《利用鹵蟲無節(jié)幼蟲對納米塑料進行水生毒性評估技術指南》編制說明

《利用鹵蟲無節(jié)幼蟲對納米塑料進行水生毒性評估技術指

南》編制說明

一、標準制定的必要性

隨著污染防治攻堅戰(zhàn)深入推進，具有長期、隱形高風險的新污染物

（ContaminantsofEmergingConcern，CECs）成為了制約當前環(huán)境質量持續(xù)改善

的新問題和新挑戰(zhàn)。2022年5月初，國務院辦公廳印發(fā)《新污染物治理行動方案》

及國家發(fā)展改革委《“十四五”塑料污染治理行動方案》強調重視完善新污染物

治理體系，進一步加強微塑料污染物全鏈條治理。水環(huán)境中的CECs來源復雜，

種類繁多，地球化學行為獨特，具有生物毒性、環(huán)境持久性和生物累積性等特征，

對生態(tài)系統(tǒng)和人體健康構成潛在威脅，生態(tài)環(huán)境風險高，是國際關注的重大環(huán)境

問題之一，也是當前亟待妥善解決的突出環(huán)境問題。環(huán)境基準是制定環(huán)境標準的

科學依據(jù)，是生態(tài)環(huán)境質量評估和風險管控的科學基礎，是多學科交叉和國際科

學前沿領域。但CECs水質基準領域仍存在很大的認知空白，已成為CECs環(huán)境標

準制修訂和環(huán)境保護工作的瓶頸，亟需開展研究，促進環(huán)境地球科學發(fā)展，為清

潔美麗中國和健康中國建設提供有力的科技支撐。

自2004年Thompson等在Science雜志定義了“微塑料”一詞，并描述了其潛

在的生態(tài)威脅，引起了全球范圍內對這一CECs中占比最高的污染物問題的關注。

微塑料直徑一般小于5mm，一般分為兩類：一類是為執(zhí)行某些功能而制造的初

級微塑料，如用作工業(yè)原料的化妝品微塑料和樹脂顆粒；另一類是通過物理、化

學和生物過程將大顆粒塑料廢物破碎并減少體積而形成的次級微塑料。隨著微塑

料在人為和自然條件下的進一步分解和降解，它們可能會變得越來越小，最終形

成納米塑料（粒徑在1~100nm）。由于其極小的尺寸和大比表面積，納米塑料具

有與傳統(tǒng)微塑料不同的物理、化學和生物學特性，它們比普通的塑料顆粒及微塑

料更容易被生物吞噬，并進入生物體內。隨著人造納米材料（manufactured

nanomaterials，MNMs）在消費品和其他產品中的開發(fā)和使用越來越多，納米塑

料在自然界中廣泛存在，并已被發(fā)現(xiàn)通過直接或間接的方式進入水生生態(tài)系統(tǒng)和

陸地生態(tài)系統(tǒng)，造成了生態(tài)風險。

現(xiàn)階段，中國作為世界最大的塑料生產和消費國，針對納米塑料的生態(tài)風險

評估的方法，一般采用普遍納米材料的評估方法，如GB/T1032-2013《納米技術

納米材料風險評估》中規(guī)定的基于已有文獻的“證據(jù)權衡法”進行評估，缺乏針

對性驗證。然而受制于CECs中納米塑料的物理惰性和文獻局限性，上述方法難

以在基礎實驗中具體實現(xiàn)。同時，由于納米塑料的生態(tài)風險因其主要成分及粒徑

形態(tài)不同而發(fā)生改變，因此非常有必要聚焦水環(huán)境中納米塑料的毒性效應，發(fā)展

建立基于生態(tài)系統(tǒng)健康的納米塑料水質基準理論與方法，研究低劑量、長期暴露

和真實場景條件下，納米塑料對水生生物的毒性效應和致毒機理，將其納入人體

健康水質基準研究，開展我國優(yōu)先控制納米塑料的水質基準與標準研究，提升國

家新污染物治理、管理能力和國際履約能力。

在水生生態(tài)毒理學研究中，各種水生生物（如魚類、水蚤、藻類等）被用于

預測化學物質對水生環(huán)境可能產生的不利影響。而節(jié)肢動物占據(jù)了地球上各種生

境的最大多樣性（占整個現(xiàn)動物種數(shù)的80%），在食物鏈中占據(jù)了能量和物質循

環(huán)的重要生態(tài)位。其中，鹵蟲（Artemiaspp.）作為世界廣布的廣鹽性節(jié)肢動物

的關鍵物種，承擔著從基礎生產者到高層捕食者的中間環(huán)節(jié)，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的

能量轉換和物質流動中起著承上啟下的關鍵作用。鹵蟲不僅在漁業(yè)飼養(yǎng)上的擁有

重要地位（當前世界上85%以上的水產養(yǎng)殖動物的育苗均以其為餌料來源），同

時因其是一種典型的對餌料不加選擇的濾食性動物，對環(huán)境有毒物質的刺激非常

敏感，因此也成為研究抗逆機制的一種模式生物。綜上，作為水生毒理學的生物

學模型，使用鹵蟲有如下幾個優(yōu)點：1）相較于脊椎動物，人們對于無脊椎動物

倫理的關注程度較低；2）鹵蟲已有較為全面的生物學和生態(tài)學背景知識；3）鹵

蟲地理分布廣泛，廣布于咸水湖和池塘等水生環(huán)境中；4）對鹵蟲無節(jié)幼蟲進行

的測試既簡單又經濟高效；5）鹵蟲的無節(jié)幼蟲由于體型小可以在小燒杯或培養(yǎng)

皿中培養(yǎng)，對培養(yǎng)空間要求小，易于在實驗室中評估；6）鹵蟲能夠在廣泛的水

鹽度和溫度范圍內適應和生存；7）鹵蟲的生命周期短這一特性使得它普適于生

長、繁殖以及短期毒性測試驗；8）鹵蟲卵是商業(yè)化的，因此可在全球范圍內進

行試驗，且休眠卵在涼爽干燥的條件下可以儲存數(shù)年而不失去活力，經海水中浸

泡后，無節(jié)幼體可在約24h內孵化使用；9）從鹵蟲卵中孵化出鹵蟲具有相似年

齡、基因型和生理條件，適合作為毒理評價的同質性樣本。

近年來，全球各地的研究人員紛紛采用鹵蟲作為水生納米毒理學研究的試驗

生物。然而，目前缺乏標準化的鹵蟲水生毒性測試標準，導致這些研究所得出的

數(shù)據(jù)可能缺乏可重復性和可靠性。通過本標準的實施，可規(guī)范新污染物納米塑料

水生毒性的科學評估，旨在最大限度地提高測試的可重復性和可靠性。適用的納

米塑料的主要成分包括且不僅僅包括聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、聚氯乙烯

（PVC）、聚酯類（PET）、聚苯乙烯（PS）和聚酰胺（PA）等；適用的納米塑

料的形態(tài)包括且不僅僅包括納米顆粒、納米粉末、納米纖維、納米管、納米線，

以及此類聚集體和團聚體。該技術將為進一步建立適合我國國情和區(qū)域特點的納

米塑料內-外暴露風險評估模型，確定保護敏感人群健康的安全閾值，建立基于

人體健康效應的CECs水質基準理論與方法提供指導作用。

本文旨在提供一個標準化的測試協(xié)議，以確保通過鹵蟲測試得出的水生毒性

數(shù)據(jù)具有可靠性，進而為水體中的MNPs的生態(tài)毒性評估提供依據(jù)。

二、標準編制原則及依據(jù)

1.按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)

則》要求進行編寫。

2.參照相關法律、法規(guī)和規(guī)定，在編制過程中著重考慮了科學性、適用性和可

操作性。

三、項目背景及工作情況

（一）任務來源

根據(jù)《中國國際科技促進會標準化工作委員會團體標準管理辦法》的有關規(guī)

定，經中國國際科技促進會標準化工作委員會及相關專家技術審核，批準《利用

鹵蟲無節(jié)幼蟲對納米塑料進行水生毒性評估技術指南》團體標準制定計劃，計劃

編號為：CI2023293。本標準由浙江樹人學院提出，中國國際科技促進會歸口。

根據(jù)計劃要求，本標準完成時限為5個月。

（二）標準起草單位

本標準的主要起草單位是浙江樹人學院，負責標準文檔起草及相關文件的編

制等。浙江省水利河口研究院（浙江省海洋規(guī)劃設計研究院）、自然資源部第二

海洋研究所、浙江省海洋監(jiān)測預報中心、浙江越甦再生資源有限公司、杭州統(tǒng)標

檢測科技有限公司為主要參與單位，負責標準中重要技術點的研究和建議，并參

與標準內容的討論。

（三）標準研制過程及相關工作計劃

1、前期準備工作：

任務下達后，項目承擔單位浙江樹人學院于2023年7月中旬成立標準編制組。

編制組成員對利用鹵蟲無節(jié)幼蟲對納米塑料進行水生毒性評估技術的有關內容

分別進行了調研。經匯總討論后，編制組確定了標準中需要規(guī)定的主要技術內容。

2、標準起草過程：

2023年8月17日，由中國國際科技促進會標準化工作委員會向國家標準委全

國標準服務平臺立交立項，立項編號為：CI2023293，并向全社會公示了十五日。

2023年9月25日，由浙江樹人學院在浙江省杭州市樹人街8號浙江樹人學院行

政樓411會議室線下組織了第一次起草會議，談論了標準的組織構架，確定了分

工和編制工作的各項任務完成時間節(jié)點。

2024年1月18日組織了第二次起草會議，確定下了標準內容的草案；

2024年2月19日將標準草案提交中國國際科技促進標準化工作委員會，通過

審核，于2024年2月底報送了全國標準平臺，并向全社會公開征求意見30日。

3、征求意見情況

標準編制小組先后通過現(xiàn)場會議、電話、微信等多種形式征集?業(yè)專家相關

意見和建議。針對征集的意見，標準編制小組召開了研討會，將收集到的意見進

行匯總處理分析，在充分吸納合理意見的基礎上，先后修改和完成標準內容，于

2024年2月根據(jù)在各單位反饋意見基礎上，形成了標準征求意見稿并由中國國際

科技促進會提交全國標準信息平臺公示。

（四）主要試驗（或驗證）情況分析

（1）納米塑料的類型及表征：

一般的，尺寸在100nm范圍內的塑料顆粒被定義為納米塑料。納米塑料根據(jù)

世界主要的塑料分類，其成分主要為六種，包括聚乙烯（polyethylene，PE）、

聚丙烯（polypropylene，PP）、聚氯乙烯（polyvinylchloride，PVC）、聚苯乙

烯（polystyrene，PS）、聚氨酯（polyurethane，PUR）和聚對苯二甲酸乙二醇酯

（polyethyleneterephthalate，PET）。納米塑料的生成機理與微塑料相似，包括

應用于醫(yī)藥、化妝品、電子設備等行業(yè)的塑料因風化等作用進行初級和次級降解，

匯集在工業(yè)和生活污水中后，最終排放到水生環(huán)境中。目前，因納米塑料在基質

中的分辨率很低，故對其分離、定量和測量的方法還很少。本標準采用納米顆粒

跟蹤分析法（nanoparticletrackinganalysis，NTA）來確定測試樣品中的納米塑料

尺寸分布，其適用于尺寸范圍為30~2000nm的塑料顆粒；而后使用紫外-可見光

譜法（ultraviolet-visiblespectroscopy，UV-Vis）、掃描電子顯微鏡（scanningelectron

microscopy，SEM）、能譜（energydispersivespectroscopy，EDS）、投射電子

顯微鏡（transmissionelectronmicroscope，TEM）、場流散射（fieldflowfractionation，

FFF）和動態(tài)光散射（dynamiclightscattering，DLS）對納米塑料進行進一步的

構象測試。

（2）鹵蟲的物種鑒別及生理特性：

鹵蟲從物種上主要包括Artemiafranciscana、A.salina和A.parthenogenetica

三種。其中，A.parthenogenetica來自四個獨立的物種起源的雜合，由于物種敏

感性的差異和分類學的不精確性，不建議使用A.parthenogenetica進行生態(tài)毒理

學測試。在本標準中，我們采用培養(yǎng)參數(shù)更廣譜化的A.salina作為鹵蟲生物模型

進行納米塑料的水生毒性評估，以實現(xiàn)研究的標準化。依據(jù)鹵蟲發(fā)育途徑的生物

學特點，給予適宜孵化條件（鹽度20‰、溫度27℃、pH值8.5、光照1000lux），

將經過鏡檢篩選、處于休眠狀態(tài)的鹵蟲卵在短時間內孵育出無節(jié)幼蟲。鹵蟲的生

長分為四個階段：I齡期（孵化后24h內，無節(jié)幼體沖破卵膜成“掛燈籠”狀形

態(tài)）、II齡期（孵化后24~48h，無節(jié)幼蟲）、Ⅲ齡期（孵化后2~10天，無節(jié)幼蟲）

和成蟲期（孵化10天后）（圖1）。II齡期無節(jié)幼蟲是毒理暴露使用最多的發(fā)育

階段，在此期間鹵蟲形成了較為成熟的胃腸道，腸上皮與外部環(huán)境直接接觸，有

助于攝取納米塑料；且該生長時期的幼蟲容易保養(yǎng)，對各種毒物敏感、靶點廣泛，

能夠客觀地反映被測試樣與生物機體作用的相關性，是本標準水生毒性測試采用

的最佳齡期。

圖1鹵蟲在卵囊期、I齡期、II齡期、Ⅲ齡期、成蟲的形態(tài)特征（×40）

（3）毒理實驗的暴露時間：

鹵蟲II齡期無節(jié)幼蟲對MNPs的暴露時間從5分鐘到45天不等，主要分為短期

暴露和長期暴露兩類毒理試驗。短期試驗的暴露時間范圍為5分鐘至96小時，其

中24小時和48小時是最常用的暴露時長。長期試驗則選用了14天、30天、44天和

45天的暴露時間。短期測試（≤96小時）是目前使用最廣泛且已建立較完善的毒

理學測試方法；而長期測試（通常為7至14天）的使用量在過去十年中逐漸增加。

關于短期測試，24h暴露測試的應用最為普遍，其所得結果更為均質，操作簡單

易行；而從技術角度來看，無需使用復雜設備或高度訓練的專業(yè)人員。長期測試

對于深入了解模式生物對污染物的敏感性至關重要。這類研究能夠揭示短期測試

中難以觀察到的毒性效應，更貼近現(xiàn)實環(huán)境場景，能夠全面評估污染物在生物整

個生命周期中的慢性影響。例如，長期暴露于聚苯乙烯納米粒子對鹵蟲產生明顯

的毒性作用，而這一點在短期測試中并未體現(xiàn)。關于長期測試，14天暴露測試的

應用最為普遍，其所得結果更為均質。因此，強調在研究中應盡可能兼顧評估

MNPs急性毒性小葉（短期暴露）和慢性毒性效應（短期暴露），顯得尤為關鍵。

（4）毒性參數(shù)分析及評價方法：

在MNPs對鹵蟲產生的主要毒性作用中，主要包括死亡率/活動能力喪失、發(fā)

育/生長改變、生化指標變化、基因表達改變以及腸道損傷。除死亡率/活動能力

喪失這一指標外，其他效應的標準化代表性較弱，故本標準僅選擇死亡率/活動

能力喪失作為鹵蟲水生毒性指標。具體評價方法如下：

①鏡檢鑒別

購回的鹵蟲卵打開包裝后，優(yōu)質卵有一股新鮮的蝦腥味；卵的顏色為棕褐色、

有光澤；比較松散，無潮濕感，手抓少許握緊，不成團而順手指縫流下。凡是潮

濕發(fā)霉、有腥臭味、光澤黯淡、手抓少許成團不散、潮濕感較強的，都不得使用。

將待選的鹵蟲卵用飽和鹽水洗去沙粒等雜質（沙粒、泥沙等雜質沉于飽和鹽水底

部，鹵蟲卵浮于液面），淡水洗去空殼（空卵浮于淡水液面，優(yōu)質卵則沉于淡水

底部），20℃烘干后，置冰箱4℃干燥保存?zhèn)溆?。取適量干燥好的完好、健康卵

粒于低倍鏡下觀測。一般優(yōu)質卵像踩癟的乒乓球，若鹵蟲卵呈圓形則視為濕卵或

空卵；觀察卵殼外的附著物，有無結晶狀物質，一般來講，質量好的卵外殼的結

品物或其他雜質少，否則說明卵在加工過程中未經清洗或沉淀處理；另外，鹵蟲

卵不能有破損。

②鹵蟲孵化及優(yōu)選

孵化前，將鹵蟲卵平攤于大培養(yǎng)皿中，在通風干燥向陽的地方，自然光刺激

下曝光2×24h。將人工海鹽溶解于1000mL的蒸餾水中，配制成20‰的人工海水，

并用適量小蘇打（NaHCO3）調節(jié)pH至8.5左右。將經鏡選、預照后的優(yōu)質卵適量

放入小培養(yǎng)皿中，加入配制好的人工海水；水浴溫度控制在27℃；燈泡或燈管從

側面照明，光照強度1000lux。24h后該卵即孵化為實驗所需的II齡期鹵蟲無節(jié)幼

蟲。優(yōu)選出不易下沉、活力較強、體色較紅、運動正常（附肢劃水，蟲體向前泳

動，有時上下翻滾，泳動頻率一般每秒為4次左右）的優(yōu)質鹵蟲，備用。

③待測樣品的配制

MNPs用的20‰人工海水配制成相應濃度，并用適量小蘇打（NaHCO3）調

節(jié)pH至8.5左右即可。

④毒性評估

按空白對照組、陽性對照組和MNPs樣品組各設3~5個平行，空白對照組僅

加入20‰的人工海水，樣品組則由待測樣品按③配置而成，陽性對照組加標準濃

度的試液；每個測試樣品按需要設置終濃度；每組分別加入優(yōu)選得到的10個同步

生長的優(yōu)質鹵蟲，以確保樣品濃度的穩(wěn)定和鹵蟲生存環(huán)境的一致。長期暴露實驗

為保證鹵蟲生長，可每天分別兩次投喂小球藻（Chlorella，密度為105cells/mL），

每3天換一次人工海水。

根據(jù)短期暴露（24h）和長期暴露（14天）兩類毒理試驗的需要，飼毒響應

時長后，觀察鹵蟲運動的變化，主要包括以下5鐘情況：死亡，活動能力喪失；

沉底，偶有滑動；泳動遲緩，每秒1~2次；泳動緩慢，每秒約3次；運動加快呈逃

避反應。本模型以鹵蟲死亡/活動能力喪失為毒性判斷標準，鹵蟲毒性評估用存

活率及校正死亡率表示，按以下公式計算：

存活率=存活個體數(shù)/總個體數(shù)×100%

校正死亡率=（對照組存活率-處理組存活率）/對照組存活率×100%

將各個濃度及其對應的校正死亡率輸入計算機，計算LC50（校正死亡率為

50%時的MNPs濃度）及其95%置信區(qū)間，從而得到具統(tǒng)計學意義的可比較的毒

性強度。

（5）MNPs短期暴露（24h）對鹵蟲的毒性評估：

將經鏡選、預照后的優(yōu)質鹵蟲卵在標準條件下孵化，將0.500g卵放入錐形玻

璃孵化管中，加入鹽度為20‰人工海水200mL（pH調至約8.5），底部持續(xù)充氣，

日光燈持續(xù)光源1000lux，水溫27℃。孵化24h后停氣，靜置5min后使卵殼、未

孵化的鹵蟲卵和鹵蟲無節(jié)幼體分離，收集無節(jié)幼體。

選取100只個體大小均勻的幼體轉移至添加200mL20‰人工海水的錐形玻

璃養(yǎng)殖管中，密度為0.5ind./mL。向養(yǎng)殖管中加入選取直徑為100nm的熒光聚苯

乙烯納米塑料（PolystyreneNanoplastics，PSNPs）（濃度分別為0.05、0.5、5和

10μg/mL），每組3個平行。24h后測定鹵蟲存活率，并從每管取出5只鹵蟲，放

置體視顯微鏡下，使用綠色熒光（熒光PSNPs最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488

nm和518nm）觀察納米塑料被鹵蟲攝取的情況。

鹵蟲在不同濃度PSNPs中暴露24h后，帶有綠色熒光的PSNPs在鹵蟲腸道部

分發(fā)生較強的熒光信號，表明PSNPs被鹵蟲攝食并聚集在鹵蟲腸道內。在PSNPs5

μg/mL和10μg/mL組中明顯觀察到鹵蟲不僅將PSNPs攝食到體內，并以糞球的形

式排出體外（圖1）。結果表明，聚集在養(yǎng)殖水體中的PSNPs聚合物能夠被鹵蟲

攝食到腸道內，并大部分PSNPs會以糞球的形式排出體外。

除在最高PSNPs濃度（10μg/mL）下短期暴露24h后，幼體周圍出現(xiàn)蛻皮和

PSNPs聚集物，校正死亡率達13.3±3.4%，具有顯著性差異外（p＜0.05）；PSNPs

在0.05、0.5和5μg/mL濃度下，校正死亡率分別為1.0±0.2%、1.3±0.1%和2.1±

0.7%，并無顯著性差異（p＞0.05）。

圖1暴露在不同濃度PSNPs下，24h后鹵蟲幼體腸道駐留的PSNPs（綠色熒光）

（6）MNPs長期暴露（14d）對鹵蟲的毒性評估：

將經鏡選、預照后的優(yōu)質鹵蟲卵在標準條件下孵化，將0.500g卵放入錐形玻

璃孵化管中，加入鹽度為20‰人工海水200mL（pH調至約8.5），底部持續(xù)充氣，

日光燈持續(xù)光源1000lux，水溫27℃。孵化24h后停氣，靜置5min后使卵殼、未

孵化的鹵蟲卵和鹵蟲無節(jié)幼體分離，收集無節(jié)幼體。

選取100只個體大小均勻的幼體轉移至添加200mL20‰人工海水的錐形玻

璃養(yǎng)殖管中，密度為0.5ind./mL。向養(yǎng)殖管中加入選取直徑為100nm的熒光聚苯

乙烯納米塑料（PolystyreneNanoplastics，PSNPs）（濃度分別為0.05、0.5、5和

10μg/mL），每組3個平行。養(yǎng)殖管放入水箱中27℃恒溫養(yǎng)殖，每天兩次（間隔

12h）投喂小球藻（Chlorella，密度為105cells/mL），每3天換一次水，14天后測

定鹵蟲校正死亡率。

長期暴露（14d）于0.05、0.5、5和10μg/mLPSNPs對存活率有顯著影響（p

＜0.05），且暴露組和對照組之間存在顯著差異（p＜0.05）。在測試的最高濃度

10μg/mL下，矯正死亡率高達100%；PSNPs在0.05、0.5和5μg/mL濃度下，校正

死亡率分別為36.0±2.7%、61.8±3.2%和82.6±5.1%。隨著發(fā)育（直到14天），

在形態(tài)學水平上，暴露于0.5μg/mL及以上濃度的PSNPs下，3天檢測到發(fā)育改變

（圖2）；在14天后，一些暴露于5和10μg/mL的幼體發(fā)育仍停留在II齡期，而沒

有進展到III齡期。

0μg/mL0.05μg/mL0.5μg/mL5μg/mL

0μg/mL0.05μg/mL0.5μg/mL5μg/mL

圖2長期暴露于不同濃度PSNPs下鹵蟲發(fā)育的形態(tài)學變化（箭頭指示發(fā)育過程中

的形態(tài)學差異，10μg/mL濃度下長期暴露下無活體留存）

注：上排圖片-暴露3d后的形態(tài)變化，下排圖片-暴露14d后的形態(tài)變化

四、標準制定的基本原則

標準編制過程中，遵循