PCR技術(shù)的原理、操作與應(yīng)用

PCR技術(shù)的原理、操作及應(yīng)用2013.04.11分子生物學(xué)什么是PCRPCR:PolymeraseChainReaction，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)

PCR技術(shù)的發(fā)展歷史關(guān)于PCR的文章首次由美國科學(xué)家KaryMullis等人在《Science》雜志上發(fā)表《Science》雜志報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶（生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到的一種耐熱的DNA聚合酶）的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時(shí)代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個(gè)“年度分子”。1993KaryMullis因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR技術(shù)的原理1遺傳物質(zhì)：細(xì)胞核染色體DNA（脫氧核糖核酸和磷酸鏈和堿基構(gòu)成)堿基（A、T、C、G）是按雙鏈螺旋排列的，堿基序列的長度和排列的順序決定了生物的多樣性。比如人類體細(xì)胞中共有31億個(gè)堿基對(duì)，按上述的0.1%的差，人和人之間有3百萬個(gè)堿基對(duì)的差別。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和遺傳密碼子的發(fā)現(xiàn)，開創(chuàng)了分子生物學(xué)的時(shí)代。PCR技術(shù)的原理2A—TG—CAAA-TA-TA—TC—GC—GG—CG—CA—TTTA—TG—CC—GA-TA-TA—TC—GG—CG—CA-TA—TG—CT—AC—GT—AA-TA-TA—TC—GG—CG-C基本原理DNA的半保留復(fù)制原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則A=T，G=CPCR的基本工作原理就是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。PCR技術(shù)的原理3PCR反應(yīng)的體系包括7種基本成分：模板（TemplateDNA）引物（Primer）TaqDNA聚合酶dNTPTaq聚合酶緩沖液（TaqBuffer）PCR技術(shù)的原理4基本反應(yīng)步驟：變性(denaturation)-高溫下將模板DNA雙鏈打開退火(annealing)-引物在較低溫度下以共價(jià)鍵結(jié)合到模板DNA互補(bǔ)部位延伸(extension)-Taq酶作用下，不斷向引物3’端添加dNTP，DNA鏈不斷延伸PCR技術(shù)的原理51234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~35輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍以溫度變化來控制反應(yīng)階段PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):特異靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU簡便、快速、自動(dòng)化一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNAPCR技術(shù)的局限性為了構(gòu)建特定引物，使特定DNA序列的選擇性擴(kuò)增，必須有一個(gè)龐大的已知序列的數(shù)據(jù)庫。聚合酶鏈反應(yīng)效率差異很大，根據(jù)不同的因素需要優(yōu)化反應(yīng)條件。PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度有限。標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液5ul模板DNA0.1～2ug引物各10～100pmol4種dNTP混合物各200umol/LTaqDNA聚合酶2.5UMg2+1.5mmol/L加雙蒸水至50ul可以按照比例放大或者縮小體系，不同的PCR反應(yīng)需要優(yōu)化按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行即可PCR循環(huán)參數(shù)94℃，3min；

94℃，45s；

58℃，1min；

72℃，1min；循環(huán)30次

72℃，10min；

16℃保溫（熱力學(xué)參數(shù)）94℃，3min；

94℃，45s；

58℃，1min；循環(huán)30次

72℃，1min；

72℃，10min；

16℃保溫94℃預(yù)變性，3min

使DNA雙鏈完全打開退火：58℃，1min溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合，降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。變性：94℃變性，45s使雙鏈DNA解鏈為單鏈延伸：72℃，1min溫度為Taq酶最適反應(yīng)溫度72℃時(shí)間由擴(kuò)增片段的長度決定1min擴(kuò)增1KB

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)1凝膠電泳緩沖液配方10×TBE緩沖液(每升)：Tris107.8gBoricAcid55.0gEDTA(Na2)8.2g10×TAE緩沖液(每升)：Tris48.4g冰乙酸11.42g0.5mol/LEDTA20ml用電泳緩沖液制備1.5%瓊脂糖凝膠，按每孔8ulPCR產(chǎn)物上樣至膠中。100伏電泳30min，紫外觀察并拍照記錄。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)及結(jié)果判定PCR技術(shù)的注意事項(xiàng)防止污染，建立良好的質(zhì)量控制，避免污染。引物設(shè)計(jì)合理Taq酶擴(kuò)增錯(cuò)誤率較高，大約1/100對(duì)堿基/20個(gè)循環(huán)鎂離子濃度對(duì)反應(yīng)效率的影響儀器穩(wěn)定性，升降溫速率，管子的密合度等設(shè)置對(duì)照：PCR反應(yīng)針對(duì)模板有陽性/陰性對(duì)照陽性：驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系和條件的正確性陰性：驗(yàn)證PCR反應(yīng)有無污染PCR技術(shù)的應(yīng)用基因克隆、測(cè)序和表達(dá)等法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定遺傳性疾病檢測(cè)、腫瘤診斷、病原體檢測(cè)等基因克隆和表達(dá)DNA指紋技術(shù)11984年英國的遺傳學(xué)家AlecJeffreys在進(jìn)行肌紅蛋白的DNA序列研究時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)非功能DNA（不產(chǎn)生蛋白的DNA）上重復(fù)著一種小片段DNA，這一含15個(gè)左右堿基的DNA片段，在不同個(gè)體間重復(fù)的頻率及位置有明顯的不同，Jeffreys首先在自己的DNA上進(jìn)行研究，驗(yàn)證了這一技術(shù)，如果我們有血緣關(guān)系，這些不同會(huì)大大縮小。Jeffreys命名這一技術(shù)為DNA指紋技術(shù)（DNAfingerprint）。DNA指紋技術(shù)2采集血樣（毛發(fā)、精液、口腔粘膜細(xì)胞），分離DNA，用PCR將選定的DNA片段放大，并進(jìn)行對(duì)比，統(tǒng)計(jì)分析，便可得出是否為作案兇手或是否有血緣關(guān)系。分子診斷學(xué)分子診斷學(xué)是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)。分子診斷學(xué)的發(fā)展階段分子診斷學(xué)大致經(jīng)歷了3個(gè)階段：（1）利用DNA分子雜交技術(shù)進(jìn)行遺傳病的基因診斷；（2）