第三章-基因克隆載體

第三章

基因克隆載體基因克隆載體(geneclonevector):

通過不同途徑將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細胞且能在其中維持的DNA分子。也稱DNA克隆載體。必備條件：1、克隆位點(一個或多個)2、能攜帶外源DNA片段進入受體細胞:能自我復制，或整合到染色體隨受體細胞DNA復制而復制。3、有選擇克隆子的標記基因4、安全性(不含損害受體的基因,不任意轉(zhuǎn)入別的,尤其人的細胞)意義：基因工程隨載體系統(tǒng)的建立而興起，構建新載體一直是基礎研究的優(yōu)先領域。按克隆載體的來源分： 質(zhì)?！?/p>

病毒或噬菌體～

質(zhì)粒與病毒或噬菌體DNA組成的～

質(zhì)粒與染色體DNA片段組成的～按應用范圍分：表達型～

啟動子探針型～

cDNA

～按應用對象分：原核生物～

植物～

動物～分類３.１質(zhì)?？寺≥d體定義：以質(zhì)粒DNA為基礎構建而成的載體，適于原核和植物的基因轉(zhuǎn)移、建立基因組文庫和cDNA基因文庫。一、質(zhì)粒適于載體構建的性質(zhì)１、組成與構型質(zhì)粒(plasmid)是染色體外裸露的雙鏈DNA分子（細菌、真菌、藍藻、綠藻）構型：l-DNAoc-DNAccc-DNA２、分子大小： 100～102kb３、復制特點：在宿主細胞內(nèi)進行單向復制。質(zhì)粒和宿主細胞雙重遺傳系統(tǒng)控制復制強度：拷貝數(shù)（細胞內(nèi)質(zhì)粒與染色體數(shù)量之比值）（１）每種質(zhì)粒在其宿主細胞內(nèi)的拷貝數(shù)相對穩(wěn)定。

嚴緊控制型：1～數(shù)個拷貝；大質(zhì)粒

松馳控制型：10個以上拷貝；小質(zhì)粒。經(jīng)氯霉素處理，宿主中質(zhì)粒大量擴增（如ColE1拷貝數(shù)達3000個）。（２）質(zhì)粒復制的控制因素cop基因：指令宿主合成阻遏物，當質(zhì)粒復制到一定拷貝數(shù)時，阻遏物也合成積累，直到阻止質(zhì)粒的繼續(xù)復制。rep基因：指令宿主合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進質(zhì)粒的復制par序列：附著在細胞膜上，使質(zhì)粒隨細胞分裂而正確地分配到子細胞中，維持相對穩(wěn)定的拷貝數(shù)４、質(zhì)粒的不親合性親和性質(zhì)粒：能在同一細胞中復制的幾種質(zhì)粒

不親和性（不相容性）質(zhì)粒：不能在同一細胞中復制的質(zhì)粒。意義：宿主細胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒，最好不含內(nèi)源性質(zhì)粒５、質(zhì)粒遷移（１）接合質(zhì)粒：含tra基因→合成細胞表面物質(zhì)（鞭毛）→質(zhì)粒DNA入受體細胞 含tra基因的質(zhì)粒稱為接合質(zhì)粒。如F、Ti等 不含tra基因的質(zhì)粒稱為非接合質(zhì)粒。如ColE1、pPbS等（２）遷移作用： 不含tra基因而含bom（oriＴ）位點的質(zhì)粒，當宿主細胞存在輔助質(zhì)粒mob基因產(chǎn)物時，即可打開oriＴ位點，非接合質(zhì)粒借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物而遷移入受體細胞。這種現(xiàn)象稱～質(zhì)粒的遷移作用６、顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒宿主因含某種質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，稱為顯性（表達型）質(zhì)粒。顯性質(zhì)粒 Ｒ質(zhì)粒：含有氨芐青霉素Ap/Amp（抗性質(zhì)粒）氯霉素Cm/Cap

卡那霉素Km/Kan

四環(huán)素Tc/Tet

鏈霉素SmCol質(zhì)粒（產(chǎn)大腸桿菌素）Ｆ質(zhì)粒（引起細胞結合的育性質(zhì)粒） 降解毒物的降解質(zhì)粒Ｔi質(zhì)粒隱蔽質(zhì)粒 藍藻內(nèi)源質(zhì)粒二、質(zhì)?？寺≥d體構建的基本策略

１、克隆位點——組裝MCS連桿２、能進行有效復制——復制起始位點（最好是多拷貝）３、選擇標記基因——抗性基因，(LacZ′基因)４、分子盡可能?。ㄞD(zhuǎn)化率高），＞15kb轉(zhuǎn)化率↓↓５、組裝各種“元件”，如啟動子、終止子等三、質(zhì)?？寺≥d體構建過程：嚴密的實驗設計→構建（切割、修飾和連接重組）構建原則：

1、選用合適的出發(fā)質(zhì)粒：含必備的元件，如ori、選擇標記、克隆位點、啟動子和終止子。

2、正確獲得構建質(zhì)?？寺≥d體的元件。

3、組裝合適的選擇標記基因。

4、選用合適的啟動子。

5、構建過程力求簡單。代表性實例

（一）pBR322及其衍生質(zhì)粒克隆載體的構建Ⅰ、pBR322構建※

目標是縮小基因組的體積，移去一些對基因克隆載體無關緊要的DNA片段，限制酶識別位點。質(zhì)粒載體命名法則：

“pBR322”

p：質(zhì)粒（plasmid)

BR：兩位主要構建者

322：實驗編號

ColE1

松馳型，篩選系統(tǒng)復雜。衍生的pMB1為出發(fā)質(zhì)粒（松弛型復制起始位點，但缺較好的選擇標記基因和克隆位點）。

pSC101（最早用于DNA克隆的載體），嚴緊型，含有Tcr

基因。構建過程(出發(fā)質(zhì)粒：pMB1)R1（沙門氏菌中分離）變異R1drd19

（含易位子Tn3Apr）

R1drd19Tn3 ColE1pBR322的三個親本：pMB1、pSC101、pSF2124pBR322分子大?。?363bppSF2124pBR322優(yōu)點（1）較小的分子量

10kb以內(nèi)DNA分子純化過程中可避免斷裂，pBR322易于自身純化，且可克隆6kb左右的外源DNA（2）較高的拷貝數(shù) 經(jīng)氯霉素擴培后達1000～3000copys/cell（3）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇標記。插入失活（圖解）插入失活篩選法Ⅱ、pUC18/19質(zhì)粒載體與pBR322區(qū)別：乳糖操縱子的一個DNA片段（lacZ`基因）替換Tcr基因；組裝了一個多克隆位點（MCS）連桿命名pUC——UniversityofCalifornia的科學家首先構建。

pUC包括四個組成部分： （1）pBR322的復制起點(ori)

（2）Apr基因，但DNA序列發(fā)生變化，不再含原來限制性核酸內(nèi)切識別位點（3）lacZ`基因（4）在lacZ`基因內(nèi)部靠近5`端有一段MCS連桿LacZ`篩選機制：

含乳糖操縱子的啟動子、調(diào)節(jié)因子和

β-半乳糖苷酶的N端146殘基(α-肽)合成有活性的

基因（lacZ`）的質(zhì)粒載體引入可編β-半乳糖苷酶碼C端部分殘基的宿主(與LacZ`互補的大腸桿菌)

在含IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和

X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）藍色菌落

的誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)在N端α-肽的編碼區(qū)插入MCS不影響lacZ`基因功能插入外源DNA滅活lacZ`基因白色菌落pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點 （1）分子量更小、拷貝數(shù)更高 （2）免疫組化法一步實現(xiàn)篩選鑒定重組體，省時 （3）MCS區(qū)方便轉(zhuǎn)移外源DNA在不同載體系列中“穿梭”，使具有兩種不同粘末端的外源DNA能直接克隆入pUC載體pBR322衍生的質(zhì)粒

缺失bom（oriＴ）位點→pAT153、pBR327，不具被動遷移作用

均更安全練習：就克隆一個基因（DNA片段）來說，最簡單的質(zhì)粒載體也必須包括三個部分：————、————、——————。另外，一個理想的質(zhì)粒載體必須具有低分子量。如果兩個自力不能穩(wěn)定的共存于同一個寄主細胞中，則屬于————群，這是因為它們的————所致。質(zhì)粒拷貝數(shù)是指細胞中——————。pBR322是一種改造型的質(zhì)粒，它的復制子來源于————，它的四環(huán)素抗性基因來自于————，它的氨芐青霉素抗性基因來自于————。pSC101是一種————復制的質(zhì)粒。ColE1是唯一用作基因工程載體的自然質(zhì)粒，這種質(zhì)粒（）A是松弛復制型B具有四環(huán)素抗性C能被氯霉素擴增D能產(chǎn)生腸桿菌素下面關于松弛型質(zhì)粒性質(zhì)的描述種，不正確的是（）A質(zhì)粒的復制只受本身的遺傳結構的控制，而不受染色體復制機制的制約，因而有較多的拷貝數(shù)。B可以在氯霉素作用下進行擴增。C通常帶有抗藥性標記。D同嚴謹型質(zhì)粒整合后，雜合質(zhì)粒優(yōu)先使用松弛型質(zhì)粒的復制子。（一）pBR322及其衍生質(zhì)?？寺≥d體的構建※※※（二）藍藻質(zhì)?？寺≥d體pPKE2的構建（略）（三）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?？寺≥d體的構建（四）乳酸桿菌質(zhì)粒克隆載體（略）（五）酵母2μm質(zhì)?？寺≥d體（六）TA克隆載體——針對PCR產(chǎn)物的克隆（略）（二）藍藻質(zhì)?？寺≥d體pPKE2的構建（略） 大腸桿菌質(zhì)粒不能轉(zhuǎn)化藍藻 藍藻內(nèi)的質(zhì)粒屬隱蔽質(zhì)粒即：大腸桿菌源質(zhì)粒復制起始點+藍藻源質(zhì)粒復制起始點。

pPbs（1511bp）

pPbs

pBR322

組裝CaMV35s啟動子、MCS、rbcS終止子、Kmr基因構建穿梭質(zhì)粒ClaⅠ重組pPRS-1多次亞克隆pPKE2（三）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?？寺≥d體的構建

Ti質(zhì)粒：根癌農(nóng)桿菌中引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤（冠癭瘤）的質(zhì)粒，故稱Tumorinducingplasmid（Ti質(zhì)粒）。雙鏈環(huán)狀DNA分子，200～250kb。

1、4個功能區(qū)：T-DNA區(qū)、Vir區(qū)、Con區(qū)、Ori區(qū)

（1）T-DNA區(qū)

Ti質(zhì)粒進入植物細胞的約25kb部分，即T-DNA（transferDNA)。左右邊界各有一個25bp正向重復序列（LTS和RTS）稱為邊界序列，為T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合所必需。只要保留T-DNA的邊界序列，中間序列被外源DNA片段替換，仍可轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中。這是Ti質(zhì)粒用于遺傳轉(zhuǎn)化的理論依據(jù)。用野生型Ti質(zhì)粒獲得的轉(zhuǎn)基因植物細胞只能分裂，不能分化為植株，故不能直接選育轉(zhuǎn)基因植物。（2）Vir區(qū) 位于T-DNA區(qū)上游，其表達產(chǎn)物可激活T-DNA的轉(zhuǎn)移，顯示致瘤性。（3）Con區(qū) 含有農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn)移有關的基因（tra)，可受宿主產(chǎn)生的冠癭堿活化，使Ti質(zhì)粒在細菌間轉(zhuǎn)移，也即接合轉(zhuǎn)移基因編碼區(qū)。（4）Ori區(qū) 復制起始區(qū)，調(diào)控Ti質(zhì)粒自我復制。

Ti質(zhì)?？寺≥d體真正用于植物而非農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌只起中介作用。2、構建途徑（1）取代型載體。用大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體取代Ti質(zhì)粒的全部或部分T-DNA序列而構建。外源基因以同源交換而重組。

Onc-

Ti：T-DNA上的onc基因被取代而構建。

Onc+

Ti：pBR322取代T-DNA的部分序列但保留onc基因而構建。進入植物細胞誘發(fā)冠癭瘤。（2）中間質(zhì)?？寺≥d體

T-DNA的部分序列插入大腸桿菌質(zhì)粒載體而構建。 共整合克隆載體系統(tǒng)（T-DNA同源序列、bom

位點） 雙元克隆載體系統(tǒng)——微型Ti質(zhì)粒（四）乳酸桿菌質(zhì)?？寺≥d體（略）乳酸桿菌：G+，非致病，益菌生，用于食品和飲料。 質(zhì)粒宿主范圍廣泛：可用于其它G+菌及大腸桿菌。構建： 乳酸桿菌本身對km、Ap抗性較強。標記基因：選用lacZ，如有pLJ1復制啟始位點的pBG10;選用ery，如有p353-2復制啟始位點的pP3537（五）酵母2μm質(zhì)?？寺≥d體 幾乎所有釀灑酵母中都存在（1）2μm質(zhì)粒結構a、環(huán)狀分子內(nèi)有反向重復序列IR1和IR2，可發(fā)生重組，形成A、B型質(zhì)粒；有ori復制起始點能自主復制。b、20～80個/細胞。有絲分裂時數(shù)目穩(wěn)定，減數(shù)分裂時形成cir+/cir0圖3-10

A型酵母2μm質(zhì)粒（2）YEp克隆載體（酵母游離型質(zhì)粒）

2μm質(zhì)粒的ori→EcoRⅠ酶切pBR322質(zhì)粒酵母染色體URA3基因→HindⅢ酶切

YEp24

（圖3-11）特征（1）保留了pBR322的Ａｐｒ和Ｔｃｒ——篩選大腸桿菌克隆子 （2）含URA3標記——篩選酵母菌克隆子

（3）URA3基因——補償酵母菌ura3突變 優(yōu)點

（1）是一種穿梭質(zhì)粒，可在酵母菌和大腸桿菌中復制 （2）轉(zhuǎn)化率高，1μgDNA可獲得約104～105個克隆子 （3）穩(wěn)定高拷貝復制 故可用酵母菌高水平表達外源目的基因（六）TA克隆載體——針對PCR產(chǎn)物的克?。裕┰?/p>

PCR產(chǎn)物在Taq酶的非模板依賴活性 作用下，于3`端加一非配對的A。 故可研制一種線性載體，其5`端各帶一不配對T，可直接與PCR產(chǎn)物以TA連接進行克隆，即TA克隆。TA載體的再生方法（1）克隆載體線性化（2）克隆載體末端補平反應（3）克隆載體末端加T反應注：再生后的TA載體，原線性化的酶切位點消失思考題1、名詞解釋：基因克隆載體、遷移作用、接合質(zhì)粒、親和質(zhì)粒、顯性質(zhì)粒。2、任一DNA分子都可作為克隆載體使用嗎？為什么？3、構建質(zhì)粒載體時需考慮哪些特性？講究何策略？遵循什么設計原則？4、指出pBR322的結構來源，并圖示pBR322的構建。5、簡述LacZ`的篩選機制。6、pUC質(zhì)粒的基本結構組成。3.2病毒（噬菌體）克隆載體病毒基本結構：DNA（或RNA）+外殼蛋白感染細菌的病毒，稱為噬菌體(phage)。分類（根據(jù)病毒與宿主的關系）：

溫和性病毒：

溶原性增殖→構建病毒載體烈性病毒：

溶菌性增殖→改造后一、λ噬菌體克隆載體（一）λ噬菌體性質(zhì)λDNA+外殼蛋白1.λDNA(48.5kb)噬菌體中：線性宿主細胞：環(huán)狀(cos位點)2.λ噬菌體基因組有基因50個以上

J與N、P與Q之間為非必需序列3.限制性核酸內(nèi)切酶位點:56種（p477）

4.λ噬菌體的生長途徑

溶菌生長途徑

溶原生長途徑→某種脅迫條件下→合成six

基因產(chǎn)物→λDNA脫離細菌染色體→溶菌（二）構建依據(jù)1.λ噬菌體是一種溫和噬菌體2.能承載較大的外源DNA片段

λDNA頭部可包裝約36.4～51kb(自身的75%～105%)，且約有20kbλDNA可缺失（生長非必需）3.在λDNA上有多種限制性內(nèi)切酶位點（三）構建的基本策略與技術路線策略:

切去部分非必需區(qū)，刪掉多余的限制性內(nèi)切酶位點;插入選擇性標記基因;建立體外包裝系統(tǒng)。技術路線1.用限制性酶切去部分非必需區(qū)，抹去多余識別位點 選定一種酶，以gtWES–λβ為例，EcoRI（如圖）。 （48.5kb）λDNAEcoRI6個片段

A=21.6B=4.9C=5.5D=7.5E=5.9F=3.3B片段是λ噬菌體生長非必需的；

C片段缺失可阻斷溶原生長途徑，但不影響溶菌途徑；

E片段去掉不影響溶菌生長途徑的min5序列（2.6kb）。E兩端EcoRI位點經(jīng)點突變或甲基化處理，即得gtWES–λβ：（48.5-5.5-2.6=40.4kb）克隆能力： 替換B（置換重組）：最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb

最?。?6.4-(40.4-4.9)=0.9kb插入B的任一側（插入重組）最大：51-40.4＝10.6

最小：無 實際應用時克隆能力略有出入（p109,表3-5）

2.在λDNA的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標記基因 （1）取代red和gam基因 外源DNA取代獲Spi-表型在P2噬菌體溶原性細胞中能生長野生型λ噬菌體(Spi+表型)在P2噬菌體溶原性細胞中不能生長

局限性：只能以P2噬菌體溶原細胞作為受體。（2）最常用的篩選標記：LacZ′基因3.建立重組λDNA分子體外包裝系統(tǒng) 體外重組DNA分子必須經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后，才能轉(zhuǎn)導受體細胞。 野生型λ噬菌體感染的細胞中無多余的外殼蛋白。

D-（D基因缺失噬菌體）→受體細胞→積累除D蛋白以外所有蛋白質(zhì)

E-（E基因缺失噬菌體）→受體細胞→積累除E蛋白以外所有蛋白質(zhì)

混合D、E互補包裝λDNA分子λ噬菌體如:菌株BHB2688(E-)+BHB2690(D-)（四）λ噬菌體克隆載體的應用（自學） 建立cDNA基因文庫克隆外源目的基因（五）重組λDNA分子的體外包裝（自學）質(zhì)?？寺≥d體與λ噬菌體克隆載體有哪些區(qū)別？思考：二、cosmid克隆載體（柯斯質(zhì)粒載體）（一）構建策略 由質(zhì)粒和含cos位點的λDNA片段組裝成的載體，即cosmid（二）cosmid的特征1.環(huán)形雙鏈DNA分子2.具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并按質(zhì)粒方式復制3.含有一個cos位點A蛋白

cos末端→體外包裝成為噬菌體，但不含λ噬菌體溶菌生長途徑、溶原生長途徑和DNA復制系統(tǒng)，不會產(chǎn)生子代噬菌體

.4.cosmid較小，可承載更大的外源DNA

若cosmid為6.5kb，則可承載44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。因此，cosmid克隆廣泛用于構建基因組文庫。（三）使用cosmid載體的基本程序 利用cosmid的質(zhì)粒性質(zhì)，可按質(zhì)粒操作轉(zhuǎn)化受體細胞 利用cosmid的λ噬菌體性質(zhì)→轉(zhuǎn)導受體細胞思考題1.名詞解釋：Cos位點2.構建λ噬菌體載體的策略及其技術路線。3.試從cosmid克隆載體的構建策略上說明其特征。4.簡述病毒的溶原性和溶菌性增殖途徑。已知λDNA分子大小為48.5kb，EcoRI在該λDNA上有5個識別位點，依次在3.1、9、16.5、22、26.9。若完全酶切，切割的片段依次用A、B、C、D、E、F表示。（酶切后片斷大小變化忽略不計）。其中，E片段是λ噬菌體生長非必需的；D片段缺失可阻斷溶原生長途徑，但不影響溶菌途徑；B片段去掉不影響溶菌生長途徑的min5序列（2.6kb）。gtWES–λβ是切去D片段，保留E片斷兩端的位點，B兩端甲基化處理，去掉B片段內(nèi)min5序（2.6kb）。試問：gtWES–λβ置換和插入外源DNA片斷的范圍。三、M13噬菌體克隆載體（一）M13DNA

絲狀噬菌體，內(nèi)有一環(huán)狀單鏈DNA分子（“+”鏈DNA） 大?。?.4kb

結構：10個區(qū)基因間隔區(qū)507bp（IS區(qū)）

含復制起始位點及可插入外源DNA的位點M13DNA載體構建：野生型M13RF-DNAM13mp系列載體IIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIpolylinkerlacZ′（二）M13DNA復制和M13噬菌體增殖

M13DNA“+”鏈進入雄性大腸桿菌→合成“-”鏈→產(chǎn)生雙鏈M13DNA（復制型DNA或RF-DNA）→按環(huán)狀雙鏈DNA方式復制，同時以“+”鏈DNA為模板轉(zhuǎn)錄包裝蛋白→RF-DNA達200拷貝時，單鏈DNA特異結合蛋白與“+”鏈結合而阻斷合成“-”鏈→結果只能以“-”鏈為模板合成“+”鏈

→“+”鏈DNA被包裝蛋白包裝成新的M13噬菌體→擠出受體細胞→宿主細胞不被溶菌。

根據(jù)M13DNA復制特征：以雙鏈DNA為中間媒介 培養(yǎng)物→高速離心→上清中含噬菌體顆粒→“+”鏈DNA

沉淀菌體→破碎后，可提取RF-DNA（三）M13噬菌體克隆載體的構建策略和途徑

策略：在RF-DNA的IS區(qū)插入選擇標記基因，并組裝合適MCS。

RF-DNA上有10個BsuI位點→部分酶切→獲得全長線形RF-DNA,與含LacZ`標記的HindⅢ酶切片段進行平末端連接→M13mp1載體。為獲得合適的克隆位點,可在LacZ`區(qū)插入MCS連桿構建成對M13載體，保證外源DNA兩條鏈都能隨“+”鏈一起復制包裝。（四）M13克隆載體的優(yōu)點與應用優(yōu)點：1、以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介復制，可與質(zhì)粒一樣體外純化操作。2、制備的M13DNA單、雙鏈都能轉(zhuǎn)染大腸桿菌受體細胞。3、單鏈DNA不受包裝限制，可包裝M13DNA分子6倍的DNA分子。4、可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA插入的單鏈DNA分子。主要用途：克隆、分離單鏈外源DNA片段 ,獲得的“+”鏈可直接用于DNA測序四、CaMV克隆載體

花椰菜花葉病病毒（CaMV）

環(huán)狀雙鏈DNA分子（一）CaMV

DNA分子 大小：8kb

結構：在病毒顆粒中呈開環(huán)形式，負鏈有一缺口，正鏈有兩缺口。進入植物細胞后單鏈部分被酶解，缺口自行閉合，成為環(huán)狀DNA分子。G1G2G3（二）CaMV基因區(qū)8個閱讀框（ORF）和3個間隔區(qū)（IR1～3）

IR1－ORFVI與ORFVII之間

IR2－ORFVII與ORFI之間

IR3－ORFV與ORFVI之間

IR1和IR3區(qū)各有一個啟動子結構，分別啟動同方向轉(zhuǎn)錄35SRNA和19SRNA，而兩者的終止子都在IR1區(qū)。

35S啟動子——組成型強啟動子。組裝了35S啟動子的外源基因可在植物細胞高效表達，在藍藻細胞內(nèi)也有效表達。（三）CaMV的增殖和感染

1、增殖途徑：

CaMV顆?！料x→病毒DNA進入植物細胞核→ 轉(zhuǎn)錄19SRNA→翻譯

35SRNA→翻譯反轉(zhuǎn)錄“-”鏈DNA→復制出“+”鏈2、CaMV-DNA可轉(zhuǎn)染植物細胞 在ORFII和ORFVII區(qū)插入外源DNA后仍能轉(zhuǎn)染植物細胞包裝成新的CaMV顆粒（四）構建CaMV克隆載體的基本策略和途徑

策略：

CaMV-DNA能侵入植物細胞而將目的基因?qū)?，并且清除CaMV對植物的致病性基因.途徑1、構建互補克隆載體。組裝(目的基因+標記基因)而無感染能力+兩種基因和感染能力都無→彼此獲得對方產(chǎn)物→感染能力。很少被采用。2、構建置換型克隆載體。置換的外源基因較小3、構建混合型克隆載體。

CaMV-DNA→合適的限制性酶切→組入Ti的T-DNA區(qū)→完成構建4、構建CaMV-融合基因克隆載體系統(tǒng)。 將35S啟動子與目的基因融合，高效表達目的基因。五、煙草花葉病毒（TMV）克隆載體 單鏈正義RNA，6395bp特點：復制量和外殼蛋白表達量高，寄主范圍廣，能在整株植物上快速擴散。TMV載體構建策略有四種基本形式（自學）（圖3-20）六、SV40克隆載體——哺乳動物基因克隆載體 （猿猴空泡病毒40）（一）SV40基因組雙鏈閉環(huán)DNA：5243bp酶切位點：早期轉(zhuǎn)錄區(qū)：BamHⅠ、BstⅠ、TapⅠ識別序列晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)：AccⅠ、NaeⅠ、HaeⅡ、HpaⅡ

、EcoRⅠ、BanⅠ、EcoRⅤ、AflⅡ轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)：BglⅠ、SfiⅠ都只有一個識別序列（二）SV40-DNA復制與增殖 猿猴細胞——受納細胞 嚙齒動物（小鼠、倉鼠）——非受納細胞；細胞癌變 人：1～2%細胞產(chǎn)生病毒顆粒，不會插入染色體，相對安全SV40病毒在感染了CV-1和AGMK猿猴細胞之后，便產(chǎn)生感染性的病毒顆粒，并使寄主細胞裂解。我們稱這種感染效應為裂解感染(lyticinfection)，而猿猴細胞則叫做受納細胞(permissivecell)。但如果感染的是嚙齒動物(通常是倉鼠和小鼠)的細胞，就不會產(chǎn)生感染性顆粒，此時病毒基因組整合到寄生細胞的染色體上，于是細胞便被轉(zhuǎn)化，也就是說發(fā)生了癌變。我們稱這種嚙齒動物細胞為SV40病毒的非受納細胞(non-permissivecell)。

（三）構建策略和途徑 包裝嚴格，不能包裝大于SV40-DNA的分子，只能構建取代型載體或SV40-DNA與質(zhì)粒DNA的重組型載體1、取代型 被取代的DNA序列不能超過SV40-DNA的30%

（1）晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)取代型：需輔助載體共同轉(zhuǎn)染受體細胞 （2）早期轉(zhuǎn)錄區(qū)取代型：輔助細胞系 （將SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)DNA序列整合到敏感細胞基因組上）

2、病毒-質(zhì)粒重組克隆載體：質(zhì)粒載體的衍生物

（1）病毒-質(zhì)粒重組克隆載體（穿梭質(zhì)粒）：含SV40完整早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和DNA復制起始點，及質(zhì)粒DNA的復制起始點和選擇性標記 （2）微型病毒復制子質(zhì)粒載體：只含SV40復制起始點七、反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體：一類RNA病毒（一）勞斯肉瘤病毒的生物學特性RSV：含兩條相同的38SRNA（右圖）;與宿主細胞提供的tRNATrp結合處：PBS+ve、PBS-veRSV的復制與增殖：（右圖）接上長末端重復序列（LTR）策略：RNA病毒不能直接構建，必須從感染動物細胞中分離出原病毒DNA，按不同需求刪去部分序列，組入選擇標記、目的基因、調(diào)控元件，再克隆入質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，才可獲重組載體。（二）構建RSV載體的策略和途徑1、反轉(zhuǎn)錄病毒-質(zhì)粒載體 關鍵步驟：體外刪去原病毒的gag、pol、env等序列，保留5’和3’LTR序列以及PBS+ve、PBS-ve和psi（包裝）位點，插入合適的選擇標記如neo、gpt等。(如圖)需輔助反轉(zhuǎn)錄病毒↓Gag、Env蛋白↓識別包裝位點psi↓將重組的反轉(zhuǎn)錄病毒包裝成新的病毒顆粒新病毒能合成各種所需的蛋白質(zhì)。特點：更高的轉(zhuǎn)化效率，基因轉(zhuǎn)移成功率100%改進：鑒于危險性，已建立了不需輔助反轉(zhuǎn)錄病毒的克隆載體系統(tǒng)。將缺失psi位點的原病毒DNA轉(zhuǎn)化動物受體細胞，獲得全部包裝蛋白質(zhì)，即輔助細胞。2、廣宿主反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體組入能感染多種動物細胞的env基因3、反轉(zhuǎn)錄病毒表達克隆載體可插入6kb的外源基因。若剪短原病毒DNA，則可承載20kb八、腺病毒克隆載體（一）腺病毒的一般生物學特性

Ad：無囊膜的20面體，含一個線形雙鏈DNA分子，約36kb。

Ad-DNA兩端具有逆向末端重復序列（IRT），5`端共價結合一種5.5kD的蛋白質(zhì)（TP），進入宿主細胞后Ad-DNA自行環(huán)化。（二）腺病毒載體構建特點：易感染性、宿主范圍廣、毒性低（安全）、可容納的外源基因大、不整合入宿主染色體DNA。

基因轉(zhuǎn)移中最有前途的克隆載體之一人類腺病毒有51個血清型，常用的是Ad5和Ad2型。進入宿主細胞后以復制為界分早晚兩個基因表達時期。早期基因(E1～E４)編碼調(diào)節(jié)因子，晚期基因編碼病毒結構蛋白。野生型腺病毒容納最大外源DNA為2kb。理論上，除基因組兩端約500bp的順式結構和包裝必需結構外，其他結構均可被替換成外源DNA。策略：構建一個含MCS和篩選標志的質(zhì)粒（有病毒基因組某端早期序列）將一表達盒（啟動子—外源基因—PolyA）插入E1、E3區(qū)或E4至右IRT之間穿梭質(zhì)粒；再構建含非必須區(qū)基因缺失的環(huán)狀腺病毒質(zhì)粒，在菌體復制；穿梭質(zhì)粒+環(huán)狀腺病毒質(zhì)粒同源重組重組載體。

例：重組Ad-hFVⅢ構建（如圖）改進：構建能在野生型Ad感染的各種靶細胞內(nèi)選擇性復制的Ad載體。（三）Ad克隆載體的應用1、基因治療癌癥（1）導入腫瘤抑制基因和反義癌基因（2）導入前體藥物轉(zhuǎn)換酶基因——病毒引導的前體藥物治療（3）導入核酶基因，降低癌基因的表達水平2、表達真核基因3、研究疫苗

九、痘苗病毒克隆載體（一）生物學性質(zhì) 線形雙鏈DNA分子，180～200kb，編碼200多種蛋白（二）構建方法：痘苗病毒的基因組結構復雜，尚無質(zhì)粒型的痘苗病毒克隆載體，因此必須采用同源重組方法構建痘苗病毒克隆載體特點：

1）表達產(chǎn)物與天然產(chǎn)物的活性和理化性質(zhì)相近

2）外源目的基因和載體的免疫原性均較好

3）外源基因的插入量大

4）宿主細胞廣泛

5）表達產(chǎn)物可翻譯后修飾，無需佐劑，純化簡單，產(chǎn)物穩(wěn)定，易于保存運輸十、桿狀病毒克隆載體自學要點：基因組特性，同源重組方式，陽性克隆檢測，表達特點。思考題1、名詞解釋：Cos位點、受納細胞、非受納細胞2、構建λ噬菌體載體的策略及其技術路線。3、試從cosmid克隆載體的構建策略上說明其特征。4、簡述病毒的溶原性和溶菌性增殖途徑。5、M13噬菌體載體有何優(yōu)點和用途？6、簡述腺病毒克隆載體的策略及其主要用途。7、痘苗病毒克隆載體有何特點？為什么要用同源重組方式構建？8、如何構建反轉(zhuǎn)錄病毒載體？舉例說明。思考題：基因工程有三種主要類型的載體：——、——、——。某些嚴謹型和松弛型質(zhì)粒整合后，正常性況下——的復制起點可能被關閉。酵母

2μm質(zhì)粒有——，可以配對形成啞鈴結構。pUC18質(zhì)粒是通過——改造而來，它的復制子自來于——。λ噬菌體載體的基因組DNA為——kb，插入外源片段后，總長度應在噬菌體基因組的——范圍內(nèi)。λ噬菌體DNA可線形可環(huán)形，是由于在其線形兩端各有——堿基組成的粘性末端，成環(huán)后粘性末端的部位叫——。粘粒是質(zhì)粒和噬菌體雜合載體，它的復制子來自——，cos位點來自——，最大克隆達到——kb。M13單鏈噬菌體的復制分為三個階段：——、——、——。從酶切位點來看，插入型為——個，取代型（置換型）為——個。下列質(zhì)粒載體中屬于天然質(zhì)粒的是——pBR322pUC18pSC101pAT153下列哪種克隆載體對外源DNA的容載量最大——質(zhì)粒粘粒酵母人工染色體λ噬菌體關于反向重復序列正確的是——可以回折形成發(fā)夾結構可以是某些蛋白質(zhì)的結合位點參與轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座以上都不對Ti質(zhì)?！蓮霓r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)到植物細胞中在植物中導致腫瘤介導冠癭堿的合成，作為細菌的營養(yǎng)物和植物的生長激素需要細菌的vir基因幫助轉(zhuǎn)移PUC系列載體的抗性篩選標記為：（）A.

卡那霉素B.

四環(huán)素C.

氨芐青霉素D.

G418E.

氯霉素

用藍白斑篩選重組子時，IPTG的作用是：（）A.

誘導載體上的LacZ基因表達B.

作為顯色反應的指示劑C.

作為酶的作用底物D.

誘導載體上的抗性基因表達E.

誘導宿主上的LacZ基因表達常用的連接外源性DNA和載體DNA的酶是：（）A.

DNA聚合酶IB.

T4DNA連接酶C.

T4RNA連接酶D.

RNA聚合酶E.

Taq酶

關于重組體的敘述，下列哪項不正確：（）A.

重組體中含有載體成分B.

重組體中含有外源基因C.

重組體可直接表達外源基因D.

重組體只能在宿主細胞或體外表達系統(tǒng)中表達外源基因E.

重組體是由目的基因和載體通過連接酶連接而成的重組DNA分子導入受體細胞的方法有：（）A.

轉(zhuǎn)化B.

轉(zhuǎn)染C.

轉(zhuǎn)導D.

轉(zhuǎn)位E.

轉(zhuǎn)錄基因重組的載體必須具備下列哪些特點：（）A.

本身是一個復制單位，能在受體細胞中復制B.

插入外源DNA后也不影響自身的復制C.

能夠進入受體細胞D.

通常帶有抗性基因，易于篩選和鑒定某質(zhì)粒含有tetr和LacZ基因，tetr內(nèi)有一BamHⅠ位點、LacZ基因中有一BstⅠ位點。如果這兩種切割載體一并連接入相應的外源片段，則帶有該重組質(zhì)粒的細胞將——A有四環(huán)素抗性，在X-gal平板上呈現(xiàn)藍色B對四環(huán)素敏感，在X-gal平板上呈現(xiàn)藍色C有四環(huán)素抗性，在X-gal平板上呈現(xiàn)白色D對四環(huán)素敏感，在X-gal平板上呈現(xiàn)白色

3.3 染色體定位整合克隆載體質(zhì)粒與病毒克隆載體的不足：1、轉(zhuǎn)基因生物中游離的外源DNA分子能多拷貝復制，但易丟失，導致轉(zhuǎn)基因生物的不穩(wěn)定性。2、隨機插入染色體的外源DNA片段能穩(wěn)定維持，但因插入的位點不確定，可能干擾受體細胞基因組的自穩(wěn)系統(tǒng)，進而導致有害突變，造成選育轉(zhuǎn)基因生物不可知性，增加難度。基因整合平臺系統(tǒng)——基因定位同源重組(基因打靶)

整合平臺：即受體細胞基因組上給定的DNA區(qū)域，是外源DNA定位整合的位置。

定位整合克隆載體：除一般質(zhì)?？寺≥d體必備的元件外，還含有一個或兩個與整合平臺DNA區(qū)域核酸序列同源的DNA片段（長度最好＞1kb）。

一、定位整合克隆載體的幾種模式（一）內(nèi)源平臺雙交換置換克隆載體（二）外源平臺雙交換置換克隆載體（三）內(nèi)源平臺雙交換插入克隆載體（四）內(nèi)源平臺單交換插入克隆載體二、定位整合效率與受體細胞的種屬和同源DNA片段的長短有關整合效率偏低，有待改進三、定位整合克隆載體受體生物：原核生物藍細菌、高等植物（擬南芥、水稻等）的原生質(zhì)體、動物鼠的胚胎干細胞、人的細胞整合平臺：內(nèi)源isiAB、cpcB2A2、hprt、rDNA

外源hptΔ、aphⅡ（一）藍藻染色體定位整合克隆載體1、絲狀藍藻Calothrixsp.PCC7601獲得含藻藍蛋白基因cpcB2A2的DNA片段，以之為同源序列，構建～ 2、從其cpc2操縱子中擴贈出cpc2啟動區(qū)（約0.6kb）、同源DNA片段L（約1.2kb）和R（約1.15kb）構建如下載體：3、Synechococcus

從sp.PCC7942獲得含isiAB基因的約1.5kb的DNA片段，構建pZL： 不含藍藻源質(zhì)粒復制起始位點，故不能在藍藻細胞質(zhì)中自行復制（二）酵母菌染色體定位整合克隆載體（三）植物染色體定位整合克隆載體易于控制；避免插入失活或突變。（四）動物染色體定位整合克隆載體

３.４人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體含義和特點 實際上是一種“穿梭”克隆載體(shuttlevector)

：含有質(zhì)粒克隆載體所必備的第一受體（大腸桿菌）源質(zhì)粒復制起始位點（ori），還含有第二受體（如酵母菌）染色體DNA著絲點、端粒和復制起始位點的序列，以及合適的選擇標記基因。特點：能容納長達1000至3000kb的外源DNA片段。二、人工染色體克隆載體的構建

YAC（酵母人工染色體）常用載體：pYAC3、pYAC4、pYAC5三、人工染色體克隆載體的應用構建基因組文庫基因治療基因功能鑒定

３.５特殊用途克隆載體一、啟動子探針(promoterprobe)型克隆載體應用范圍：研究生物的發(fā)育機制提高目的基因表達產(chǎn)量進行基因治療組成結構：必備轉(zhuǎn)化系統(tǒng)+檢測部件檢測部件：1)一個已失去轉(zhuǎn)錄功能且易于檢測的遺傳標記基因,2)克隆位點。1、Kanr標記：用于植物細胞

Kanr基因→Kanr蛋白 卡那霉素磷酸化卡那霉素→不能進入細胞

ATP2、gfp標記:用于真核及原核細胞gfp基因→GFP（綠色熒光蛋白)395nm/470nm發(fā)射510nm（綠色熒光）3、hph標記:用于真核及原核細胞 潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hph）二、誘導型表達克隆載體

指啟動子必須在特殊的誘導條件下才有轉(zhuǎn)錄活性或比較高的轉(zhuǎn)錄活性的表達克隆載體.誘導條件：二價金屬離子、紅光、熱、干旱1、金屬硫蛋白（MT）啟動子2、干旱誘導表達克隆載體通過轉(zhuǎn)基因技術使細胞內(nèi)積累果聚糖和海藻糖能不同程度地提高轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性。干旱誘導性啟動子：Prd29A3、紅光誘導表達克隆載體藻藍蛋白操縱子2（cpc2)→藍藻表達克隆載體pUTK2（圖3-34）(p143)4、熱誘導表達克隆載體groESL啟動子→藍藻基因整合平臺表達克隆載體pZL（圖3-35）(p144)三、反義表達克隆載體-人工干預基因表達利用人工合成或重組的、與靶基因互補的一段反義DNA或RNA片段，特異性地與靶基因結合，從而達到封閉其表達的目的。應用：基因治療和基因功能的研究1、SOD基因反義表達克隆載體2、NHE1基因反義表達克隆載體人肺癌細胞Na+/H+交換泵1（NHE1）四、組織特異性表達克隆載體1、乳腺組織特異性表達克隆載體基因工程藥物的生物反應器人凝血因子Ⅸ另外，E