牛結(jié)核重組表達抗原的ELISA診斷方法研究

序號：編碼：“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽決賽作品申報書作品名稱：牛結(jié)核重組表達抗原的ELISA診斷方法研究學(xué)院名稱：獸醫(yī)學(xué)院申報者姓名（集體名稱）：王小然吳超周秋蟬類別：√自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文 □哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報告和學(xué)術(shù)論文□科技發(fā)明制作A類□科技發(fā)明制作B類

說明1.申報者應(yīng)在認(rèn)真閱讀此說明各項內(nèi)容后按要求詳細(xì)填寫。2．申報者在填寫申報作品情況時只需根據(jù)個人項目或集體項目填寫A1或A2表，根據(jù)作品類別（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文、哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報告和學(xué)術(shù)論文、科技發(fā)明制作）分別填寫B(tài)1、B2或B3表。所有申報者可根據(jù)情況填寫C表。3．表內(nèi)項目填寫時一律用打印，字跡要端正、清楚，此申報書可復(fù)制。4．序號、編碼由競賽組委會填寫。5．學(xué)術(shù)論文、社會調(diào)查報告及所附的有關(guān)材料必須是中文（若是外文，請附中文本），請用4號楷體打印在A4紙上，附于申報書后，字?jǐn)?shù)在8000字以內(nèi),調(diào)查報告類每篇在15000字以內(nèi)。6．其他參賽事宜請向校團委咨詢。聯(lián)系電話：85283396，電子郵箱：xtw@

A2．申報者情況（集體項目）說明：1.必須由申報者本人按要求填寫；2.申報者代表必須是作者中學(xué)歷最高者，其余作者按學(xué)歷高低排列；3.本表中的學(xué)籍管理部門簽章視為對申報者情況的確認(rèn)。申報者代表情況姓名王小然性別女出生年月1985年11月學(xué)院獸醫(yī)學(xué)院系別、專業(yè)、年級動物醫(yī)學(xué)05級學(xué)歷本科學(xué)制5入學(xué)時間2005年作品名稱牛結(jié)核重組表達抗原的ELISA診斷方法研究畢業(yè)論文題目通訊地址廣東省廣州市天河區(qū)五山華南農(nóng)業(yè)大學(xué)華山8棟410郵政編碼510642辦公電話85280233常住地通訊地址廣東省廣州市天河區(qū)五山華南農(nóng)業(yè)大學(xué)華山8棟410郵政編碼510642住宅電話87344890其他作者情況姓名性別年齡學(xué)歷所在單位周秋嬋女22本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)華山獸醫(yī)學(xué)院吳超女19本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)華山獸醫(yī)學(xué)院資格認(rèn)定學(xué)院學(xué)籍管理部門意見以上作者是否為2009√是□否（學(xué)院蓋章）2009年03院、系負(fù)責(zé)人或?qū)熞庖姳咀髌肥欠駷檎n外學(xué)術(shù)科技或社會實踐活動成果?！淌恰醴褙?fù)責(zé)人簽名：2009年03

B1．申報作品情況（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文）說明：1．必須由申報者本人填寫；2．本部分中的科研管理部門簽章視為對申報者所填內(nèi)容的確認(rèn)；3．作品分類請按作品的學(xué)術(shù)方向或所涉及的主要學(xué)科領(lǐng)域填寫；4．碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱作品分類（D）A．機械與控制（包括機械、儀器儀表、自動化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術(shù)（包括計算機、電信、通訊、電子等）C．?dāng)?shù)理（包括數(shù)學(xué)、物理、地球與空間科學(xué)等）D．生命科學(xué)（包括生物、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、健康、衛(wèi)生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學(xué)、化工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路2008年4月，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新活動項目申請開始，我們得到羅滿林教授的支持以牛結(jié)核重組表達抗原的ELISA診斷方法研究為題向?qū)W校申請并通過，經(jīng)過實驗，取得了預(yù)想的結(jié)果，并將研究過程撰寫成文。充分利用專業(yè)知識，經(jīng)過查閱相關(guān)知識，我們對牛結(jié)核病的現(xiàn)狀以及所利用的檢測方法有了深入的了解，認(rèn)識到間接ELISA方法是牛結(jié)核病檢測的新方法，有一定的研究價值。在傳染病教研室各位老師和師兄師姐的指導(dǎo)幫助下，我們利用實驗室提供的純化的ESAT6CFP10融合蛋白（rEC），通過濃度測定后建立ELISA方法，經(jīng)阻斷試驗、交叉試驗、重復(fù)性試驗，表明該方法特異性強、重復(fù)性好。對15份PPD皮試陽性的血清和75份PPD皮試陰性的血清進行檢測，檢驗結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，ELISA檢出陽性8份,ELISA與PPD皮試的陽性符合率為46.7%，陰性符合率為98.7%，兩者總符合率為90%，表明此方法可以做為PPD皮試診斷的一個補充。作品的科學(xué)性、先進性及獨特之處本項目的特色在于利用了純化的ESAT6CFP10融合蛋白(rEC)作為包被抗原建立間接ELISA方法。在牛分枝桿菌所特有的抗原中，ESAT6和CFP10是開發(fā)鑒別免疫牛與感染牛的首選診斷抗原。它們都由位于結(jié)核分枝桿菌群及少數(shù)幾種致病性分枝桿菌RD1區(qū)中的基因所編碼，而編碼這兩種蛋白的基因在所有BCG株中和絕大多數(shù)非致病性分枝桿菌中缺失，所以其作為診斷抗原特異性比結(jié)核菌素好。兩者均為免疫優(yōu)勢抗原，可以誘導(dǎo)強烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，刺激牛分枝桿菌再感染小鼠的記憶性效應(yīng)T細(xì)胞增殖及大量IFNγ的產(chǎn)生（HarboeMetal，1996；DillonDCetal，2000），同時能刺激機體產(chǎn)生特異性IgG。本試驗選擇ESAT6、CFP10以融合的形式在大腸埃希氏菌中實現(xiàn)高效表達，可以克服單一抗原免疫原性有限，混合抗原組成“雞尾酒”存在著每一抗原蛋白要分別表達和純化、耗時費力、蛋白抗原配比不均,難于進行診斷抗原的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)等問題。同時ESAT6、CFP10在基因位置上相互鄰近，又同時轉(zhuǎn)錄，在氨基酸水平上有一定的相關(guān)性，且均在細(xì)菌培養(yǎng)濾液蛋白（CFP）中出現(xiàn)，因而在功能上可能相互作用，所以選取兩種基因融合的表達抗原進行ELISA診斷方法研究。本試驗所表達并純化的雙抗原融合蛋白可以直接作為一種新型的皮膚試驗抗原、IGRA刺激抗原或血清學(xué)試驗的診斷抗原。重組技術(shù)表達的抗原，可以在保持敏感性的同時，提高反應(yīng)的特異性，并且可以檢測大量樣品。本試驗所表達并純化的雙抗原融合蛋白可以直接作為一種新型的皮膚試驗抗原、IGRA刺激抗原或血清學(xué)試驗的診斷抗原。本研究用原核表達的ESAT6CFP10基因做ELISA檢測，優(yōu)勢在于能鑒別BCG免疫牛與自然感染牛，且融合抗原能提高檢測敏感性。研究結(jié)果顯示，建立的ELISA方法特異性強，重復(fù)性好。ELISA在牛結(jié)核病檢測中還屬于初步應(yīng)用，本項目具有先進性、新穎性、實用性和挑戰(zhàn)性。作品的實際應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義結(jié)核?。═uberculosis）是由分支桿菌屬（Mycobacterium）的3個種，即結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）、牛分支桿菌（M.bovis）和禽分支桿菌（M.avium）引起人和動物共患的一種慢性傳染病。該病曾廣泛流行于世界各國，造成的危害和損失十分驚人。為此，各國政府十分重視結(jié)核病的防治，曾經(jīng)有所平緩。近年來，由于種種原因，結(jié)核病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，已屬各傳染病死亡人數(shù)之首。結(jié)核桿菌隨鼻汁、痰液、糞便和乳汁等排出體外，污染飼料、飲水、空氣和周圍環(huán)境，使其在人畜之間相互傳播，而人畜結(jié)核病的交叉?zhèn)鞑t造成了它的廣泛流行。結(jié)核病對人、畜健康的危害,其公共衛(wèi)生學(xué)意義已受到廣泛關(guān)注。動物的結(jié)核病以牛結(jié)核（Bovinetuberculosis）危害最大，它主要由牛分支桿菌引起，如果陽性率按2％計算，每頭牛按2000元計算，造成的直接經(jīng)濟損失可達50億元人民幣以上。據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計，在人結(jié)核病發(fā)病率不斷上升的情況下，牛結(jié)核病在近年來也有所抬頭，流行態(tài)勢相當(dāng)嚴(yán)峻。早在1960年世界衛(wèi)生組織專家委員會第七次會議中便指出:“在那些還存在著牛結(jié)核病問題的國家中，人類始終受到它的威脅，除非著手消滅牛結(jié)核病，否則人類結(jié)核病的控制是不會成功的”。牛結(jié)核病是一種慢性進行性傳染病，大多數(shù)牛不呈顯性感染或僅到晚期才出現(xiàn)臨床癥狀，故早期臨床診斷不易獲得準(zhǔn)確結(jié)果。病理學(xué)檢查可以根據(jù)特征病變確診，但必須在死亡或宰殺后進行；病原學(xué)檢查是最確實的方法之一，但所需周期長，約38周，陽性率不高，所以常常不被實際工作所采用。目前臨床上應(yīng)用最廣泛的是PPD(提純的結(jié)核菌素蛋白衍生物,其中包括蛋白、脂肪類和糖類以及核苷酸等多種抗原成分)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，美國就是采用撲殺結(jié)核變態(tài)反應(yīng)陽性牛而消滅了牛結(jié)核病。它的技術(shù)要求不高、操作相對簡單，但是工作量大、周期較長，部分研究者發(fā)現(xiàn)，該法存在著極強的非特異性反應(yīng)，即在相當(dāng)數(shù)量的結(jié)核變態(tài)反應(yīng)陽性牛中，既找不出特征病變，又不能分離出結(jié)核桿菌，或僅僅分離出非典型的分支桿菌，而且妊娠母牛仍然檢出率低，在重復(fù)檢疫時陽性率下降，需付出極大代價才能控制以至消滅牛結(jié)核，因此在實際工作中用于診斷牛結(jié)核病并不十分理想。另外聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)自1983年Mullis等發(fā)明以來，顯示出了靈敏度高、特異性強、快速等特點，近年來有了較多應(yīng)用，但也要注意克服實驗過程中的可能出現(xiàn)的假陽性和假陰性問題。因此有必要建立更多的新型診斷方法和實施對牛、野生動物進行免疫接種的探索。隨著研究的不斷深入，人們逐漸把研究方向轉(zhuǎn)到血清學(xué)診斷上來，在此過程中分別采用了凝集反應(yīng)(Ag)、補體結(jié)合反應(yīng)(CF)、瓊脂凝膠擴散試驗(AGID)、免疫電泳(CIEP)、免疫熒光(IFA)、放射免疫等方法檢測抗體，用淋巴細(xì)胞增生試驗、干擾素試驗檢測細(xì)胞免疫物質(zhì)。但這些檢測方法，有的檢出率不高，有的設(shè)備昂貴，故難以在實際工作中應(yīng)用。酶免疫技術(shù)是用酶標(biāo)記抗體或抗原，以酶促反應(yīng)指示免疫反應(yīng)的一類測定相應(yīng)抗原或抗體的性質(zhì)、含量及其分布部位的方法，酶免疫技術(shù)具有標(biāo)記物穩(wěn)定性好，無放射性污染等優(yōu)點，還可以利用催化標(biāo)記物進行放大和自動化分析處理。ELISA(EnzymelinkedImmunosorbentAssay)作為一種新型的檢測方法，特異性高，敏感性強，不需特殊設(shè)備，一次可檢測大批標(biāo)品，48小時即可出結(jié)果，是當(dāng)前發(fā)展最快，最容易，試劑盒也應(yīng)用最廣的一項新技術(shù)，從而倍受廣大醫(yī)務(wù)人員的關(guān)注。本研究根據(jù)國內(nèi)外研究水平和進展，為了提高牛結(jié)核病檢疫的特異性，提出牛結(jié)核的診斷新方法，即純化的ESAT6CFP10融合蛋白(rEC)作為包被抗原建立間接ELISA方法，為新技術(shù)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。相信該技術(shù)的開發(fā)成功，將有助于提高我國牛結(jié)核的檢疫技術(shù)水平，加快我國和世界其他國家牛結(jié)核檢疫方法的接軌，同時減少養(yǎng)牛生產(chǎn)場（者）的經(jīng)濟損失，對我國結(jié)核病的防控做出更大貢獻。學(xué)術(shù)論文文摘以純化的ESAT6CFP10融合蛋白(rEC)作為包被抗原建立間接ELISA方法以檢測牛結(jié)核病，經(jīng)阻斷試驗、交叉試驗、重復(fù)性試驗,表明該方法特異性強、重復(fù)性好，對15份PPD皮試陽性的血清和75份PPD皮試陰性的血清用建立的ELISA方法檢測，結(jié)果ELISA檢出陽性8份,ELISA與PPD皮試的陽性符合率為46.7%，陰性符合率為98.7%，兩者總符合率為90%，且所用ESAT6、CFP10基因只在少數(shù)幾種致病性分枝桿菌具有，而在所有BCG株中和絕大多數(shù)非致病性分枝桿菌中缺失，所以可以作為鑒別診斷抗原，可以作為PPD皮試診斷的一個補充。Abstract:AnindirectELISAwasestablishedusingthepurifiedfusionproteinasthediagnosticantigentodiagnoseBT,TheELISAassaywasconfirmedtohavegoodspecificityandreproducibilitythroughcrossreactionassay、blockingtestandtherepetitivenesstest.15positiveserumsamplesand75negativeserumsamplesdetectedbyPPDwereexaminedbyELISA.8serumsampleswerepositive,ThepositivecoincidenceratesofELISAwithPPDwere46.7%,andthenegative98.7%,thetotalcoincidenceratewas90%.ForESAT6andCFP10areencodedbygenesofafewpathogenicMycobacteria whichweredeletedfromthegenomesofallstrainsofBCGandnonpathogenicMycobacteria.sotheycanbeusedasdifferentialdiagnosisantigens,andtheELISAassaycanbetakenasasupplementofPPDtesting.作品在何時、何地、何種機構(gòu)舉行的會議上或報刊上發(fā)表及所獲獎勵暫無鑒定結(jié)果經(jīng)指導(dǎo)老師羅滿林教授鑒定，并通過與之前的研究成果對照鑒定，證明所建立的檢測牛結(jié)核病的間接ELISA方法特異性強、重復(fù)性好。對15份PPD皮試陽性的血清和75份PPD皮試陰性的血清用建立的ELISA方法檢測，結(jié)果ELISA檢出陽性8份,ELISA與PPD皮試的陽性符合率為46.7%，陰性符合率為98.7%，兩者總符合率為90%。結(jié)果與前面做此研究的結(jié)果相近，因此可以作為PPD皮試診斷的一個補充，用來檢測牛結(jié)核病。請?zhí)峁τ诶斫狻彶?、評價所申報作品具有參考價值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻的檢索目錄【1】《分子克隆實驗指南》第三版【2】郭設(shè)平,劉思國,王春來等.檢測牛結(jié)核抗體新型ELISA方法的建立及應(yīng)用.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2007,29(10):810812【3】魯俊鵬,羅滿林,鄒濰力等.牛分枝桿菌重組MPT83蛋白間接ELISA方法的建立.中國獸醫(yī)科學(xué)，2007,37(3):236240【4】吳波,張書環(huán),鄧銓濤等.牛分枝桿菌特異性四聯(lián)融合蛋白在牛結(jié)核病診斷中的臨床應(yīng)用.中國人獸共患病學(xué)報,2007,23(11):11231126【5】HarboeM,OettingerT,WikerHG,etal.EvidenceforoccurrenceoftheESAT6proteininMycobacteriumtuberculosisandvirulentMycobacteriumbovisandforitsabsenceinMycobacteriumbovisBCG.InfectMycobacandImmun,1996,64(1):1622【6】DillonDC,AldersonMR,DayCH,etal.MolecularandImmunologicalcharacterizationofmycobacteriumtuberculosisCFP10,animmunodiagnosticantigenmissinginMycobacteriumbovisBCG.JClinMicrobiol.2000,38(9):32853290申報材料清單（申報論文一篇，相關(guān)資料名稱及數(shù)量）申報論文：牛結(jié)核重組表達抗原的ELISA診斷方法研究科研管理部門簽章年月日C.當(dāng)前國內(nèi)外同類課題研究水平概述說明：1.申報者可根據(jù)作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評審。1980年Grange的研究表明，結(jié)核病牛血清抗體IgG與正常水平差異明顯，從理論上闡明了通過檢測血清中抗體來診斷結(jié)核病的可能性。1990年由Wood等建立IFNγ診斷法，原理是致敏的淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下，接受特異性抗原(如PPD,ESAT6等)刺激而活化，表達并分泌IFNγ，再以ELISA對培養(yǎng)上清中的IFNγ進行定量測定。該法屬于細(xì)胞免疫范疇，操作比較繁瑣，技術(shù)要求高，費時費力，成本較高，采集后血樣試驗必須在8h內(nèi)進行。目前雖己有檢測試劑盒出售，但價格昂貴，不能在基層推廣。PCR方法近年來在檢測牛結(jié)核病方面有應(yīng)用，但是商品化試劑盒和各科研部門研制的方法檢測結(jié)果差異較大（NoredhoekGTetal,1996）。含有少量細(xì)菌的樣品降低了檢測結(jié)果的可靠性。由于去除污染的方法、DNA提取步驟、去除酶抑制劑技術(shù)、內(nèi)部和外部控制以及交叉污染的防止措施等差異使得結(jié)果千差萬別。該方法還需要標(biāo)注化和更加嚴(yán)格的操作步驟，以克服實驗過程中容易出現(xiàn)的假陽性或假陰性問題。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實驗室魯俊鵬，馬魁等分別用原核表達的MPT83、ESAT6建立間接ELISA方法以檢測牛結(jié)核病,經(jīng)阻斷試驗、交叉試驗、重復(fù)性試驗,表明該方法特異性強、重復(fù)性好。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)吳波等（2007）以原核表達的MPB70MPB83CFP10ESAT6融合蛋自作為診斷抗原，建立牛結(jié)核病抗體檢測間接ELISA，具有較高的靈敏度與特異性，與結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗符合率為87.32%。哈爾濱獸醫(yī)研究所郭設(shè)平等（2007）以蛋白MPT70MPT83ESAT6作為診斷抗原建立了間接ELISA方法，與PPD皮試結(jié)果比較，67份PPD皮試陽性血清樣品中有46份為ELISA檢測陽性，陽性符合率為68.7%，50份PPD皮試陰性牛血清都為陰性。陰性符合率為100%，ELISA方法與PPD皮試診斷方法總符合率為82.1%。D.推薦者情況及對作品的說明說明：1．由推薦者本人填寫；2．推薦者必須具有高級專業(yè)技術(shù)職稱，并是與申報作品相同或相關(guān)領(lǐng)域的專家學(xué)者或?qū)I(yè)技術(shù)人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對推薦者身份的確認(rèn)。推薦者情況姓名羅滿林性別男年齡51職稱教授工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)通訊地址廣州市天河區(qū)五山路華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院郵政編碼510642單位電宅電薦者所在單位簽章（簽章）2008年12請對申報者申報情況的真實性作出闡述情況屬實,可信度高。請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價本論文采用基因工程技術(shù)的方法，將牛分支桿菌兩種抗原基因融合并表達，以表達產(chǎn)物純化后作為診斷抗原，建立了ELISA的血清學(xué)檢測方法。通過一系列的試驗證明了該方法的敏感性、特異性和可重復(fù)性等，并與傳統(tǒng)的皮試變態(tài)反應(yīng)進行了比較。完善了牛結(jié)核病的診斷方法，反映了當(dāng)前的先進技術(shù)水平。建議進一步擴大數(shù)據(jù)，積累資料，以利于在生產(chǎn)中摔推廣應(yīng)用。其它說明推薦者情況姓名性別年齡職稱工作單位通訊地址郵編單位電話住宅電話推薦者所在單位簽章簽章日期年月日請對申報者申報情況的真實性作出闡述請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價其它說明

F．參賽作品打印處牛結(jié)核重組表達抗原的ELISA診斷方法研究王小然吳超周秋蟬指導(dǎo)老師：羅滿林（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院廣州510642）摘要：以純化的ESAT6CFP10融合蛋白(rEC)作為包被抗原建立間接ELISA方法以檢測牛結(jié)核病，經(jīng)阻斷試驗、交叉試驗、重復(fù)性試驗,表明該方法特異性強、重復(fù)性好，對15份PPD皮試陽性的血清和75份PPD皮試陰性的血清用建立的ELISA方法檢測，結(jié)果ELISA檢出陽性8份,ELISA與PPD皮試的陽性符合率為46.7%，陰性符合率為98.7%，兩者總符合率為90%，且所用ESAT6、CFP10基因只在少數(shù)幾種致病性分枝桿菌具有，而在所有BCG株中和絕大多數(shù)非致病性分枝桿菌中缺失，所以可以作為鑒別診斷抗原，可以作為PPD皮試診斷的一個補充。關(guān)鍵詞：ESAT6CFP10融合蛋白牛結(jié)核病間接ELISADevelopmentofanIndirectELISAVaccinesagainstMycobacteriumBovisWangxiaoranwuchaozhouqiuchan(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgricultrualUniversity,Guangzhou,510642,China)Abstract:AnindirectELISAwasestablishedusingthepurifiedfusionproteinasthediagnosticantigentodiagnoseBT,TheELISAassaywasconfirmedtohavegoodspecificityandreproducibilitythroughcrossreactionassay、blockingtestandtherepetitivenesstest.15positiveserumsamplesand75negativeserumsamplesdetectedbyPPDwereexaminedbyELISA.8serumsampleswerepositive,ThepositivecoincidenceratesofELISAwithPPDwere46.7%,andthenegative98.7%,thetotalcoincidenceratewas90%.ForESAT6andCFP10areencodedbygenesofafewpathogenicMycobacteria whichweredeletedfromthegenomesofallstrainsofBCGandnonpathogenicMycobacteria.sotheycanbeusedasdifferentialdiagnosisantigens,andtheELISAassaycanbetakenasasupplementofPPDtesting.Keywords:thepurifiedfusionproteinoftheESAT6CFP10genebovinetuberculosisindirectELISA牛結(jié)核病(bovinetuberculosis,BT)是主要由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的一種慢性消耗性病，在許多國家尤其是發(fā)展中國家仍廣泛流行，該病不僅給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，而且嚴(yán)重威脅著人類的身體健康。許多國家采用撲殺結(jié)核菌素（PPD）皮試陽性牛的防制策略，取得了疾病基本控制的效果。但多數(shù)發(fā)展中國家無法承受這種撲殺措施帶來的經(jīng)濟損失，有些發(fā)達國家還存在眾多的作為自然貯存宿主的野生動物，撲殺措施也無濟于事。此外PPD皮試還存在費時、費力，判定標(biāo)準(zhǔn)不易掌握及無法區(qū)分不同種分枝桿菌的感染等缺點。因此要控制牛結(jié)核病，有必要建立新型診斷方法。本研究對牛結(jié)核的診斷方法進行了探索。1材料與方法1.1材料1.1.1重組蛋白純化的rEC由傳染病學(xué)實驗室提供。1.1.2抗體及血清血清：經(jīng)檢測為陽性的牛結(jié)核病陽性血清，由農(nóng)業(yè)部青島動物檢疫所惠贈；ELISA診斷的牛血清樣品采自廣東某牛場。HRP標(biāo)記羊抗牛IgG酶標(biāo)二抗：購自晶美生物技術(shù)。1.1.3ELISA用耗材與試劑96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板或8孔酶標(biāo)板條。包被液（0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽緩沖液）：1.59gNa2CO3，NaHCO32.93g，準(zhǔn)確稱量后，溶于950mL的去離子水中，調(diào)pH值為9.6，定容至1L。PBST洗滌液：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O3.58g，KCl0.2g。準(zhǔn)確稱量后，溶于1L去離子水中，加0.5mLTween20，調(diào)解pH至7.4ELISA封閉液：PBST緩沖液中加10g/L的BSA。血清稀釋液：PBST緩沖液中加10g/L的BSA。酶標(biāo)二抗稀釋液：PBST緩沖液中加10g/L的BSA。0.1M檸檬酸：2.1g檸檬酸，加蒸餾水至100mL。0.2MNa2HPO4.12H2O：Na2HPO4.12H2O7.16g，加蒸餾水至100mL。底物緩沖液：48.6mL0.1mol/L的檸檬酸與51.4mL0.2mol/LNa2HPO4.12H2O混合。ELISA顯色液：底物緩沖液10mL溶解4mgOPD，加30%H2O215μL。終止液2MH2SO4：濃硫酸21.7mL，水178.3mL。1.1.4主要儀器電子分析天平，F(xiàn)A1604型上海天平儀器廠THZC恒溫振蕩器，金壇市富華儀器溫箱，JC303型上海金忠科學(xué)儀器1.2方法1.2.1純化蛋白的濃度測定純化蛋白進行SDSPAGE電泳分析，用紫外分光光度計測定樣品在260nm和280nm波長的光密度，按下式計算樣品中的蛋白質(zhì)含量：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=(1.45×OD280nm0.74×OD260nm)。1.2.2間接ELISA方法的建立間接ELISA方法的操作程序（1）包被將重組抗原用包被液稀釋到一定濃度，包被反應(yīng)板，100μL/孔，置4℃冰箱過夜，次日甩掉包被液，用PBST振搖洗滌反應(yīng)板3次，每次5min，300μL/（2）封閉加入封閉液，200μL/孔，置37℃溫箱2h，取出后甩掉液體，用PBST洗滌反應(yīng)板3次，每次5min（3）加血清將血清用血清稀釋液按一定倍數(shù)稀釋，加入到反應(yīng)板中，100μL/孔，每份樣品再重復(fù)1孔，同時設(shè)定陽性對照孔、陰性對照孔和空白對照孔，置37℃溫箱作用一定時間，取出后甩掉液體，用PBST（4）加酶標(biāo)二抗將酶標(biāo)二抗用二抗稀釋液按一定倍數(shù)稀釋，加入到反應(yīng)板中，100μL/孔，置37℃溫箱作用一定時間，取出后甩掉液體，用PBST（5）加底物溶液取現(xiàn)配制的底物溶液加入到反應(yīng)板中，100μL/孔，置37℃（6）加終止液取出反應(yīng)板，加入終止液終止反應(yīng)，50μL/孔。（7）酶標(biāo)儀測定用酶標(biāo)儀在單波長處測定每孔內(nèi)物質(zhì)的OD492nm值。（8）結(jié)果判定在對照成立的情況下，判定檢測血清樣品的陰陽性。間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件的確定.1重組抗原最適包被濃度和酶標(biāo)二抗最適稀釋倍數(shù)的確定將重組抗原用包被液分別作16μL/mL、8μg/mL、4μg/mL、2g/mL、1g/mL5個稀釋度；將酶標(biāo)二抗用二抗稀釋液分別作500、1000、2000、4000倍4個稀釋倍數(shù)，建立方陣；將陰陽性血清作40倍稀釋，每孔再重復(fù)2次（下同），進行ELISA反應(yīng)，選取陽性D655nm平均值為1.0左右、陰性D655nm平均值低、P/N.2血清最適稀釋倍數(shù)的確定抗原稀釋到最適濃度（4μg/mL）后包被反應(yīng)板，將陰陽性血清用血清稀釋液分別作10、20、40、80、160共5個稀釋倍數(shù)，酶標(biāo)二抗稀釋到最適倍數(shù)（1：1000），進行ELISA反應(yīng)，以確定血清最適稀釋倍數(shù)。.3抗原和血清、血清和二抗最適反應(yīng)時間的確定將抗原、血清、二抗作最適稀釋，抗原和血清的反應(yīng)、血清和二抗的反應(yīng)分別作15min、30min、45min、60min四個反應(yīng)時間，建立方陣，進行ELISA反應(yīng)，以確定抗原和血清、血清和二抗的最適反應(yīng)時間。判定標(biāo)準(zhǔn)的確定隨機抽取從無結(jié)核病牛場采集的結(jié)核陰性血清樣品30份，用已建立的間接ELISA方法檢測，記錄OD492nm值后進行樣本平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的計算。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，OD492nm值>X+3SD時，可以在99.9%的水平上判定為陽性。ELISA特異性試驗.1阻斷試驗將陽性血清和一定濃度的牛分枝桿菌菌體溶液混合，按抗原和血清的最適反應(yīng)時間37℃溫箱中作用，做五個復(fù)孔，進行ELISA.2交叉試驗按建立的ELISA操作步驟，用5份牛副結(jié)核病的陽性血清作ELISA，同時設(shè)立牛結(jié)核陽性血清、陰性血清和空白對照，記錄結(jié)果，同臨界值進行比較。ELISA重復(fù)性試驗.1批內(nèi)重復(fù)性試驗用同一批制備的重組抗原包被酶標(biāo)板，取5份抗體水平不同的血清，在同一時間內(nèi)，同一批試驗中按間接ELISA程序測定，每份血清平行作6孔，結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。.2批間重復(fù)性試驗取5份抗體水平不同的血清在4個不同時間按照間接ELISA程序測定，每份血清平行作5孔，結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。ELISA檢測方法與結(jié)核菌素試驗的比較對21份PPD皮試陽性的血清和68份PPD皮試陰性的血清用建立的間接ELISA程序檢測，對結(jié)果進行分析比較，計算兩者符合率。2結(jié)果與分析2.1間接ELISA實驗結(jié)果.1重組抗原最適包被濃度和酶標(biāo)二抗最適稀釋倍數(shù)的確定不同稀釋度的重組抗原和不同稀釋倍數(shù)的酶標(biāo)二抗作方陣試驗結(jié)果見表1.1。表1.1重組抗原最適包被濃度和酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定Table1.1ThedeterminationoftheoptimumworkconcentrationofantigensandhorseradishperoxidaselabeledgoatantibovineIgG抗原濃度（ug/mL）酶標(biāo)二抗工作濃度1：5001：10001：20001：400016P2.1472.0651.3941.4390.7890.7910.5040.505N0.4090.4330.2790.2920.1570.1680.0830.097P/N5.0024.9614.8625.6068P2.082.0921.4161.3980.7510.7840.4870.487N0.4060.4120.2390.2570.1410.1480.1070.1P/N5.15.6735.3114.7054P1.9251.8921.2951.2880.750.7540.4780.499N0.4120.4080.2210.2110.1240.1350.1140.129P/N4.6555.985.8074.0212P1.9541.7961.2261.2640.7740.7680.4270.489N0.3920.4020.2170.2250.1240.1160.1240.121P/N4.7235.6336.4253.7391P1.6251.6931.221.2010.7190.7160.4660.464N0.3770.3910.2240.210.1280.1130.1060.126P/N4.325.5785.9544.009注：P代表陽性血清；N代表陰性血清（Note：P：positiveserum；N：negativeserum）當(dāng)抗原包被濃度在從1μg/mL變化到16μg/mL時，陽性血清的OD492nm值逐漸增大，但是變化不明顯。而隨著二抗稀釋倍數(shù)的增大，血清的OD492nm值不斷降低，當(dāng)重組抗原的包被濃度為4μg/mL，酶標(biāo)二抗的稀釋度為1：1000，血清40倍稀釋時，陽性血清的OD492nm值在1.0左右，P/N值最高，為5.98。據(jù)此確定抗原的最適包被濃度為4μg/mL，酶標(biāo)二抗稀釋度為1：1000。2.2.1將抗原稀釋到4μg/mL，酶標(biāo)二抗稀釋1000倍，將陰陽性血清作不同稀釋倍數(shù)后進行ELISA反應(yīng)。結(jié)果見表1.2。隨著血清稀釋倍數(shù)的增大，血清的OD492nm值不斷降低，當(dāng)血清40倍稀釋時，陽性血清的OD492nm值接近1.0，P/N值最高。據(jù)此確定血清的最適稀釋倍數(shù)為40倍。表1.2血清最佳稀釋度的確定Table1.2Thedeterminationoftheoptimumworkconcentrationofserum血清稀釋倍數(shù)10204080160P1.8581.5781.2760.9880.7731.8361.5471.250.9790.808N0.3710.2880.2380.1980.1490.3750.3040.2120.1620.157P/N4.9585.2795.6135.4585.179

2.2實驗結(jié)果顯示，血清作用45min時，P/N值最大，見表1.3，所以血清最佳作用時間為45min。二抗作用45min時，P/N值最大，見表1.4，二抗最佳作用時間為45min。表1.3血清最佳作用時間的確定Table1.3Thedeterminationoftheoptimumreactiontimeofserum血清作用時間15304560P0.711.0921.2791.458N0.1550.1980.2240.296P/N4.585.535.724.926表1.4二抗最佳作用時間的確定Table1.4ThedeterminationoftheoptimumreactiontimeofHPRlabeledgoatantibovineIgG二抗作用時間（min）PNP/N150.6710.134.660301.1350.2385.218451.2490.2255.383601.3630.2835.3432.2.2隨機抽取從無結(jié)核病牛場采集的結(jié)核陰性血清樣品30份，用已建立的間接ELISA方法檢測，結(jié)果見表1.5。進行樣本平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的計算，X=0.211，SD=0.062。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，樣品臨界OD492nm值=X+3SD=0.397。為便于判定結(jié)果，確定陰陽性血清的臨界值為0.4，當(dāng)樣品OD492nm值≥0.4時，判定為陽性；樣品OD492nm值＜0.4時，判定為陰性。表1.5判定標(biāo)準(zhǔn)的確定Table1.5ThedeterminationoftheCriteriatodifferentiatebetweenthepositiveandthenegative編號OD值編號OD值編號OD值編號OD值編號OD值10.16870.243130.184190.326250.21520.24480.203140.190200.212260.25130.17990.265150.155210.201270.21740.241100.162160.367220.167280.22150.226110.123170.153230.211290.18960.386120.135180.173240.133300.19.3經(jīng)牛分枝桿菌菌體阻斷的陽性血清OD492nm值比未被阻斷對照組的陽性血清明顯低，阻斷率為77.2%。說明牛分枝桿菌抗原可以阻斷陽性血清和重組蛋白的反應(yīng)，反應(yīng)具有良好的特異性。結(jié)果見表1.6。表1.6阻斷試驗Table1.6blockingtest項目OD值平均OD值陽性血清1.4381.4541.4781.4771.4761.4646阻斷血清0.3210.3150.3140.3240.3950.3338阻斷率陽阻/陽=0.7722.2.3按建立的ELISA操作步驟，用5份牛副結(jié)核病的陽性血清作ELISA，同時設(shè)立牛結(jié)核陽性血清和陰性血清對照。對照成立情況下，牛副結(jié)核病陽性血清OD492nm平均值均小于0.4，即沒有交叉性。結(jié)果見表1.7。表1.7交叉試驗Table1.7Crossreactiontest血清號12345OD值0.2150.1310.1280.2610.19.45份血清在批內(nèi)經(jīng)6次重復(fù)性試驗結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，其變異系數(shù)在1.22～6.44%，小于10%，說明同一份樣品在同一批試驗中變異程度很小，具有較好的重復(fù)性。結(jié)果見表1.8。表1.8批內(nèi)重復(fù)性試驗Table1.8Repeatabilitytestinonebatch血清號OD值平均值SDCV11.4381.4541.4781.4771.4761.4650.0181.22%21.2351.2171.2651.2291.2451.2480.0181.45%30.4640.4520.4340.4450.4630.4490.0132.81%40.2390.2250.2120.2040.2120.2180.0146.30%50.2560.2290.2340.2250.2160.2320.0156.44%2.2.4取5份抗體水平不同的血清在4個不同時間按照間接ELISA程序測定，每份血清平行作5孔，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，其變異系數(shù)在2.02～12.00%，小于15%，說明同一樣品批間重復(fù)變異程度很小，具有較好的重復(fù)性。結(jié)果見表1.9。表1.9批間重復(fù)性試驗Table1.9Repetitivenesstestindifferentbatches血清號OD值平均值SDCV11.4381.4541.4781.4771.4761.4880.0815.42%1.4191.3281.4591.4441.4461.5621.5371.5751.5661.66321.2351.2171.2651.2291.2451.2520.0252.02%1.2341.2581.251.2271.2451.2691.3181.2461.2671.27930.4640.4520.4340.4450.4630.4640.0245.18%0.4360.4410.4460.4610.4710.5250.4780.4950.4730.46940.2390.2250.2120.2040.2120.2290.0187.96%0.2410.2290.2210.2080.2160.2760.2380.2310.2420.23550.2560.2290.2340.2250.2160.2480.03012.00%0.2330.240.2070.2250.2250.2840.2760.2830.2850.2982.2.5對15份PPD皮試陽性的血清和75份PPD皮試陰性的血清用建立的ELISA方法檢測，結(jié)果ELISA檢出陽性8份，共同陽檢數(shù)為7，共同陰檢數(shù)為74，ELISA與PPD皮試的陽性符合率為46.7%，陰性符合率為98.7%，兩者總符合率為90%，見表1.10。表1.10ELISA方法與結(jié)核菌素試驗的比較Table1.10parisionofELISAwithTuberculintest方法PPD皮試ELISA檢測檢測樣品數(shù)9090陽性數(shù)158共同陽檢數(shù)（陽性符合率）7（46.7%）共同陰檢數(shù)（陰性符合率）74（98.7%）總符合率90%總3討論在牛分枝桿菌所特有的抗原中，ESAT6和CFP10是開發(fā)鑒別免疫牛與感染牛的首選診斷抗原。它們都由位于結(jié)核分枝桿菌群及少數(shù)幾種致病性分枝桿菌RD1區(qū)中的基因所編碼，而編碼這兩種蛋白的基因在所有BCG株中和絕大多數(shù)非致病性分枝桿菌中缺失，所以其作為診斷抗原特異性比結(jié)核菌素好。兩者均為免疫優(yōu)勢抗原，可以誘導(dǎo)強烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，刺激牛分枝桿菌再感染小鼠的記憶性效應(yīng)T細(xì)胞增殖及大量IFNγ的產(chǎn)生（HarboeMetal，1996；DillonDCetal，2000），同時能刺激機體產(chǎn)生特異性IgG。本試驗選擇ESAT6、CFP10以融合的形式在大腸埃希氏菌中實現(xiàn)高效表達，可以克服單一抗原免疫原性有限，混合抗原組成“雞尾酒”存在著每一抗原蛋白要分別表達和純化、耗時費力、蛋白抗原配比不均,難于進行診斷抗原的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)等問題。同時ESAT6、CFP10在基因位置上相互鄰近，又同時轉(zhuǎn)錄，在氨基酸水平上有一定的相關(guān)性，且均在細(xì)菌培養(yǎng)濾液