2015免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

1、Commonly used immunological methods,Liu Kangkang ,免疫學(xué)試驗(yàn)方法,免疫,識(shí)別和清除抗原性異物,可能有利，也可能有害,免疫系統(tǒng)具有區(qū)別“自己”和“非己”的能力,免疫耐受,免疫應(yīng)答,免疫學(xué)檢測(cè)與免疫學(xué)技術(shù),一、抗原抗體的檢測(cè)技術(shù) 二、免疫細(xì)胞的檢測(cè) 三、細(xì)胞因子的檢測(cè)-ELISA 四、免疫組織化學(xué) 五、免疫印跡技術(shù) Western Blotting 六、 流式細(xì)胞術(shù) 七、PCR技術(shù) 八、基因沉默技術(shù),免疫學(xué)檢測(cè)是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計(jì)的一系列測(cè)定抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)手段及分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用。 免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用極為

2、廣泛，疾病的診斷、療效評(píng)價(jià)及理論研究等。,一、抗原抗體的檢測(cè)技術(shù),(一)細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)板 *準(zhǔn)備細(xì)胞計(jì)數(shù)器：70%乙醇 制備單個(gè)細(xì)胞懸液：貼壁細(xì)胞需胰酶消化 加樣 細(xì)胞計(jì)數(shù)：100倍鏡下觀察，“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”,二、免疫細(xì)胞的檢測(cè),對(duì)機(jī)體參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,計(jì)數(shù)及功能測(cè)定,細(xì)胞密度： 每毫升培養(yǎng)基中活細(xì)胞的個(gè)數(shù)=每個(gè)方塊內(nèi)細(xì)胞的平均數(shù)細(xì)胞稀釋比例104,1 mm20.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4cm3 = 10-4 ml,(二)免疫細(xì)胞功能的測(cè)定 1T細(xì)胞功能測(cè)定 （1）T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)：T細(xì)胞受到特異性抗原或有絲分裂原（PHA、ConA）刺激后可發(fā)生增殖，可

3、通過以下三種方法檢測(cè)。 1）形態(tài)計(jì)數(shù)法,2）3H-TdR或125I-UdR摻入法,放射性元素,wash,Stimulate,Assay,3）MTT（噻唑藍(lán)）比色法,MTT是一種可接受氫離子的淡黃色唑氮鹽染料，被活細(xì)胞線粒體呼吸鏈中的琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素還原，生成不溶于水的深紫色結(jié)晶產(chǎn)物甲簪。因此甲簪的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比。細(xì)胞增殖速度越快，則甲簪生成的量越多，吸光度越高；細(xì)胞毒性越大，則甲簪生成的量越少，吸光度越低。,1. 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，一般可在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。 2. 每孔加入100微升細(xì)胞懸液。細(xì)胞的數(shù)量取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮团囵B(yǎng)時(shí)間。增殖實(shí)驗(yàn)每孔通常加入103個(gè)以上數(shù)量

4、的細(xì)胞；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔至少加入5x103個(gè)或以上數(shù)量的細(xì)胞(具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等因素確定)。 3. 接種的細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)需要，送入細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。增殖實(shí)驗(yàn)通常要給予0-10微升特定的藥物或生長(zhǎng)因子進(jìn)行刺激。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)通常要給予0-10微升抑制因子或細(xì)胞毒藥物； 4培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20微升MTT溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育36小時(shí)； 5孵育結(jié)束后，每孔加入100微升甲簪溶解液，在37細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育，直至在鏡下觀察甲簪全部溶解。通常37孵育4小時(shí)左右，紫色結(jié)晶會(huì)全部溶解。如果紫色結(jié)晶較小較少，溶解的時(shí)間會(huì)短一些。如果紫色結(jié)晶較大較多，溶解

5、的時(shí)間會(huì)略長(zhǎng)。 6. 在570nm測(cè)定吸光度。如無570nm濾光片， 560-600nm范圍的濾光片均可使用。,MTT實(shí)驗(yàn)流程,（2）遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）的檢測(cè)：此方法為體內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞免疫功能的簡(jiǎn)便易行的皮試方法。其原理是外來抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答后，再用相同的抗原作皮試可導(dǎo)致遲發(fā)型超敏反應(yīng)，T細(xì)胞活化并釋放多種細(xì)胞因子，產(chǎn)生以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥，局部發(fā)生充血、滲出，于2448小時(shí)發(fā)生，72小時(shí)達(dá)到高峰。陽性反應(yīng)表現(xiàn)為局部紅腫和硬結(jié)，反應(yīng)強(qiáng)烈的可發(fā)生水腫，甚至壞死。,2B細(xì)胞功能測(cè)定 B細(xì)胞受多克隆激活劑或特異性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體。抗體可以在血漿和其他體

6、液中檢出，檢測(cè)抗體是測(cè)定B細(xì)胞功能的最主要的方法。 （1）B淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)：LPS或PWM刺激,（2）B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的檢測(cè)：,1）ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中抗體的量。 2）ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法）可檢測(cè)抗體分泌細(xì)胞，又可測(cè)定抗體分泌量的體外實(shí)驗(yàn)方法。 詳細(xì)見后述,3細(xì)胞毒試驗(yàn) 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)技術(shù)是檢測(cè)CTL、NK等細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞活性的一種細(xì)胞學(xué)技術(shù)。主要用于腫瘤免疫、移植排斥反應(yīng)和病毒感染等方面的研究。,Target cell,51Cr labeled,CTL,Target cell,Cr51 release,Assay,CTL,51Cr release,（1）放射性核素釋放法：(51

7、Cr、125IUdR),（2）乳酸脫氫酶釋放法：細(xì)胞受損，LDH釋放，LDH在催化乳酸生成丙酮酸的同時(shí)將NAD+還原成NADH。后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化氮唑藍(lán)(INT)或硝基氯化四氮唑藍(lán)(NBT)形成有色的甲簪類化合物，在490nm或570nm波長(zhǎng)處讀取的OD值，經(jīng)計(jì)算即可得NK細(xì)胞活性.,（3）MTT比色分析法,4吞噬功能測(cè)定 （1）硝基藍(lán)四氮唑試驗(yàn)：硝基藍(lán)四氮唑（NBT）是一種水溶性的淡黃色染料。由于在殺菌過程中產(chǎn)生反應(yīng)性氧中間物（ROI），其中超氧陰離子（O2-）能使被吞噬進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的NBT還原成不溶性藍(lán)黑色甲臜顆粒，沉積于胞漿中，光鏡下計(jì)數(shù)NBT陽性細(xì)胞

8、，可反應(yīng)中性粒細(xì)胞的吞噬功能。,（2）巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)：將待測(cè)巨噬細(xì)胞與某種可被吞噬又易于計(jì)數(shù)的顆粒性物質(zhì)（如雞紅細(xì)胞）混合溫育后，顆粒物質(zhì)被巨噬細(xì)胞吞噬，根據(jù)吞噬百分率即可反映巨噬細(xì)胞的吞噬能力。,三、細(xì)胞因子的檢測(cè),基礎(chǔ): 抗原或抗體的固相化 抗原或抗體的酶標(biāo)記 用途：目標(biāo)蛋白的定性或定量分析,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA三個(gè)必要試劑： （1）固相的抗原或抗體， 即免疫吸附劑（immunosorbent）; （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體， 稱為結(jié)合物（conjugate）； （3）酶反應(yīng)的底物。,a.包被 b.抗原

9、抗體反應(yīng) c.酶促反應(yīng),顯色 d.終止顯色，讀取數(shù)據(jù)。,ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過程：,對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)曲線：,陽性對(duì)照 陰性對(duì)照 定量測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 待測(cè)樣品的合理稀釋,用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型：,雙抗體夾心法測(cè)抗原（常用） 夾心法 雙抗原夾心法測(cè)抗體 間接法測(cè)抗體（常用） 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 競(jìng)爭(zhēng)法 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體 捕獲包被法測(cè)抗體 親和素-生物素 ELISA法,雙抗體（原）夾心法測(cè)抗體,Anti-HIV, Anti-HBs,雙抗體夾心法,雙抗原夾心法,HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2,雙抗體夾心法測(cè)抗原步驟,雙抗體夾心法測(cè)抗原特

10、點(diǎn),抗原濃度過高出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)（Hook effect）:所得結(jié)果將低于實(shí)際含量，嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心 。,間接法測(cè)抗體, 間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法。 原理：利用酶標(biāo)記的抗體檢測(cè)已與固相結(jié)合的 受檢抗體，故稱為間接法。, 操作步驟： （1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原，洗滌。 （2）加稀釋的受檢樣本，其中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物，孵育洗滌。 （3）加酶標(biāo)抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶，孵育洗滌。 （4）加底物顯

11、色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。,間接法的特點(diǎn),本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。 間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗體檢測(cè)相應(yīng)抗體。 間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)。若抗原中含有無關(guān)蛋白，也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法）,方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特異性B細(xì)胞。如果B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，抗體與班上的抗原結(jié)合。加入二抗和顯色劑就會(huì)顯色。一個(gè)斑點(diǎn)就代表一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。 此法的主要優(yōu)點(diǎn)是: 穩(wěn)定、特異，且抗原用量少； 與ELISA聯(lián)合使用，可同時(shí)檢測(cè)不同抗原誘導(dǎo)的抗體分泌，并可定

12、量測(cè)定； 可檢測(cè)組織切片中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞。,四、免疫組織化學(xué) Immunohistochemistry,原理：抗原抗體反應(yīng)，抗體標(biāo)記技術(shù)（熒光、酶） 用途：組織或細(xì)胞內(nèi)抗原的定性和定位,流程：,免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence ，IF）,定義：將免疫學(xué)方法（抗原抗體特異結(jié)合）與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。,原理：根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原（抗體）標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光標(biāo)記物作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見

13、熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。,結(jié)果判斷,設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照:陽性對(duì)照和陰性對(duì)照 陽性細(xì)胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型,Figure 3. mTNF induces infiltration of innate immune cells and angiostasis in tumors from TNFR1/ but not TNFR1/R2/ mice. and CD31+ (E and F) cells as indicated. G and H, for confocal microscopy analysis, tissue sect

14、ions were stained with Cy3-labeled anti-CD31 for blood vessel endothelial cells (green) and the VasoTACS in situ kit to detect apoptosis (red). Arrows, apoptotic endothelial cells in the tumor.,TNFR1/,TNFR1/TNFRR2/,成敗的關(guān)鍵因素： 組織的固定、包埋 抗體（特異性、濃度、孵育溫度和時(shí)間） 非特異性抗原的封閉 內(nèi)源性酶或自發(fā)熒光的消減 顯色,思考：為什么有的抗體能用于冰凍切片卻不能用于

15、石蠟切片？,五、免疫印跡技術(shù) Western Blotting（分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法）,一. 蛋白質(zhì)樣品的提取分離 二. 蛋白質(zhì)樣品的定量 三. 制備SDSPAGE膠 四. 轉(zhuǎn)移電泳及免疫印跡 五. 結(jié)果分析-用Western Blot 圖片灰度分析軟件 imageJ或Quantity One,免疫學(xué)三大工具比較,免疫熒光是融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結(jié)合）和熒光標(biāo)記技術(shù)，通過熒光激發(fā)，來對(duì)組織（細(xì)胞）內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究（主要是定位）。樣本是細(xì)胞或組織，要在顯微鏡下觀察結(jié)果，可能出現(xiàn)膜陽性、質(zhì)陽性和核陽性。 ELISA用到了免疫學(xué)原理和化學(xué)反應(yīng)顯色，待測(cè)的樣品多是血清、血漿、尿

16、液、細(xì)胞或組織培養(yǎng)上清液，因而沒有用到組織包埋、切片等技術(shù)，這是與免疫組化的主要區(qū)別，操作上 開始需要將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面，從而使后來形成的抗原-抗體-酶-底物復(fù)合物粘附在載體上，這就是“吸附”的含義。,免疫組化和ELISA所用到的原理大致相同，只是因?yàn)樗鶛z測(cè)的樣品不同，從而在操作方法上有所不同。ELISA多用于定量分析，其靈敏度非常高。 Western Boltting 先要進(jìn)行SDS-PAGE，然后將分離開的蛋白質(zhì)樣品用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用抗原-抗體-標(biāo)記物顯色來檢測(cè)樣品，可以用于定性和半定量。,ELISA與Western Blotting比較,WB可以看到特異性的條

17、帶，但是定量比較麻煩； ELISA可以直接讀出濃度，但是如果抗體有非特異性結(jié)合，那得到的數(shù)值就不可信； WB只能半定量,但是可以檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白,這點(diǎn)ELISA做不到； WB所檢測(cè)的一般是抗原，而ELISA抗原抗體都可以檢測(cè)； WB所檢測(cè)的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚體、降解產(chǎn)物等，一句話，WB可以確定所用抗體是與那種蛋白起作用的；而ELISA無能為力； WB一次處理量就是一塊膠版，10-20個(gè)樣品最多了。ELISA一塊96孔板一次可以處理96個(gè)樣本，可以設(shè)置多個(gè)復(fù)孔、對(duì)照、梯度樣等來提高檢測(cè)的可信度。,免疫共沉淀（Co-IP),用抗體將相應(yīng)特定分子沉淀的同時(shí)，與該分子特異性結(jié)合的其

18、他分子也會(huì)被帶著一起沉淀出來的技術(shù)。這種技術(shù)常用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間相互特異性結(jié)合。,六、流式細(xì)胞術(shù) (Flow Cytometric analysis),Beckman FC500流式細(xì)胞儀,測(cè)量對(duì)象大小: 懸浮在溶液中的相互離散顆粒 大小范圍：0.2m - 300 m 高等真核細(xì)胞,FCM的應(yīng)用特點(diǎn): （1）多參數(shù)定量分析每一個(gè)細(xì)胞； （2）細(xì)胞分選； 高純度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有細(xì)胞群、 單細(xì)胞克隆等。 （3）高通量（分析分選） 分析150,000個(gè)/ 秒 分選100,000個(gè)/秒,FCM的應(yīng)用,1、免疫功能研究 2、膜表面抗原和胞漿內(nèi)蛋白分析 3、DNA含量及細(xì)

19、胞周期分析 4、定量分析 5、細(xì)胞功能分析 6、凋亡研究 7、細(xì)胞間相互左右 8、細(xì)胞分選,FCM的主要測(cè)定指標(biāo),FSC, SSC, FL1, FL2, FL3, FL4 其中： FSC：反映細(xì)胞的大小 SSC：反映細(xì)胞內(nèi)顆粒性,外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（紅細(xì)胞溶解后）,流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析,SSC,FSC,可以通過設(shè)“門” (Gate)，分析、分選感興趣的細(xì)胞。,數(shù)據(jù)的存貯、顯示和分析,目前FCM所采用的都是多參數(shù)指標(biāo)，熒光參數(shù)標(biāo)記物最多可達(dá)4個(gè)，數(shù)據(jù)的存貯采用列表排隊(duì)方式，可節(jié)省存貯空間。 數(shù)據(jù)的顯示常用以下幾種方式： 散點(diǎn)圖 直方圖 等高線圖 密度圖 三維圖,散點(diǎn)圖(Dot Plot)

20、 X坐標(biāo)為該細(xì)胞一參數(shù)相對(duì)含量，Y坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的含量，可以將細(xì)胞亞群分開。,直方圖(Distribution Histogram) 橫坐標(biāo)代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度，單位是道數(shù)，可以是線性或?qū)?shù)坐標(biāo)。 縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)。,FCM標(biāo)記方法,單標(biāo)（一種單抗/tube）： FL1, FSC, SSC（三參數(shù)） 雙標(biāo)（兩種單抗/tube）： FL1, FL2, FSC, SSC（四參數(shù)） 三/四標(biāo)（三種單抗/tube或四種單抗/tube）： FL1-FL3/4, FSC, SSC,熒光抗體的選擇,首選直接標(biāo)記抗體 熒光分子：PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原 FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原

21、PerCP APC FITC PE 間接標(biāo)記：適用范圍廣，biotin-avidin不適合 弱抗原的檢測(cè),實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì),空白對(duì)照：ALL（樣本） 陰性對(duì)照：常用同型抗體對(duì)照（同型+樣本） 單色分析：設(shè)同型抗體對(duì)照 多色分析：同型對(duì)照，單陽性對(duì)照（用于儀器校正） 陽性對(duì)照：在實(shí)驗(yàn)過程中如涉及到表達(dá)缺失或減少的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照組，其設(shè)置方法與陰性對(duì)照設(shè)置相同,FCM樣品來源,需要制備細(xì)胞懸液 血液、體液等液體樣品 培養(yǎng)的細(xì)胞 活體組織樣品 冰凍組織 固定的組織樣品,直接應(yīng)用 分離后使用,七、RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法,是指對(duì)組織或細(xì)胞的總RNA進(jìn)行抽提，把RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后設(shè)計(jì)目的基因引

22、物進(jìn)行PCR，瓊脂糖電泳并數(shù)碼拍照，分析電泳條帶灰度值，判斷目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)量的變化。,RT-PCR流程簡(jiǎn)介,一、抽提RNA,1、防止RNA酶污染 180的高溫下干烤6hr以上； 0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗； 去污劑洗滌，雙蒸水沖洗； 溶液皆用0.1% DEPC水配置，試劑應(yīng)為新開封或RNA專用； 操作人員戴手套； 器械專用。,2、材料的準(zhǔn)備 組織及細(xì)胞最好為新鮮的，或者在70條件下保存半年以下； 盡量避免材料的凍融 。,3、確認(rèn)RNA的質(zhì)量 檢測(cè)RNA溶液的吸光度： OD260/OD280=1.82.0 RNA的電泳圖譜： 28S和18S條帶明亮、清晰、指條帶邊緣清晰

23、，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上。,二、反轉(zhuǎn)錄,單管一步法 反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)在一個(gè)管子中完成 ，得到的全部cDNA產(chǎn)物都一起經(jīng)PCR擴(kuò)增 ，靈敏度更高，但是容易相互干擾 。 兩步法 反轉(zhuǎn)錄和PCR分開做，PCR取反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的1/10進(jìn)行，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，但是靈敏度不如前者高。,三、PCR,1、參照基因 PCR 參照基因一般選擇看家基因（長(zhǎng)表達(dá)、高表達(dá)量的基因），常用18S、actin、bubulin、GAPDH，其中ACTIN最為普遍； 2、目的基因 PCR 典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)，引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。,61,RNA 干擾 (RNA interference, RNAi):由小雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。 小干擾RNA: 具有干擾功能的這種短雙鏈RNA就稱為小干擾RNA（Small interfering RNA,siRNA)。,基本概念,八、基因沉默原理與技術(shù),62,靶,RNAi 機(jī)制,siRNA在ATP參與下形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC），被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中的反義鏈指導(dǎo)移至靶mRNA，靶mRNA被切割后誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng)。,外源長(zhǎng)dsRNA在ATP作用下被RNase Dicer切割成21nt左右