zhì)如細(xì)胞色素C、血紅蛋白或?qū)Ｓ玫乃{(lán)色葡聚糖–2000（Bluedextran–2000）通過凝膠柱，觀察形成的色斑帶是否整齊，若斑帶歪斜，應(yīng)該重新裝柱，直至達(dá)到要求。剛從冰箱中取出的凝膠液，不能馬上用來灌柱，應(yīng)平衡至室溫后再用，不然裝好的凝膠會(huì)產(chǎn)生大量的氣泡影響層析。在整個(gè)灌注凝膠的過程及使用中，凝膠柱面上一定要覆蓋著一層溶液，以免進(jìn)入空氣。若進(jìn)空氣再加入溶液時(shí)，凝膠柱中易形成氣泡。（3）平衡裝好的凝膠柱，使用前應(yīng)該用相當(dāng)于柱床體積兩倍或更多的洗脫液流過凝膠柱，以壓實(shí)凝膠，稱為平衡。（4）上樣將樣品加入到凝膠柱中，準(zhǔn)備層析的過程稱上樣。上樣時(shí)，應(yīng)該注意上樣量的多少、樣品的黏稠度及離子強(qiáng)度。這三個(gè)因素會(huì)影響到以后層析的效果。一般來說“脫鹽”層析時(shí)，上樣體積可為柱體積的10%～25%；生物大分子的分級(jí)分離，約為柱體積的1%～5%。樣品的黏稠度一般不宜大于洗脫液黏稠度的2倍以上，不然洗脫峰會(huì)變寬和歪斜。離子強(qiáng)度要達(dá)到0.08，以免產(chǎn)生特異性吸附。上樣操作：先打開層析柱的下口開關(guān)，放出凝膠柱面上的溶液，或用皮頭吸管吸取，使液面與凝膠表面相平齊，但切忌液面低于凝膠表面。然后將樣品加在凝膠表面，打開柱下口開關(guān)，控制流速，使樣品慢慢滲入凝膠內(nèi)。加樣時(shí)注意勿將凝膠柱面沖起形成凹面，也不能沿管壁流下，以免樣品沿柱壁與凝膠柱的間凝膠隙漏下。當(dāng)慢慢滲入凝膠的樣品液液面與凝膠柱面相平時(shí)，關(guān)閉下口，完成上樣。然后在凝膠柱面上加一層（3～5cm）洗脫液，接上洗脫瓶準(zhǔn)備洗脫。（5）洗脫用規(guī)定的溶液流過樣品，使分子量不同的樣品逐步分開并先后由柱床流出的過程稱為洗脫。所用溶液稱洗脫液。洗脫液放在貯液瓶（洗脫瓶）中并與層析柱相通連。洗脫時(shí)只要打開層析柱下口開關(guān)，洗脫液即可流出。洗脫過程中保持恒定的流速是柱層析獲得良好分離效果的重要條件。因?yàn)槟z層析的分離作用主要取決于分子擴(kuò)散進(jìn)入凝膠的機(jī)會(huì)，流速過快有些分子來不及在分子篩中分配而流出；過慢時(shí)已分離的分子會(huì)因擴(kuò)散而混合。因而要保持適當(dāng)?shù)暮愣魉?。洗脫液的流速取決于它的靜水壓。靜水壓是指洗脫瓶中洗脫液的液面高出于層析柱出口產(chǎn)生的液體壓力（或接觸空氣的兩個(gè)液面間的高差），這個(gè)高度差越大，靜水壓越大，洗脫液的流速就越快。這個(gè)壓力差可以調(diào)動(dòng)，如提高洗脫瓶的位置或瓶中液面的增減；或者降低或提高層析柱出口的位置等，因此靜水壓又稱操作壓。由于靜水壓越大，洗脫液的流速就越快。在固定洗脫瓶與出口位置的情況下，靜水壓會(huì)在洗脫過程中，隨著洗脫瓶中溶液減少液面不斷下降而減少，難以維持流速的恒定。為了解決這個(gè)問題，Marriotte首次將洗脫瓶加塞塞緊，塞中插入玻璃管，使玻管下口深入到洗脫液的底部，這樣洗脫液的靜水壓便等于此玻管下口的液面高出層析柱出口液面的高度（因?yàn)楫?dāng)洗脫瓶液體流出時(shí)，瓶頂形成真空，空氣只從玻璃管中進(jìn)入，玻管下口即為接觸空氣點(diǎn)），因此只要溶液不低于玻璃管下口，玻璃管口以上溶液的增減將不影響靜水壓，從而自動(dòng)保持了流速的恒定，此洗脫瓶稱為恒壓瓶，也叫馬氏瓶。當(dāng)然，當(dāng)洗脫液減少至液面低于玻管的下口時(shí)，便會(huì)失去作用，但這時(shí)可用及時(shí)加入洗脫液來解決。在凝膠層析中，不僅要保持靜水壓的恒定，還要保持適當(dāng)?shù)撵o水壓。這是因?yàn)镚–75以上的軟膠膠體柔軟易變形，對(duì)靜水壓僅有一定的承受能力，不同軟膠的承受能力也不相同，靜水壓超過凝膠的承受能力時(shí)，最初流速會(huì)很快；其后隨著靜水壓力過大將使軟膠變形壓緊，流速逐漸降低，最后甚至流不出。所以，保持恒定正確的靜水壓是凝膠層析時(shí)獲得滿意結(jié)果的必要條件。脫鹽一般使用的是G–25屬于硬膠，硬膠不易變形，受靜水壓的影響較小，實(shí)驗(yàn)過程中的流速可用恒壓瓶下口橡皮管上的螺旋夾控制在0.5ml/min左右，隨著洗脫液的流出，樣品逐步被分開。用試管收集洗脫液，按順序每管收集2ml。（6）檢測在收集的同時(shí)，檢查蛋白質(zhì)是否流出。以光密度值為縱坐標(biāo)，以收集管的順序號(hào)為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪圖?？色@具有一條洗脫峰的曲線，稱為洗脫曲線，用以表示被分離物質(zhì)流出的狀態(tài)。（7）凝膠的洗滌及保存由于凝膠對(duì)被分離的物質(zhì)基本無吸附作用，所以無需“再生”，只要用洗脫液沖洗后即可連續(xù)使用。但因多次使用凝膠顆粒將逐漸沉積壓緊，流速將減慢，所以使用一段時(shí)間后應(yīng)倒出來，清洗后重新裝柱。凝膠暫時(shí)不使用可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室溫保存應(yīng)加入0.02%疊氮鈉（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐劑，以防發(fā)霉。用時(shí)以水洗去防腐劑即可使用。凝膠長期不用，可用水洗凈，分次加入百分濃度遞增的乙醇溶液，每次停留一段時(shí)間，使之平衡，再換一下濃度的乙醇，讓凝膠逐步脫水，再用乙醚除乙醇，抽干即可，或?qū)⒛z洗凈后抽干，在表面皿上30℃逐步烘干。三．試劑與器材１、凝膠過濾柱（1.0*60cm）２、層析柜３、紫外檢測儀４、恒流泵５、餾分自動(dòng)收集器６、記錄儀７、葡聚糖凝膠G-150四．實(shí)驗(yàn)步驟取SephadexG-15025g于500ml水中，煮沸5小時(shí)，得到溶脹完全的凝膠。取30cm的層析柱，垂直固定在支架上，關(guān)閉下端出口。將已經(jīng)溶脹好的SephadexG-150中的水傾倒出去，加入2倍體積的0.01mol/L，pH5.0的醋酸緩沖液，并攪拌成懸浮液，然后灌注入柱，打開柱的下端出口，繼續(xù)加入攪勻的SephadexG-150，使凝膠自然沉降，關(guān)閉出口。待凝膠柱形成后，在洗脫瓶中加入0.01mol/L，pH5.0的醋酸緩沖液以3倍柱體積的醋酸鹽緩沖流過凝膠柱，以平衡凝膠。凝膠平衡后，用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液，將粗酶液樣品1.5ml（濃度盡量大一點(diǎn)，可用反相透析法濃縮酶液，加樣量約為柱體積的2%~5%）加到凝膠柱表面，打開柱下口，控制流速讓樣品溶液慢慢浸入凝膠內(nèi)。凝膠柱面上加一層的0.01mol/L，pH5.0的醋酸鹽緩沖液，并用此緩沖液洗脫，控制流速為0.5ml/min左右。用試管收集洗脫液，每管3ml。在開始收集洗脫液的同時(shí)檢查蛋白質(zhì)是否已開始流出。當(dāng)檢測器和記錄儀中的數(shù)值開始變化時(shí)用記號(hào)筆標(biāo)記管號(hào)。當(dāng)數(shù)值重新恢復(fù)到“0”值時(shí)層析結(jié)束。整理記錄儀上的記錄紙，進(jìn)而確定含有目的酸性磷酸酶的試管。收集試管，重復(fù)【實(shí)驗(yàn)三酸性磷酸酯酶的酶活力測定】，確定各管酶活力的變化，繪制酶活曲線。同時(shí)將記錄紙上的曲線繪制到實(shí)驗(yàn)報(bào)告之上，即為蛋白曲線。將具有酶活力的試管合并，用考馬斯亮藍(lán)法檢測其中的蛋白含量，同時(shí)測量酶活力，得出單位質(zhì)量的酶活。與粗酶液比較純化前后單位質(zhì)量的酶催化活性的變化。五．注意事項(xiàng)①裝柱后，凝膠要始終處于緩沖液浸泡中，液面不能低于凝膠。加樣時(shí)尤其要注意。②保持凝膠表面水平，沒有凹陷或凸起。洗脫液必須沿凝膠柱管壁流到液面，不能滴到液面上，防止凝膠變形。③由于凝膠對(duì)被分離的物質(zhì)基本無吸附作用，所以無需“再生”，只要用洗脫液沖洗后即可連續(xù)使用。但因多次使用凝膠顆粒將逐漸沉積壓緊，流速將減慢，所以使用一段時(shí)間后應(yīng)倒出來，清洗后重新裝柱。六．思考題①畫出層析裝置的連接示意圖。②常用于凝膠層析的凝膠都有哪些？③查找資料，闡述一下層析的分類。實(shí)驗(yàn)五考馬斯（Comessie)亮蘭結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度一．目的掌握考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白含量的方法。二．原理考馬斯亮蘭能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性，考馬斯亮蘭G-250的最大光吸收峰在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm?？捡R斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)定量測定的高敏性度。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈青色。在595nm下，光密度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。故可以用于蛋白質(zhì)含量的測定。優(yōu)缺點(diǎn)：(—)操作簡便、快速；檢測靈敏；重復(fù)性好。(二)顯色迅速。約于2分鐘內(nèi)完成染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合。所現(xiàn)顏色至少在l小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。(三)與改良Lowry氏法相比，干擾物質(zhì)較少。(四)當(dāng)樣品中存在較大量的十二烷磺酸鈉(SDS)、TritonX-100等去垢劑時(shí)，顯色反應(yīng)會(huì)受到干擾。如樣品緩沖液呈強(qiáng)堿性時(shí)也會(huì)影響顯色，故必須預(yù)先處理樣品。(五)考馬斯亮蘭G250染液不宜久存，以1-2月為宜。(六)微量法測定蛋白含量范圍為1-10μg；常量法測以檢測范圍10-100／μg為宜。三．器材(一)試管l0支(二)吸管10ml、l5ml、lml、O.1ml各1支。（三）721分光光度法，普通比色杯4只。四．試劑(一)O.9％NaCl(二)待測粗酶液和層析后酶液(三)標(biāo)準(zhǔn)蛋白(四)染液：考馬斯亮蘭G2500.1克溶于0.5m195%乙醇。再加入100m185％(W／V)磷酸。然后加蒸餾水定容到1000ml。[此時(shí)溶液為0.0l％考馬斯亮蘭G250／4.7％(W／V)／乙醇／8.5%(W／V)磷酸]。五．操作(常量法)(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：配制lmg／ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。制備系列稀釋液，其濃度分別為1000μg／ml，500μg／ml，250μg／ml，125μg／ml，62.5μg／ml和31.25μg／ml。按下表操作：搖勻，室溫靜置3分鐘。在第一管為對(duì)照管，在721型分光光度計(jì)于波長595nm處比色-讀取光密度。以各管光密度為縱座標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度(μg／ml)作為橫座標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。(二)未知樣品測定：取樣品稀釋不同倍數(shù)，分別測量吸光度，最后選擇落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的稀釋倍數(shù)進(jìn)行計(jì)算。取試管二只，按下表操作：搖勻，靜置3分鐘，在721型分光光度計(jì)亡波長595nm比色，讀取光密度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得稀釋樣品蛋白質(zhì)濃度?！居?jì)算】未知樣品蛋白質(zhì)濃度μg／ml＝稀釋樣品濃度×稀釋倍數(shù)實(shí)驗(yàn)六酸性磷酸酯酶米氏常數(shù)的測定一、目的掌握米氏常數(shù)(Km)及最大反應(yīng)速度(Vm)的測定原理和實(shí)驗(yàn)方法，掌握可見分光光度計(jì)的使用。二、原理請(qǐng)參見實(shí)驗(yàn)一根據(jù)酶與底物形成中間配合物的學(xué)說，可以得到一個(gè)表示酶促反應(yīng)速度與底物濃度之間相互關(guān)系的方程式，這就是酶學(xué)上著名的米氏方程：式中。[S]為底物濃度，v為反應(yīng)速度，Vm為最大反應(yīng)速度，Km為米氏常數(shù)。由米氏方程可以推出，米氏常數(shù)Km等于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，米氏常數(shù)的單位就是濃度單位(mol／L或mmol／L)。測定Km和Vm，特別是測定Km，是酶學(xué)工作的基本內(nèi)容之一。在酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的分析中，米氏常數(shù)Km是酶的一個(gè)基本特性常數(shù)，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。特別是同一種酶能夠作用于幾種不同的底物時(shí)，米氏常數(shù)Km往往可以反映出酶與各種底物的親和力強(qiáng)弱，Km數(shù)值越大，說明酶與底物的親和力越弱；反之，Km值越小，說明酶與底物的親和力越強(qiáng)，Km值最小的底物就是酶的最適底物。測定Km和Vm，一般通過作圖法求得。作圖方法很多，其共同特點(diǎn)是先將米氏方程式變換成直線方程，然后通過作圖法求得。本實(shí)驗(yàn)在測定酸性磷酸酯酶以磷酸苯二鈉為底物的Km和Vm時(shí)，采用最常用的雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk作圖法)。這個(gè)方法是先將米氏方程兩邊同時(shí)取倒數(shù)，整理后得到：然后以1/v對(duì)1/[S]作圖，可得到一條直線。這條直線在橫軸上的截距為1/Km，在縱軸上的截距為1/Vm，由此即可求得Km和Vm三、實(shí)驗(yàn)器材請(qǐng)參見實(shí)驗(yàn)二四、實(shí)驗(yàn)試劑請(qǐng)參見實(shí)驗(yàn)二五、操作檢查試管內(nèi)是否干燥、潔凈；若否，將其洗凈并置于干燥箱內(nèi)120~C烘干。1、酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作做過實(shí)驗(yàn)三的同學(xué)此步可免，直接應(yīng)用上次的酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。未做過實(shí)驗(yàn)三的同學(xué)，請(qǐng)按實(shí)驗(yàn)三中“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作”的操作，先制作酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，保留該數(shù)據(jù)，以便實(shí)驗(yàn)四直接引用。2、底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響一一Km和Vm的測定參見表取試管7支，按照0至6的順序逐管編號(hào)，空白管為0號(hào)。1～6號(hào)管加入不同體積的5mmol／L磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)，并分別補(bǔ)充0.2mol／L的pH5．6乙酸鹽緩沖液至0.5mL。35℃預(yù)熱2min(先用燒杯盛35℃的水，置于水浴鍋中，再將試管放入燒杯中保溫，以防試管滑落水中,逐管加入35℃預(yù)熱過的酸性磷酸酯酶酶液0.5mL，開始計(jì)時(shí)，搖勻，精確反應(yīng)10min(酶液加入時(shí)為起始時(shí)間，碳酸鈉溶液加入時(shí)為終止時(shí)間)。反應(yīng)時(shí)間到達(dá)后立即加入5mL1mol／L碳酸鈉溶液，再加0.5mLFolin酚稀溶液，搖勻，35℃保溫顯色約10min。0號(hào)管內(nèi)先加入0.5mL5mmol／L磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)，再加入5mLlmol／L碳酸鈉溶液和0.5mLFolin-酚稀溶液，最后加入0.5mL酶液，其他操作與1～6號(hào)管相同。冷卻后以0號(hào)管作空白，在VIS一7220型可見分光光度計(jì)680nm波長處讀取各管的吸光度A680。Km和Vm的測定管號(hào)12345605mmol／L磷酸苯二鈉溶液（mL）0.10.140.20.250.330.50.50.2mol／L的pH5．6乙酸鹽緩沖液（mL）0.40.360.30.250.170035℃預(yù)熱2min左右35℃預(yù)熱過的酶液（mL）（加入就計(jì)時(shí)，即起始時(shí)刻）0.50.50.50.50.50.5暫不加搖勻，在35℃的條件下，精確反應(yīng)10min（注意合理安排各試管的酶液加入時(shí)間，也就是反應(yīng)的起始時(shí)間，最好間隔1min）各管內(nèi)均加入1mol／L碳酸鈉溶液5mL（用于終止反應(yīng)）各管內(nèi)均加入Folin-酚稀溶液0.5mL，搖勻向0號(hào)管加入酶液0.5mL搖勻，所有試管在35℃保溫顯色10min以上A6800用各管的A680在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對(duì)應(yīng)的酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的毫升數(shù)V，則產(chǎn)物的濃度為0.4×V(mmol／L)，這樣，各種底物濃度下的速度v=0.4×V／10(mmol／(L·mL·min))，取相應(yīng)的倒數(shù)，填表8-4-2內(nèi)。以l/v為縱坐標(biāo)，1/[S]為橫坐標(biāo)作圖，求出Km和Vm。3、將用過的玻璃儀器和取樣器套頭洗凈，清潔分光光度計(jì)(尤其是比色槽內(nèi))、清洗比色皿，整理好桌面上的儀器和試劑，井注意清潔自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)報(bào)告當(dāng)場交給老師。六、計(jì)算記錄與計(jì)算匯總管號(hào)123456A680V（mL）磷酸苯二鈉濃度（mmol/L)0.50.71.01.251.652.51/[S]2.01.421.00.80.60.4反應(yīng)時(shí)間（min）101010101010反應(yīng)速度v（mmol·mL·min1/vKnVn七、注意事項(xiàng)參見實(shí)驗(yàn)二之注意事項(xiàng)。思考題1．為什么要用雙倒數(shù)作圖法而不是直接用米氏曲線來求米氏常數(shù)?2．還有其他作圖法可以準(zhǔn)確求出米氏常數(shù)嗎?試用本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，通過兩種作圖法來求米氏常數(shù)，并比較差異。實(shí)驗(yàn)七、酸性磷酸酯酶的檢測——SDS電泳法一、目的熟悉垂直板型電泳槽的使用，了解SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量以及檢測樣品中蛋白質(zhì)組分的一般原理，掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作方法。二、原理聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N，N一亞甲基雙丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，簡稱Bis)在加速劑N，N，N’，N’四甲基乙二胺(N，N，N’，N’tetramethylethylenediamine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(anmoniumpersulfate(NH4)2S208，簡稱AP)或核黃素(ribofavin即vitaminB2)的作用下集合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(pelyacrylamidegeIelectrephoresls，簡稱PAGE)。用普通凝膠電泳分離大分子物質(zhì)，主要依賴于各大分子所帶電荷的多少、相對(duì)分子質(zhì)量的大小及其分子的形狀等差異。而要利用凝膠電泳測定大分子的相對(duì)分子質(zhì)量，就必須將大分子所帶電荷和分子形狀的差異所引起的效應(yīng)去掉或?qū)⑵錅p少到可以忽略不計(jì)的程度，從而使大分子的遷移率完全取決于它的相對(duì)分子質(zhì)量。為了達(dá)到上述目的，目前較常用的方法是在電泳體系中加入一定濃度的十二烷基磺酸鈉(Sodiumdedecylsufate，SDS)。SDS是一種陰離子表面活性劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子的氫鍵和疏水鍵，使蛋白質(zhì)變性為松散的線狀，在強(qiáng)還原劑β一巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)的存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被打開并解聚成組成它們的多肽鏈，解聚后的蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物。蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物所帶的SDS負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這就消除了不同種類蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異，而且此復(fù)合物在水溶液中的形狀像一個(gè)長橢圓棒，它的短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基SDS復(fù)合物基本上是相同的，約為180A(1.8×10-8m)，但長軸的長度則與蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子質(zhì)量的大小成正比，因此