復(fù)雜先心病TGA的基因組學(xué)及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究培訓(xùn)課件

復(fù)雜先心病（TGA）的基因組學(xué)及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究

鐘詩龍博士副研究員廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心、廣東省心血管病研究所病因與致病機制不明確：包括遺傳與環(huán)境因素先天性心臟病在活產(chǎn)嬰兒中的發(fā)病率為8-14.6‰嚴(yán)重影響威脅人口素質(zhì)，給社會和家庭帶來極大負(fù)擔(dān)盡管介入與手術(shù)能有效治療先心病，但先心病的幾個關(guān)鍵問題還沒有解決確定病因，有效預(yù)防實現(xiàn)早期診斷疾病、明確疾病分類預(yù)測預(yù)后，進(jìn)行個體化干預(yù)闡明發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)治療靶標(biāo)隨著理論與技術(shù)的發(fā)展，基因組學(xué)研究在先心病研究中扮有重要作用。提綱基因組學(xué)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)；先心病的基因組學(xué)：染色體變異單基因突變；多基因突變TGA的基因組學(xué)及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究簡介DNAmRNA(messenger)ncRNAProteinRibosometranscriptiontranscriptiontranslationEpigenetics先心病的分子生物學(xué)基礎(chǔ)：中心法則序列變異

單核苷酸（突變、SNP和indel）結(jié)構(gòu)變異微星、拷貝數(shù)變異（CNV）亞染色體組整個染色體組或基因組提綱基因組學(xué)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)；常見先心病的基因組學(xué)：染色體變異單基因突變；多基因突變TGA的基因組學(xué)及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究簡介先心病的遺傳學(xué)染色體異常引起的合并先心病的綜合癥13三體

1:15,00018三體

1:5,00021三體(Downsyndrome) 1:80022q11缺失：法洛四聯(lián)癥、DiGeorge綜合征其他較少見的染色體缺失包括：9q34,1q21.1,16p11.2and17p11.2.Page85321三體-唐氏綜合癥產(chǎn)前診斷絨毛膜絨毛活檢>10/40Miscarriage1%Results:~1week羊膜腔穿刺>14/40Miscarriage0.5%Results:~3weeks

用高通量測序法檢測胎兒非整倍體ProcNatlAcadSciUSA.2008Dec23;105(51):20458-63BMJ.2011Jan11;342:c7401懷孕年齡35.4歲，取血樣時懷孕時間13周又1天提綱基因組學(xué)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)；常見先心病的基因組學(xué)：染色體變異單基因突變；多基因突變TGA的基因組學(xué)及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究簡介先心病的遺傳學(xué)基因突變引起的先心病基因綜合征心臟畸形TBX1基因DiGeorge綜合征主動脈離斷、永存動脈干（PTA）、法洛四聯(lián)癥（TOF）、右室雙出口和大動脈換位TBX5基因Holt-Oram綜合征心臟畸形包括房間隔缺損（ASD）、TOF和房室傳導(dǎo)阻滯等TFAP2β基因Char綜合征動脈導(dǎo)管未閉PTPN11基因Noonan綜合征胸部畸形和肺動脈狹窄（PS）NOTCH通路JAG1、NOTCH2基因突變Alagille綜合征動脈-肝臟發(fā)育不良、肺動脈流出道或外周肺動脈的狹窄HOLT-ORAM綜合征和TBX5基因Holt-Oram綜合征主要表現(xiàn)為肢體和心臟畸形，故又稱為心-手綜合征單倍體TBX5基因可導(dǎo)致Holt-Oram綜合征，TBX5基因突變也是人類首個在心臟間隔缺損畸形中找到的單基因突變。TBX5基因的錯義突變導(dǎo)致心臟或肢體的畸形則取決于其突變的位點單基因先心病的遺傳模式有一些顯示出明顯的孟德爾遺傳模型；有的顯性遺傳、有的隱性遺傳、有的伴性遺傳；有一些是為一個基因的結(jié)構(gòu)或功能的改變，即“單基因突變”；估計這種遺傳缺陷占8%；但是大部分的先心病是多基因突變的結(jié)果。提綱基因組學(xué)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)；常見先心病的基因組學(xué)：染色體變異單基因突變多基因突變TGA的基因組學(xué)及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究簡介與遺傳性心臟疾病相關(guān)的致病基因突變肥厚性心肌病擴張性心肌病致心律失常性右室心肌病長QT綜合癥Brugada綜合征基因發(fā)生%基因發(fā)生%基因發(fā)生%基因發(fā)生%基因發(fā)生%MYH712–20%LMNA2–6%PKP211–43%KCNQ130–35%SCN5A20–25%MYBPC320–28%MYH74–7%DSG27–26%KCNH225–30%GPD1LTNNT22–5%MYBPC33–7%DSP6–16%SCN5A5–10%CACNA1CTNNI31–3%TNNT21–4%DSC2KCNE1<1%CACNB2TPM11–3%SCN5A2–3%JUPKCNE2<1%SCN1BMYL21–3%LDB31–3%RYR2ANK2KCNE3ACTC1<1%PLN1–3%TGFB3KCNJ2SCN3BMYL3<1%ACTN2<4%TMEM43CACNA1CGLA<1%VCL<3%DESCAV3LAMP2<1%SGCD<3%SCN4BPRKAG2<1%CSRP3<2%AKAP9TNNC1DES<2%SNTA1MYH6TNNI3<1%MYO6TPM1<1%TTNACTC1<1%CSRP3TCAP<1%MYOZ2ABCC9<1%VCLCTF1<1%TCAPTNNC1ACTN2MYH6LDB3TTNPLNTAZJPH2EMDTTRLAMP2MYLK2PSEN1CAV3PSEN2MTTIEYA4致病基因突變的發(fā)現(xiàn)有助于基因診斷如對有肥厚性心肌病的母親進(jìn)行基因檢測，可以預(yù)測其子女的風(fēng)險。但是如何決策?基因突變用于診斷與預(yù)測——對遺傳性心血管病家庭進(jìn)行遺傳學(xué)檢測的決策樹CaleshuCetal.Heart2010;96:1669-1675檢測先心病患者致病突變可能致病突變未知功能突變陰性或良性突變檢測沒有發(fā)病家族成員陽性結(jié)果遺傳咨詢臨床監(jiān)護(hù)陰性結(jié)果無危險無需進(jìn)一步檢測基因診斷檢測：益處與風(fēng)險益處風(fēng)險基因診斷檢測可以:確定胎兒或個體是否處于遺傳疾病的風(fēng)險當(dāng)胎兒處于風(fēng)險是，可以是父母和醫(yī)生考慮盡早作出產(chǎn)前診斷性選擇。檢測結(jié)果也可以:使個人和家人難于決斷；可能負(fù)面影響家庭穩(wěn)定性和個人關(guān)系基因突變用于預(yù)測預(yù)后：

雙基因突變對肥厚性心肌病模型小鼠生存的影響有2個致病基因突變的個體比只含1個突變的家族性肥厚性心肌病病人更易發(fā)生嚴(yán)重的心衰Circulation.2008;117:1820-1831肥厚性心肌病模型小鼠目前已知的基因突變僅能部分解釋先心病發(fā)病率：以肥厚性心肌病為例對80個不相關(guān)的先癥者進(jìn)行7個HCM基因(b-MHC,MyBP-C,cTnT,cTnI,ACTC,MYL2,andMYL3)作基因突變檢測在23個先癥者中檢測到26個基因突變，發(fā)生率為(29%)以往的研究主要集中在候選的信號通路或基因在全基因組范圍全面發(fā)現(xiàn)新的先心病的致病基因突變，闡明其遺傳傳遞規(guī)律，并系統(tǒng)地揭示其致病機制成為目前全世界研究重點。JMedGenet2005;42:e59提綱基因組學(xué)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)；常見先心病的基因組學(xué)：染色體變異單基因突變多基因突變TGA的基因組學(xué)及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究簡介外顯子組測序發(fā)現(xiàn)完全性大動脈轉(zhuǎn)位（TGA）的致病基因突變及其致病機制研究TGA流行病學(xué)TGA是新生兒期最常見的紫紺型先天性心臟病，發(fā)病率為0.2‰-0.3‰，約占先天性心臟病總數(shù)的5％-7％，男女患病之比為2-4：1。若不治療，約90％的患者在1歲內(nèi)死亡。TGA嚴(yán)重影響威脅人口素質(zhì)，給社會和家庭帶來極大負(fù)擔(dān)。TGA解剖與功能分類TGA+IVSTGA+VSDTGA+AoCoa(RVOTO)TGA+PS(LVOTO)在病理上：大動脈轉(zhuǎn)位時，主動脈瓣下圓錐發(fā)達(dá)，未被吸收，主動脈位于左前上方；肺動脈瓣下圓錐萎縮，肺動脈位于作后下方。發(fā)病原因及其發(fā)病機制目前還不清楚。以往的研究主要集中在與體軸形成有關(guān)的信號通路或基因發(fā)現(xiàn)了一些TGA致病基因變異：CFC1、GDF1、NODAL等NODAL信號通路與左右體軸形成有關(guān)TGA的致病基因突變基因位置突變類型CFC1exon4splicedonorsiteIVS4DSDUPGDF1exon3CYS227TERFOXH1exon1Pro21SerNODALexon29-BPINSERTION/24-BPDELETION,NT700

Donorsplicesiteofintron2IVS2DS,G-A,+1

exon3IVS2-1G→CMED13Lexon6752A-G\GLU251GLY

exon255615G-A、ARG1872HIS

exon286068A-G\ASP2023GLYZIC3exon21741A-T,LYS-TER

exon1763T-G,TRP255GLY

exon1GLY17CYSNKX2.5exon2VAL150ILE這些突變不足以解釋TGA的高發(fā)病率；尤其在中國人中：我們在28個TGA患者及10個家系成員中沒有檢測到這些突變科學(xué)問題能否在全外顯子組范圍找到引起TGA的致病基因突變？它們在父代與子代之間的傳遞規(guī)律如何？明確其傳遞規(guī)律將為早期診斷提供TGA分子預(yù)警的標(biāo)記。通過系統(tǒng)生物學(xué)的方法識別基因組中關(guān)鍵節(jié)點基因及其網(wǎng)絡(luò)，對于致病基因突變的機制研究具有方向性指導(dǎo)作用。高糖對致病基因突變有沒有協(xié)同作用？全基因組外顯子測序（EXOMESEQUENCING）外顯子組測序是一種新型的基因組分析技術(shù)，只需針對外顯子區(qū)域的DNA即可，能夠發(fā)現(xiàn)位于編碼區(qū)的SNPs和小的InDels。因此與全基因組重測序相比，外顯子組測序更加簡便、經(jīng)濟、高效，已成為現(xiàn)階段基因測序工作的重心權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析是一種用于解析分子作用機制和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的系統(tǒng)生物學(xué)方法。它充分利用基因表達(dá)的內(nèi)在信息，把高度關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄子聚類成一族，稱作一個模塊(module)，然后識別與臨床相關(guān)的模塊，最后用模塊內(nèi)連通性（intramodularconnectivity）和基因重要性（genesignificance）識別信號通路上關(guān)鍵調(diào)控基因（Hubgenes）。網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Tools:Pearsoncorrelation,SoftthresholdingRationale:makeuseofinteractionpatternsbetweengenes模塊識別Tools:TOM,HierarchicalclusteringRationale:module-(pathway-)basedanalysis找到模塊代表性基因Tools:eigengene(1stPrincipalComponent)?Rationale:Condenseeachmoduleintooneprofile進(jìn)一步分析模塊相關(guān)性，模塊重要性、析因分析等.第一部分：全基因組外顯子測序?qū)ふ襎GA的致病錯義基因突變1.篩選階段完全性大動脈轉(zhuǎn)位患者(12例)Agilent全外顯子捕獲＋Solexa測序生物信息學(xué)分析注釋和統(tǒng)計分析、排除非基因、內(nèi)含子、同義突變、已知SNP

潛在致病突變Sanger測序排除沒有驗證的潛在致病突變

TGA患者150例包括核心家系50個健康志愿者500例基因型與表型是否發(fā)生共分離驗證潛在致病突變2.驗證階段TGA主動脈瓣下圓錐組織權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析TGA肺動脈瓣下圓錐組織TGA肺動脈瓣下圓錐與干下型肺動脈瓣下圓錐的差異模塊干下型患者的肺動脈瓣下圓錐組織TGA的關(guān)鍵信號通路及關(guān)鍵節(jié)點基因TGA主動脈瓣下圓錐與干下型肺動脈瓣下圓錐的差異模塊TGA的差異模塊1.權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析識別TGA的關(guān)鍵信號通路及關(guān)鍵節(jié)點基因，第二部分：致病錯義基因突變的分子機制野生型致病基因P19細(xì)胞功能Nodal信號應(yīng)答突變型致病基因基因突變