DB50T 1298-2022 奇異變形桿菌和普通變形桿菌雙重Real-Time PCR檢測方法　　

ICS65.020CCSB41DB50重慶市市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB50/T1298—2022前言 Ⅱ 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 14縮略語 15檢測原理 16儀器設備 17試劑材料 28方法步驟 28.1樣品采集 28.2運輸與保存 28.3細菌分離 28.4檢測 39結果判定 310生物安全要求 3附錄A（規(guī)范性)試劑的配制 4DB50/T1298—2022本文件按照GB/T1.1－2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件的某些內容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由重慶市農業(yè)農村委員會提出、歸口并組織實施。本文件起草單位：重慶市畜牧科學院。本文件主要起草人：楊睿、蔣雨、付利芝、王孝友、李成洪、覃志初、許國洋、付文貴、陳朝洪、馮剛。1DB50/T1298—2022奇異變形桿菌和普通變形桿菌雙重Real-TimePCR檢測方法本文件規(guī)定了奇異變形桿菌和普通變形桿菌的雙重Real-TimePCR檢測方法的檢測原理、儀器設備、試劑材料、方法步驟、結果判定和生物安全要求。本文件適用于奇異變形桿菌和普通變形桿菌的鑒別檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求。GB/T6682分析實驗用水規(guī)格和實驗方法。3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義4縮略語下列縮略語適用于本文件。GN增菌液：革蘭陰性菌增菌液（GramNegativeBacteriaBroth）SS培養(yǎng)基：沙門志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SalmonellaShigellaagar）Real-TimePCR：實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-TimePolymeraseChainReaction）5檢測原理采用Real-TimePCR技術對奇異變形桿菌（Proteusmirabilis）的UreR基因和普通變形桿菌（Proteusvulgaris）的blaB基因進行檢測，能有效地鑒別檢測奇異變形桿菌與普通變形桿菌。UreR基因是奇異變形桿菌的尿素酶調節(jié)基因，而在普通變形桿菌中沒有；blaB基因是普通變形桿菌的β-內酰胺酶調節(jié)基因，但在奇異變形桿菌中不存在。針對奇異變形桿菌的UreR基因和普通變形桿菌的blaB基因，分別設計了特異性引物和探針，通過Real-TimePCR技術在FAM通道和HEX通道分別檢測奇異變形桿菌和普通變形桿菌。6儀器設備6.1熒光定量PCR儀：同時有FAM和HEX通道。6.2分析天平：精度為±0.1g。6.3高速冷凍離心機。6.4恒溫培養(yǎng)箱。6.5振蕩培養(yǎng)箱。6.6超凈工作臺。6.7微量可調移液器（2.5μL、10μL、100μL、1000μL）及配套帶濾芯吸頭。6.8－80℃低溫冰箱和常規(guī)醫(yī)用冰箱。6.9超純水儀。2DB50/T1298—20226.10恒溫水浴鍋。6.11組織研磨儀。6.12二級生物安全柜。7試劑材料本文件所使用的水應符合GB/T6682中規(guī)定的二級水要求。7.1GN增菌液應按附錄A中A.1的要求配制。7.2SS培養(yǎng)基應按附錄A中A.2的要求配制。7.3營養(yǎng)肉湯應按附錄A中A.3的要求配制。7.4商品化的細菌基因組提取試劑盒。7.5商品化的熒光定量2TaqPCRMasterMix。7.6采樣袋、試管、三角瓶、離心管（1.5mL）、PCR8連管或96孔板、封口膜。7.7引物和探針應按照表1合成。7.8陽性對照為奇異變形桿菌標準菌株（中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，CVCC4106）、普通變形標準菌株（中國醫(yī)學細菌菌種保藏管理中心，CMCC49027）；陰性對照為去離子水。8方法步驟8.1樣品采集固體樣品（腸道內容物、糞便和環(huán)境樣本等）等放入無菌的采樣袋內，并在采樣袋外面標識出時間、地點和具體的樣品名稱。液體樣品（尿液、飲水和膿液等）用無菌注射器吸取1mL～2mL液體樣本到2mL離心管中，并標識出時間、地點及具體的樣品名稱。8.2運輸與保存4℃冷藏，24h內送實驗室檢測。8.2運輸與保存4℃冷藏，24h內送實驗室檢測。表1檢測奇異變形桿菌和普通變形桿菌的引物和探針檢測菌株核苷酸序列（5'→3'）奇異變形桿菌上游引物：CCATCAGATTATGTCATTCAA下游引物：GAGGAAAATGCAATTTATCTTTAFAM探針：FAM-CACACCCTACCCAACATTCATTTCA-BHQ1普通變形桿菌上游引物：AAAGAGCCTGAATTAAATAC下游引物：ATCACCACTACCGGTTTTATCHEX探針：HEX-ATTCATGGTGATCCTCGTGATACTA-BHQ18.3細菌分離8.3.1增菌培養(yǎng)固體樣品：無菌取1g～2g，剪碎、研磨，加入到裝有50mLGN增菌液的三角瓶中，37℃,120r/min振搖培養(yǎng)18h～24h。液體樣品：無菌取1mL～2mL，加入到裝有50mLGN增菌液的三角瓶中，37℃,120r/min振搖培養(yǎng)18h～24h。3DB50/T1298—20228.3.2細菌分離用接種環(huán)取1環(huán)增菌液，劃線接種于SS瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，4℃放置4h，挑取大小1mm～2mm、邊緣無色半透明、中心多呈黑色、表面光滑圓形或橢圓形菌落1個～2個，接種到裝有4mL營養(yǎng)肉湯的試管中，37℃振搖培養(yǎng)12h，4℃保存?zhèn)溆谩?.3.3DNA提取可采用煮沸法提取細菌DNA：首先取待測菌液1mL，5000g離心5min，棄上清液；然后加入1mL去離子水，渦旋震蕩30s混勻，再次5000g離心5min，棄上清液；最后加入100μL去離子水，渦旋震蕩30s混勻，100℃水浴10min，冷卻后放入－80℃保存，備用。也可以采用商品化的細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA，提取的DNA模板－80℃保存，備用。8.4檢測8.4.1反應體系組成反應體系見表2，使用商品化熒光定量2TaqPCRMasterMix。8.4.2反應參數(shù)95℃預變性30s；95℃變性5s，56℃退火10s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)。在延伸階段分別收集FAM和HEX熒光信號。表2TaqManReal-TimePCR反應體系2TaqPCRMasterMix259結果判定FAM通道用于檢測奇異變形桿菌；HEX通道用于檢測普通變形桿菌；當實驗中的陰陽性對照同時成立時可用下列方法判定檢測結果。陽性對照：FAM通道的CT值≤30且擴增曲線為典型的“S”型，則結果判定為奇異變形桿菌陽性對照成立；當HEX通道的CT值≤30且擴增曲線為典型的“S”型，則結果判定為普通變形桿菌陽性對照成立；陰性對照：測定FAM和HEX通道，無典型的“S”型擴增曲線，則結果判定為陰性。陽性結果判定：當FAM通道的CT值≤30且擴增曲線為典型的“S”型，則結果判定為奇異變形桿菌陽性；當HEX通道的CT值≤30且擴增曲線為典型的“S”型，則結果判定為普通變形桿菌陽性；可疑結果判定：測定FAM和HEX通道，30＜CT值≤35，則結果判定為可疑，需要重復檢測一次，如果重測結果仍然為可疑則判定為陽性；如果重測結果無典型的“S”型擴增曲線則判斷為陰性。陰性結果判定：測定FAM和HEX通道，無典型的“S”型擴增曲線，則結果判定為陰性。10生物安全要求4DB50/T1298—2022人員防護、實驗廢棄物處置等按照GB18489的規(guī)定執(zhí)行。5DB50/T1298—2022（規(guī)范性）試劑的配制A.1GN增菌液GN增菌液配制成分見表A.1，配好后，加蒸餾水1000mL加熱攪拌溶解后，加入1mol/LHCl調節(jié)溶液的pH值至7.0±0.1，115℃高壓滅菌15min。表A.1GN增菌液配制成分表組份胰蛋白胨葡萄糖1甘露醇2檸檬酸鈉5去氧膽酸鈉0.5磷酸氫二鉀4磷酸二氫鉀氯化鈉5A.2SS培養(yǎng)基SS培養(yǎng)基配