環(huán)磷酰胺對(duì)sd大鼠卵巢功能減退模型的建立

環(huán)磷酰胺對(duì)Sd大鼠卵巢功能減退模型的建立

卵巢功能低下（dor）是?種臨床表現(xiàn)多樣、病因復(fù)雜、進(jìn)展緩慢的疾病。它指既往正常

的卵巢產(chǎn)生卵子的能力減弱，卵泡的質(zhì)量下降。引起DOR的病因很多，化療是目前已經(jīng)明

確的病因。環(huán)磷酰胺（CTX）是引起卵巢功能損害最大的化療藥物之一。臨床上長期周期

性使用CTX,可引起月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、早發(fā)性卵巢功能不全（POT）或卵巢早衰（POF）,

停藥后一段時(shí)間月經(jīng)可恢復(fù)，恢復(fù)的時(shí)間與用藥劑量和化療的時(shí)間有關(guān)°本研究采用適當(dāng)

劑量的CTX建立SD雌性大鼠DOR模型，以供實(shí)驗(yàn)研究使用。

1材料和方法

1.1主要材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物驅(qū)動(dòng)號(hào)

SPF級(jí)Spragne-Dawley（SD）成年大鼠，雌性，鼠齡12周，體質(zhì)量（230±10）g,由廣

東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)和動(dòng)物合格證號(hào)分別為SCXK（粵）2013-

0002和NO.44007200002182。本實(shí)驗(yàn)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室設(shè)施使用許可證號(hào):SYXK（粵）

2010-0059。

LL2病理圖像采集系統(tǒng)

JJ2000動(dòng)物電子秤，BS224s萬分之一電子天平，Bio-LW680酶標(biāo)儀，YD62型石蠟包埋

機(jī)，LeicaRM2235輪式切片機(jī)，LeicaTP1020型全自動(dòng)脫水機(jī),YD-AB型攤烘烤片機(jī)，

YD~6L型智能冰凍包埋機(jī)，ShandonGemini染色機(jī)，DHG-9203型電熱恒溫干燥鼓風(fēng)干燥箱,

OlympusDP2-BSW型病理圖像聚集系統(tǒng)，702超低溫冰箱。

1.1.3elisa,elisa,amh試驗(yàn)

注射用CTX（每支0.2g,購自山西普德藥業(yè)有限公司，批號(hào)04130301）。0.9%生理鹽水，

每支10mLo雌二醇（E2）EL1SA試劑盒（批號(hào)1306246）,促卵泡激素（FSH）ELISA試

劑盒（批號(hào)1306251）,促黃體生成素（LH）ELISA試劑盒（批號(hào)1304252）,抗苗勒氏激

素（AMH）ELISA試劑盒（批號(hào)1304171）,抑制素BCNHB）ELISA試劑盒（批號(hào)

1304261）,均購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2動(dòng)物的動(dòng)態(tài)周期

給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)光照（14h光照，10h黑夜），全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食，室溫20?

25℃,相對(duì)濕度45%?55'適應(yīng)性喂養(yǎng)7d,行陰道脫落細(xì)胞涂片觀察其性周期變化，選

取動(dòng)情周期為4?5d的大鼠120只開展實(shí)驗(yàn)。將動(dòng)物分為G1組(生理鹽水組，即空白對(duì)

照組)和G2組，每組60只。參照劉惠芬等

1.3動(dòng)情周期期

一般情況:每周觀察大鼠體質(zhì)量、精神、飲食、皮毛、排便及活動(dòng)情況。動(dòng)情周期:每天

08:30取自制細(xì)棉簽蘸取0.9%生理鹽水后，輕輕在大鼠陰道內(nèi)旋轉(zhuǎn)1周，行陰道涂片，用

95%乙醇固定5min,在顯微鏡下觀察細(xì)胞的種類和形態(tài)

1.4統(tǒng)計(jì)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以

2結(jié)果

2.1正常治療的一般情況

兩組大鼠觀察期間全部存活。G1組大鼠外觀體征、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、攝食、飲火、被

毛、呼吸、口、眼、鼻、耳、大小便形狀顏色等均正常。G2組大鼠給藥后出現(xiàn)被毛疏松、

活動(dòng)減少、精神不振、四肢無力等，第6、8周可恢復(fù)正常。

2.2ctx造模前后大鼠陰道涂片變化

G1組大鼠陰道涂片均有規(guī)則的動(dòng)情周期變化，周期4?5d,中位數(shù)4.5d,動(dòng)情間期二.5?

2.5d,中位數(shù)2d。G2組大鼠在CTX造模后第1、2、3、4周陰道涂片顯示動(dòng)情周期發(fā)生改

變，規(guī)則的動(dòng)情周期變化消失，延長7?16d,中位數(shù)lid。陰道涂片顯示分泌物少，有較

多散在的白細(xì)胞，少量上皮細(xì)胞，部分有少量的角化細(xì)胞和有核細(xì)胞，動(dòng)情間期5?7d,

中位數(shù)6d°造模后第6周基本恢復(fù)正常的動(dòng)情周期。

2.3周降低周、第8周第8周第8周第8周第8周第8周第8周第8

周感官評(píng)分

與G1組比較，G2組大鼠卵巢指數(shù)在造模后第1、2、3、4、6周明顯降低(P<0.01),第

8周無差異(P>0.05)oG2組造模后第3、4、6周較第1周明顯降低(P<0.05),第8周

較第1周無明顯變化(P>0.05)，見表周

2.4大鼠造模前后組織結(jié)構(gòu)的變化

顯微鏡下G1組大鼠卵巢可清楚地分為皮質(zhì)和髓質(zhì)兩部分，皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，各級(jí)卵泡及

黃體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)均完整，間質(zhì)腺少見，血管豐富，未發(fā)現(xiàn)間質(zhì)炎癥變化及纖維化等病變;

髓質(zhì)充盈，含有豐富的神經(jīng)、淋巴管和較多的血管，未見充血、變性壞死等異常改變。G2

組大鼠造模后從1周開始可見卵巢髓質(zhì)部分萎縮，皮質(zhì)明顯增生且纖維化樣變，顆粒細(xì)胞

層數(shù)減少，排列疏松，甚至空泡，原始卵泡、成熟卵范數(shù)減少，初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、閉

鎖卵泡增加。血管壁增厚，玻璃樣變，內(nèi)膜纖維化，肌層增厚，部分血管腔狹窄甚至消失。

從第4周開始，卵巢形態(tài)開始恢復(fù)，第8周卵巢形態(tài)部分恢復(fù)，原始卵泡減少，見圖1。

2.5血清amh、inhb水平

與G1組比較，G2組大鼠FSH在造模后第1、2、3、4、6、8周明顯升高(P<0.01);32組

大麻造模后第4、6、8周與第1周比較明顯降低(P<0.05),見表2。與G1組比較，G2

組大鼠LH在造模后第1、2、3、4、6周明顯升高(P<0.01),第8周無明顯變化

(P>0.05),見表3。G2組大鼠E2在造模后第1、2、3、4、6、8周較G1組明顯降低

(P<0.01);G2組大鼠造模后第4、6、8周與第1周比較明顯升高(P<0.05)，見表4。與

G1組比較，G2組大鼠血清AMH在造模后第1、2、3、4、6、8周明顯降低(P<0.01);G2

組大鼠造模后第3、4、6、8周與第1周比較明顯升高(P<0.05)，見表5。G2組大鼠

INIIB在造模后第1、2、3、4、6、8周較G1組明顯降低(P<0.01);G2組大鼠造模后第6、

8周與第1周比較明顯升高(P<0.05),見表6o

3ctx單次注射能制造sd大鼠離體卵巢功能損害

POI是女性在40歲之前卵巢衰退的臉床綜合征，以月經(jīng)紊亂(如停經(jīng)或稀發(fā)月經(jīng))伴有高

促性腺激素和低雌激素為特征

CTX是影響卵巢功能最大的化療藥物之一。它屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，作用于細(xì)胞

DNA而引起DNA單鏈或雙旌的斷裂，導(dǎo)致DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成受到抑制而使卵巢功能

損傷。長時(shí)間使用高劑量CTX,容易引發(fā)永久性卵巢損傷，繼而導(dǎo)致卵巢衰竭

DOR屬于POI、P0F的前期狀態(tài)，病情相對(duì)較輕，盡早治療，卵巢功能尚有機(jī)會(huì)恢復(fù)正常。

POF屬于卵巢衰竭終末期：卵巢功能基本不能逆轉(zhuǎn)。因此制造DOR動(dòng)物模型要求大鼠卵巢

功能有一定的損害，但又不能損害太嚴(yán)重.有學(xué)者

本研究發(fā)現(xiàn):在整個(gè)觀察期間，兩組造模大鼠無死亡，說明這種造模方法安全。CTX造模后

1、2、3、4周動(dòng)情周期延長7?16d,動(dòng)情間期延長5?7d;卵巢組織中原始卵泡、成熟卵

泡數(shù)減少，初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、閉鎖卵泡增加;卵巢指數(shù)在造模后第1、2、3、4、6周

明顯降低，F(xiàn)SH、LH在造模后第1、2、3、4、6周明顯升高，E2、AMH、INHB在造模后第1、

2、3、4、6、8周明顯降低。表明CTX75mg/kg單次腹腔注射用藥建立卵巢功能損害的大

鼠模型是成功的，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

造模后2周AMH較造模后1周稍有升高，造模后3周E2較造模前2周稍有升高，造模后4

周INHB較造模前3周梢有升高。造模后6周大鼠恢復(fù)規(guī)律的動(dòng)情周期，卵巢組織形態(tài)恢

復(fù)，但(下轉(zhuǎn)第2188頁)原始卵泡數(shù)減少。造模后第8周卵巢指數(shù)較前6周稍有升高。

說明CTX對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能損傷是肯定