結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則2023年修訂版

——結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則（2023修訂版征求意見稿）一、適用范圍

在結(jié)核病的細菌學(xué)檢驗中，通常將分枝桿菌分為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacteriumtuberculosiscomplex）和非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculosismycobacteria,NTM）。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）、牛結(jié)核分枝桿菌(M.bovis)、非洲分枝桿菌（M.africanum）、羊結(jié)核分枝桿菌（M.caprae）和田鼠分枝桿菌（M.microti）等。臨床上通常只做結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的鑒定而不進行亞種水平的鑒定，用于結(jié)核輔助診斷的核酸檢測試劑也常采用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群共有的核酸序列作為靶標來進行檢測。本指導(dǎo)原則適用于采用分子生物學(xué)檢測技術(shù)，如聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）等，以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群共有的核酸序列為檢測靶標，對痰、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進行體外定性檢測的試劑，用于結(jié)核的輔助診斷。對于預(yù)期用途相同的其他樣本類型，或者預(yù)期用途為其他肺外結(jié)核輔助診斷的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進行修訂或補充其他的評價和驗證。本指導(dǎo)原則適用于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑注冊申請和變更注冊申請的情形。本指導(dǎo)原則針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑注冊申報資料中的部分內(nèi)容進行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等相關(guān)法規(guī)要求。二、注冊審查要點（一）監(jiān)管信息1.產(chǎn)品名稱及分類編碼產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類子目錄》，與致病性病原體抗原、抗體以及核酸等檢測相關(guān)的試劑管理類別為三類，分類編碼為6840。2.其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。（二）綜述資料綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。應(yīng)詳細說明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程。提供不同適用機型的檢測通量，即一次檢測最多可檢測的樣本數(shù)。提供核酸提?。ㄊ止ず妥詣犹崛》绞綉?yīng)分別明確）和PCR擴增的時間，以及檢測全過程所需的時間。不同檢測流程，分別提供最少和最多檢測樣本量下的檢測時間。與已上市同類產(chǎn)品進行比較，比較內(nèi)容包括樣本類型，檢測原理，檢測靶基因，組成成分，內(nèi)標，質(zhì)控品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。預(yù)期用途中明確產(chǎn)品檢測的靶基因，需選擇保守性和特異性相對較高的基因，同時還應(yīng)考慮基因的擴增效率。檢測靶基因的選擇應(yīng)提供相關(guān)指南或文獻，并分析所檢測基因的靈敏度和特異性是否符合臨床需求。（三）非臨床資料1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告注冊申請人應(yīng)當在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價等結(jié)果，依據(jù)國家標準、行業(yè)標準及有關(guān)文獻資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測試劑已有國家參考品，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家參考品的相關(guān)要求，并使用國家參考品對三批產(chǎn)品進行檢驗。如有適用的國家標準、行業(yè)標準，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。2.分析性能研究注冊申請人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。如申報產(chǎn)品適用不同的機型，需要提交采用不同機型進行性能評估的資料。如申報產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對各包裝規(guī)格進行分析或驗證。對于適用的不同樣本類型應(yīng)分別進行分析性能研究。分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。研究中采用的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群樣本，應(yīng)采用科學(xué)合理的方法確定其陰陽性和濃度水平，提交具體的試驗資料。如，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性樣本的確認，應(yīng)結(jié)合臨床診斷結(jié)果，采用涂片和培養(yǎng)鑒定的方式，并同時參考已上市的核酸檢測試劑盒進行確認。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性樣本，可采用鋪板計數(shù)細菌集落形成單位（colonyformingunit，CFU）的方法進行菌株濃度的確認，以CFU/mL作為菌株濃度的表示方式；也可采用國家參考品對菌株濃度進行標定，以“個菌/mL”作為菌株濃度的表示方式。分析性能評估用樣本一般應(yīng)為臨床樣本或菌株，如涉及稀釋后檢測，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)。如，將已知濃度的菌株與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性痰樣本進行混合，完全按照申報試劑的操作步驟對此制備進行樣本前處理、核酸提取/純化、擴增等。不可采用質(zhì)粒進行分析性能評估。對于各項性能中采用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。2.1樣本穩(wěn)定性對采集后各階段的樣本進行穩(wěn)定性研究，包括采集后未經(jīng)處理的樣本、加入不同保存液或裂解液的樣本、采用不同滅活方式處理后的樣本，研究內(nèi)容包括冷藏保存時間，冷凍保存時間，凍融次數(shù)等。如產(chǎn)品適用痰、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積水等不同的樣本類型，因其中干擾物質(zhì)存在差異，可能對引起細菌DNA鏈斷裂的影響不同，建議對每種樣本類型均進行穩(wěn)定性研究。用于樣本穩(wěn)定性研究的樣本應(yīng)包括略高于最低檢測限濃度的樣本。如核酸提取液可不立即進行檢測，還需對核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進行研究。2.2適用的樣本類型列明產(chǎn)品適用的樣本類型，如痰樣本、支氣管肺泡灌洗液樣本、胸腔積液樣本，應(yīng)分別進行分析性能評估。2.3準確度采用申報試劑與臨床診斷或已上市產(chǎn)品，同時檢測臨床樣本，比較檢測結(jié)果之間的一致性程度，進行申報試劑的準確度評價。樣本應(yīng)選擇符合樣本穩(wěn)定性的預(yù)期人群樣本。研究應(yīng)納入一定數(shù)量的陰性和陽性樣本，并注意包含一定數(shù)量的陽性判斷值附近的樣本和干擾樣本。2.4企業(yè)參考品驗證根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進行檢驗并提供詳細的試驗數(shù)據(jù)。2.5精密度應(yīng)對精密度指標，如標準差或變異系數(shù)等的評價標準做出合理要求。應(yīng)考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設(shè)計合理的精密度試驗方案進行評價。精密度評價試驗應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評價周期，例如為期至少20天的檢測，具體方案可參考性能評價相關(guān)文件進行。采用結(jié)核分枝桿菌標準菌株（陰性樣本不適用）作為樣本進行精密度評價，應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、中/強陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當?shù)木芏纫螅纾宏幮詷颖荆捍郎y物濃度為零，即不含結(jié)核分枝桿菌的樣本，陰性符合率應(yīng)為100%（n≥20）。臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽性符合率應(yīng)≥95%（n≥20）。中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且CV≤5%（n≥20）。2.6檢出限2.6.1檢出限的建立建議使用結(jié)核分枝桿菌標準菌株、牛結(jié)核分枝桿菌標準菌株或BCG標準菌株（如適用）梯度稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，每個濃度梯度至少重復(fù)20次檢測，通過直接檢測或者Probit分析計算，將具有95%陽性檢出率的菌株最低濃度水平作為確定的檢出限。2.6.2檢出限的驗證另外選擇具有時間和區(qū)域特征性的至少3株結(jié)核分枝桿菌菌株、牛結(jié)核分枝桿菌菌株或BCG菌株（如適用）在檢出限濃度水平進行至少20次的重復(fù)試驗驗證，應(yīng)達到95%陽性檢出率。2.7包容性應(yīng)證明申報試劑可以檢測代表不同基因多態(tài)性的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株。應(yīng)至少對結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌或BCG菌株(如適用)、非洲結(jié)核分枝桿菌、羊結(jié)核分枝桿菌和田鼠結(jié)核分枝桿菌進行驗證。應(yīng)選擇不同來源的多個菌株進行研究，并包括檢出限和重復(fù)性的驗證。應(yīng)提供各個菌株的來源、菌株特性及濃度等信息，且應(yīng)證明所有采用的菌株含有靶核酸序列。注意包容性研究菌株和檢出限研究菌株不能重復(fù)。2.8分析特異性2.8.1交叉反應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑交叉反應(yīng)驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體。主要包括：非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（NTM），常見的口腔、呼吸道和胸腔共生的病原體等，具體目錄參見表1和表2。建議在病原體感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進行交叉反應(yīng)的驗證。通常，進行交叉反應(yīng)驗證的分枝桿菌、細菌或真菌感染的濃度水平為106CFU/mL或更高，病毒為105PFU/mL或更高。也可采用其他合理方法定值的濃度，例如核酸濃度107copies/mL或更高。申請人應(yīng)提供用于交叉反應(yīng)驗證的病原體的來源、制備方法、種屬/型別信息和濃度確認等試驗資料。表1用于交叉反應(yīng)研究的其他分枝桿菌（非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的其他分枝桿菌）堪薩斯分枝桿菌蘇爾加分枝桿菌海分枝桿菌龜分枝桿菌土分枝桿菌偶發(fā)分枝桿菌次要分枝桿菌恥垢分枝桿菌潰瘍分枝桿菌膿腫分枝桿菌戈登分枝桿菌胃分枝桿菌蟾分枝桿菌胞內(nèi)分枝桿菌鳥分枝桿菌草分枝桿菌瘰疬分枝桿菌注:表中所列細菌均應(yīng)進行驗證。表2用于交叉反應(yīng)研究的其他病原體肺炎鏈球菌金黃色葡萄球菌流感嗜血桿菌諾卡氏菌大腸桿菌銅綠假單胞菌表皮葡萄球菌白色念珠菌隱球菌煙曲霉人流感病毒（A型和B型）人類副流感病毒（1、2和3型）注:表中所列病原體均應(yīng)進行驗證。2.8.2干擾研究2.8.2.1干擾試驗應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進行驗證，驗證推薦物質(zhì)見表3。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價，檢測包含臨界陽性水平在內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群樣本。對于常見藥物干擾試驗，建議參照相應(yīng)藥物藥代動力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進行干擾驗證。對檢測結(jié)果進行合理的統(tǒng)計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的檢測結(jié)果（如，Ct值）的差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。表3用于干擾研究的物質(zhì)血液（人類）蛋白（如：黏蛋白、白蛋白）人細胞氯法齊明貝達喹啉異煙肼乙胺丁醇利福平吡嗪酰胺卡那霉素利奈唑胺抗生素（如：阿莫西林、左氧氟沙星）抗病毒藥（如：扎那米韋）鼻腔噴霧劑或滴鼻劑(如：腎上腺素、羥甲唑啉、含防腐劑的氯化鈉溶液)鼻腔糖皮質(zhì)激素（如：倍氯米松、地塞米松、氟尼縮松、曲安西龍、布地奈德、莫美他松、氟替卡松）鼻用軟膏類（如：莫匹羅星）樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)注:表中所列內(nèi)源性干擾物質(zhì)均應(yīng)進行驗證。外源性藥物均應(yīng)進行驗證，括號內(nèi)至少選做一種。2.8.2.2競爭性干擾申請人應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品適用的樣本類型，充分考慮臨床上容易與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群合并感染的病原體，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測的影響，進行競爭性干擾研究。2.9核酸提取/純化性能在進行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與已上市的核酸提取試劑進行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行抗干擾、精密度和檢出限的驗證。2.10反應(yīng)體系2.10.1樣本采集和處理2.10.1.1樣本采集方式的選擇2.10.1.2樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。2.10.1.3樣本處理方式的選擇：應(yīng)對樣本前處理進行研究。痰樣本應(yīng)對痰消化方式及消化液成分、濃度、使用量進行研究。如產(chǎn)品適用兩種或以上消化液，則每一種消化液均需配合提取試劑及檢測試劑進行精密度和檢出限的驗證，以證明不同的樣本前處理方法不會影響檢測結(jié)果。2.10.2核酸提取和反應(yīng)體系研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測靈敏度。提交不同適用機型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。3.穩(wěn)定性研究包括實時穩(wěn)定性（有效期）、運輸穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。4.陽性判斷值研究陽性判斷值一般為申報產(chǎn)品檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的Ct值。陽性判斷值研究用樣本來源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同時間、地域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素，盡量納入較多弱陽性樣本。在條件允許的情況下，建議覆蓋結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群不同變種進行陽性判斷值研究。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析建立檢測靶基因的陽性判斷值。如判定值存在灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認資料。如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，需要對各樣本類型進行陽性判斷值的驗證。提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機構(gòu)、檢測結(jié)果等信息。提供內(nèi)標檢測結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。5.其他資料5.1主要原材料研究該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTPs、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、企業(yè)參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標準等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、生產(chǎn)商提供的質(zhì)量標準、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。生產(chǎn)商應(yīng)固定，不得隨意更換。5.1.1引物和探針應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應(yīng)情況。建議針對每種被測病原體設(shè)計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗等方式，對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價，其中序列比對包括與已公布結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群序列的比對，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對；功能性試驗包括對不同來源、不同濃度的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸陽性樣本，和不同的近緣病原體的檢測。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標準應(yīng)至少包括序列準確性、純度、濃度及功能性實驗等。5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTPs）包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等的詳細驗證資料。5.1.3酶需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、功能性等進行評價和驗證。5.1.4質(zhì)控品試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測的靶序列，可采用含有靶核酸序列的核酸、含有靶核酸序列的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群滅活菌株或其他克隆菌株，靶核酸為RNA時可采用假病毒等制備，建議制備濃度為弱陽性。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料，對質(zhì)控品的檢測結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。5.1.5內(nèi)標內(nèi)標，又稱內(nèi)對照，可對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴增。申請人需對內(nèi)標的引物、探針設(shè)計和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內(nèi)標的檢測結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進行監(jiān)控。5.1.6企業(yè)參考品制備申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際情況自行設(shè)定企業(yè)內(nèi)部參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品、精密度參考品。應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認方法或試劑等相關(guān)驗證資料。建議采用滅活的菌株建立企業(yè)參考品，不宜采用質(zhì)粒、菌株的基因組提取/純化物等核酸或臨床樣本（如痰液）。陽性參考品應(yīng)著重考慮結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的代表菌株，包含不同濃度水平的目標核酸陽性樣本至少5例。陰性參考品則主要涉及對分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗證情況，建議包括正常臨床樣本、非結(jié)核分枝桿菌樣本、其他呼吸道病原體樣本等。檢出限參考品應(yīng)包含95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平。精密度參考品應(yīng)包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。5.2生產(chǎn)工藝研究

介紹產(chǎn)品的主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化的研究資料。（四）臨床評價資料1.臨床試驗機構(gòu)的選擇申請人應(yīng)當選定不少于3家（含3家）備案的臨床試驗機構(gòu)，按照有關(guān)規(guī)定開展臨床試驗。申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點及其預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種、流行病學(xué)背景、病原微生物的特性等因素選擇臨床試驗機構(gòu)。臨床試驗機構(gòu)必須具有與申報試劑相適應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員及儀器設(shè)備，并能夠確保該項試驗的實施。2.臨床試驗入組人群應(yīng)選擇具有結(jié)核癥狀/體征的疑似結(jié)核患者病例，并包括其他易混淆疾病的病例（最終臨床診斷確定不是結(jié)核），不建議選擇正常健康人群。應(yīng)采用臨床原始樣本進行臨床試驗，并且應(yīng)以新鮮樣本為主，如采用凍存樣本應(yīng)另行說明。3.對比試劑的選擇3.1對于“已有同品種批準上市”的申報產(chǎn)品申請人可選擇境內(nèi)已批準上市、臨床普遍認為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，采用申報產(chǎn)品與對比試劑進行比較研究試驗，證明申報本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。同時，申請人還應(yīng)選擇一定數(shù)量的臨床樣本進行申報產(chǎn)品與培養(yǎng)鑒定方法的對比研究，每種樣本類型不少于100例，涂片陰性和陽性各不少于50例。培養(yǎng)方法可采用傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)方法或臨床普遍認可的液體培養(yǎng)方法，菌種鑒定方法可采用PNB、測序、質(zhì)譜、或其他已上市的核酸或抗原等檢測試劑盒方法。3.2無同類產(chǎn)品上市的新結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑應(yīng)選擇培養(yǎng)鑒定和核酸序列測定（測序）方法作為對比方法。4.臨床試驗的樣本量4.1對于與已上市同類產(chǎn)品或測序進行的比較研究，建議采用單組目標值法計算臨床試驗的陽性樣本量和陰性樣本量，其中陽性符合率和陰性符合率的P0應(yīng)不低于90%。其中，涂片陰性的結(jié)核患者占所有結(jié)核患者的比例應(yīng)不小于50%。4.2對于新的結(jié)核核酸檢測試劑，在與培養(yǎng)鑒定進行比較研究時，建議采用單組目標值法計算臨床試驗的陽性樣本量和陰性樣本量，其中陽性符合率的P0應(yīng)不低于90%，陰性符合率P0值的確定應(yīng)有充分的依據(jù)。4.3如申報產(chǎn)品同時適用于多種樣本類型，每種樣本類型的樣本例數(shù)應(yīng)分別進行樣本量估算。4.4如果申報產(chǎn)品針對某種樣本類型有多種適用的樣本前處理方法或核酸提取/純化方法，如臨床前性能研究顯示多種方法之間存在差異，但不對臨床性能造成顯著影響，臨床試驗應(yīng)進行不少于100例同源樣本的對比試驗，證明不同樣本前處理方法或不同核酸提取/純化方法不會影響檢測結(jié)果，其中，陽性樣本和陰性樣本應(yīng)各不少于50例；如不同方法幾乎沒有差異，且經(jīng)臨床前研究證明分析性能沒有差異，則臨床試驗中不同樣本類型可進行匯總統(tǒng)計。5.臨床試驗結(jié)果的要求申報試劑對涂片陰性的結(jié)核患者應(yīng)有一定的檢出率；申報試劑對涂片陽性結(jié)核患者的檢出率至少為90%，申報試劑的臨床特異性至少為90%。6.測序方法的相關(guān)要求6.1臨床研究報告應(yīng)對選用的測序方法做詳細介紹。申請人應(yīng)提供以下關(guān)于測序部分的詳細試驗資料，需由臨床試驗機構(gòu)簽章確認。6.2測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及關(guān)鍵消耗品的相關(guān)信息。6.3測序方法所用引物相關(guān)信息，如核酸序列選擇、分子量、純度、功能性實驗等資料。用于核酸序列測定的引物序列應(yīng)不同于申報產(chǎn)品中用于檢測目的基因的引物序列。6.4對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與申報試劑的相關(guān)性能進行適當比對分析。6.5測序方法應(yīng)建立合理的陽性和陰性質(zhì)控品，以對臨床樣本的檢測結(jié)果進行質(zhì)量控制。6.6提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。7.臨床試驗方法、臨床數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析7.1應(yīng)在臨床試驗方案或者臨床試驗報告中明確申報試劑和對比試劑的檢測方法和判定標準。7.2在臨床報告中，以列表的方式，明確：總樣本例數(shù)、臨床診斷為結(jié)核的患者總例數(shù)、涂片陰性的結(jié)核患者例數(shù)、涂片陽性的結(jié)核患者例數(shù)、非結(jié)核的其他呼吸道疾病患者與易混淆疾病樣本例數(shù)，以判斷病例選擇的科學(xué)合理性。7.3臨床試驗數(shù)據(jù)應(yīng)以列表的方式表示，包括每個樣本的涂片結(jié)果、臨床診斷結(jié)果、申報試劑的結(jié)果、對比試劑的結(jié)果。7.4對臨床試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合率等。7.5臨床試驗中的某些樣本，采用申報試劑檢測時為陽性，采用培養(yǎng)鑒定方法檢測時為陰性，出現(xiàn)這種情況的原因有：樣本前處理導(dǎo)致結(jié)核菌的培養(yǎng)受抑制；樣本中結(jié)核菌的濃度過低。這可能導(dǎo)致申報試劑的特異性低。因此，在進行4.4統(tǒng)計分析的同時，建議進行申報試劑與最終臨床診斷的對比統(tǒng)計分析，以客觀地反應(yīng)申報試劑的臨床特異性。對于申報試劑與對比試劑（或?qū)Ρ确椒ǎ┑牡刃栽u價，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表卡方檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在臨床試驗方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗假設(shè)，即評價申報試劑與對比試劑（或?qū)Ρ确椒ǎ┦欠竦刃У臉藴省?.結(jié)果差異樣本的驗證在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用臨床參考標準或其他合理方法進行復(fù)核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進行分析。復(fù)核結(jié)果不應(yīng)納入統(tǒng)計分析。如無需復(fù)核，應(yīng)詳細說明理由。9.臨床試驗方案臨床試驗實施前，研究者應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床試驗方案。各臨床試驗機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床試驗機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。試驗方案中應(yīng)確定嚴格的樣本入選/排除標準，任何已經(jīng)入選的樣本再被排除出臨床試驗都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各臨床試驗機構(gòu)選用的對比試劑應(yīng)保持一致，以便進行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。另外，申報試劑的樣本類型不應(yīng)超越對比試劑對樣本類型的檢測要求。10.臨床試驗報告的撰寫根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。（五）產(chǎn)品說明書和標簽樣稿產(chǎn)品說明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說明書中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，應(yīng)以規(guī)范格式進行標注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑說明書編寫應(yīng)重點關(guān)注以下內(nèi)容。1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：1.1試劑盒用于體外定性檢測人xx樣本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸。1.2簡單介紹結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的病原學(xué)特征、流行病學(xué)特征、待測人群特征和現(xiàn)有診斷方法等。其中待測人群應(yīng)選擇具有結(jié)核癥狀/體征的疑似結(jié)核患者病例。1.3強調(diào)本試劑盒檢測結(jié)果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標準。建議結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析2.【檢驗原理】簡述產(chǎn)品的核酸提取和技術(shù)原理，介紹檢測靶基因名稱、引物及探針設(shè)計/對照品（質(zhì)控品）設(shè)置及熒光信號標記等。明確內(nèi)標基因名稱及其作用。如采用了防污染措施，對其作用機理進行簡要描述。3.【主要組成成分】明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等產(chǎn)品名稱，生產(chǎn)廠家，貨號及注冊證號、備案號等信息。4.【儲存條件及有效期】說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)融穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)明確具體的儲存條件及有效期。5.【樣本要求】重點明確以下內(nèi)容：5.1樣本的收集：應(yīng)參照《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊）》（中華醫(yī)學(xué)會編著）或者《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》（中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會編著）現(xiàn)行有效版本推薦的采樣要求，并詳細描述采樣步驟和注意事項。5.2臨床樣本的前處理（如適用）：應(yīng)參考《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊）》（中華醫(yī)學(xué)會編著）或者《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》（中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會編著）現(xiàn)行有效版本推薦的前處理方法，尤其是痰標本，如堿處理-直接法、N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC）-NaOH法等，詳細描述具體的前處理方法。5.3樣本的其他處理、運送和保存：明確核酸提取/純化前的其他處理（如離心、洗滌等）、保存條件及有效期、運送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的限制。明確提取后核酸的保存條件及有效期（如適用）。6.【檢驗方法】詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：6.1實驗條件：實驗室分區(qū)、實驗環(huán)境的溫度、濕度、空調(diào)氣流方向控制等注意事項。6.2試劑配