藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證解析

1、第四章 藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證,4.1 定量分析樣品的前處理方法,概述 含金屬或鹵素的藥物，在分析前需要經(jīng)過不同方法處理后，方可進(jìn)行測定。處理方法因金屬或鹵素在分子中結(jié)合的牢固程度而異。,一、含鹵素有機(jī)藥物的分析,含鹵素有機(jī)藥物系指藥物分子結(jié)構(gòu)中所含鹵素直接與芳環(huán)或脂肪鏈相連者，而不包括某些有機(jī)藥物的鹵酸鹽或氫鹵酸鹽,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：CX,（一）鹵原子的活潑性,1. 鹵原子與碳原子直接相連，鹵原子的活潑性和它直接相連的烴基的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系,（1）乙烯型鹵和芳鹵 不活潑,（2）烯丙型鹵和芐鹵 活潑,（3）鹵代烷型 介于兩者之間,2. 分子中所含鹵原子的個(gè)數(shù),分子中所含鹵原子的個(gè)數(shù)越多，活潑性越強(qiáng)，

2、特別是同一碳上含多個(gè)鹵原子或一個(gè)苯環(huán)上含多個(gè)鹵原子時(shí)，活潑性增強(qiáng)更加明顯,3. 鹵素的種類,IBrClF,常見的含鹵素有機(jī)藥物,三氯叔丁醇 防腐藥 鎮(zhèn)痛藥,六氯對(duì)二甲苯 廣譜驅(qū)蟲藥,泛影酸 X線造影劑,膽影酸 X線造影劑,碘他拉酸 X線造影劑,碘番酸 X線造影劑,碘苯酯 X線造影劑,鹽酸胺碘酮 抗心律失常藥,諾氟沙星 廣譜抗菌藥,醋酸氟輕松 腎上腺皮質(zhì)激素類藥，抗炎及抗過敏,磺溴酞鈉 實(shí)驗(yàn)診斷用藥 （肝功能）,（二）含鹵素有機(jī)藥物的分析,直接回流后測定法,堿性或酸性還原后測定法,氧瓶燃燒分解后測定法,1. 直接回流后測定法,本法是將含鹵素有機(jī)藥物溶于適當(dāng)溶劑（如乙醇）中，加入氫氧化鈉溶液（或一

3、定量過量的硝酸銀滴定液）后，加熱回流使其水解，將有機(jī)結(jié)合的鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)的鹵素離子，然后采用銀量法（Volhard法）測定。,本法適用于含鹵素有機(jī)藥物結(jié)構(gòu)中鹵素原子結(jié)合不牢固的藥物（如鹵原子和脂肪碳原子相連者）。,原理 三氯叔丁醇在NaOH溶液中加熱回流水解，氯元素全部轉(zhuǎn)變成NaCl， 用剩余滴定法，即于水解液中加HNO3酸化， 再加入定量過量的AgNO3滴定液，使Cl-生成AgCl沉淀， 過量的AgNO3，以Fe3+為指示劑，用NH4SCN液回滴定。,例：三氯叔丁醇的測定 ChP （2005）,（淡棕紅色）,(Ksp=1.561010 ),(Ksp=1.010-12 ),Fe3+ + SCN

4、 Fe (SCN) 2+,測定方法 取本品約0.1g，精密稱定，加乙醇5ml溶解后，加20%氫氧化鈉溶液5ml，加熱回流15min，放冷至室溫，加水20ml與硝酸5ml，精密加硝酸銀滴定液(0.1mol/L) 30ml，再加鄰苯二甲酸二丁酯5ml，密塞，強(qiáng)力振搖后，加硫酸鐵銨指示液2ml，用硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于6.216mg的C4H7Cl3O1/2H2O。,反應(yīng)摩爾比為13,T滴定度，每1ml滴定液相當(dāng)于被測組分的mg數(shù) c滴定液濃度，mol/L M被測物的摩爾質(zhì)量，g/mol n1mol樣品消耗滴

5、定液的摩爾數(shù)，常用反應(yīng)摩爾比體現(xiàn)，即反應(yīng)摩爾比為1n,2.經(jīng)氧化還原后測定法 (1)堿性還原后測定 鹵素結(jié)合于芳環(huán)上時(shí)，由于分子中碘的結(jié)合較牢固，需在堿性溶液中加還原劑（如鋅粉）回流，使碳-碘鍵斷裂，形成無機(jī)碘化物后測定。 (2)酸性還原后測定法,兩法均是將含鹵素有機(jī)藥物在堿性或酸性下，加還原劑（如鋅粉）加熱回流，藥物產(chǎn)生還原裂解反應(yīng)，使有機(jī)結(jié)合的鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)的鹵素離子，然后采用銀量法（Fajans法）測定。,本法適用于測定結(jié)構(gòu)中碘與苯環(huán)直接相連，且一個(gè)苯環(huán)上含多個(gè)碘原子的含鹵素有機(jī)藥物。,泛影酸,（1） 堿性還原后測定法,例 泛影酸的測定 ChP (2005),取本品約0.4g，精密稱定，

6、加氫氧化鈉溶液30ml與鋅粉1.0g，加熱回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗滌，濾過，燒瓶與濾器用水洗滌3次，每次15ml，洗液與濾液合并，加冰醋酸5ml與曙紅鈉指示液5滴，用硝酸銀滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于20.46mg的C11H9 I 3N2O4。,USP (24)、BP（1998）,ChP(2005)收載的膽影酸、碘番酸、膽影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法測定。,碘番酸,（2）酸性還原后測定法,取本品的干燥品約0.4g，精密稱定，加鋅粉1g及冰醋酸10ml，加熱回流30min，放冷，冷凝管用水30ml洗滌，用脫脂棉過濾，燒瓶與

7、脫脂棉用水洗滌2次，每次20ml，洗液與濾液合并，加四溴酚酞乙酯指示液1ml ，用硝酸銀滴定液(0.1mol/L)滴定。終點(diǎn)時(shí)黃色沉淀變?yōu)榫G色。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于19.031mg的C11H12 I 3NO2。,例 碘番酸的測定 JP (13),3. 氧瓶燃燒分解后測定法,（1）原理,氧瓶燃燒法：將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?，然后根?jù)欲測物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測定,適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機(jī)藥物的分析,本法特點(diǎn)是簡便、快速、破壞完全，尤其適用于微量樣品的分析,（ 2） 儀器與

8、材料,儀器裝置 燃燒瓶為500、1000或2000ml無色、磨口、厚壁、硬質(zhì)玻璃錐型瓶；瓶塞空心，底部熔封鉑絲一根，下端呈螺旋狀或網(wǎng)狀,稱樣用材料及稱樣 A. 固體樣品 無灰濾紙 B. 液體樣品 紙袋,C. 軟膏類樣品：將適量樣品置不含被測成分的蠟油紙中包裹嚴(yán)密，外層再用無灰濾紙包裹,氧瓶燃燒法裝置與樣品包裝操作圖,吸收液,A. 作用：吸收液的作用是將樣品經(jīng)燃燒分解所產(chǎn)生的各種價(jià)態(tài)的鹵素、硫、氮、硒等，定量地吸收并轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ǖ谋阌跍y定的價(jià)態(tài),氧氣,B. 吸收液的選擇,氟 水 氯 NaOH溶液 溴 H2O2-NaOH NaOH-硫酸肼飽和溶液 碘 NaOH硫酸肼飽和溶液 硫 NaOH或H2O2

9、硒 硝酸溶液,（3）操作方法,燃燒瓶燃燒前的準(zhǔn)備 用洗液洗凈后，按各藥品項(xiàng)下的規(guī)定加入吸收液，將瓶口用水濕潤，小心急速地通入氧氣1min，立即用表面皿覆蓋瓶口。 樣品的準(zhǔn)備 取樣品適量，精密稱定后按規(guī)定方法包裹，固定于鉑絲下端的網(wǎng)內(nèi)或螺旋處。,樣品的燃燒 點(diǎn)燃包有供試品的濾紙尾部，迅速放入燃燒瓶中，按緊瓶塞，加水少量封閉瓶口，俟燃燒完畢（應(yīng)無黑色碎片），充分振搖，使生成的煙霧完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量沖洗瓶塞及鉑絲，合并洗液及吸收液，同法另做空白試驗(yàn)。然后按各藥品項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測定。,根據(jù)被燃燒分解的樣品量選用適宜大小的燃燒瓶。,（4）注意事項(xiàng),ChP（20

10、05）規(guī)定的燃燒瓶體積為500、1000或2000ml三種，采用常量或半微量分析,正確選用燃燒瓶的目的在于： 樣品能在足夠的氧氣中燃燒分解完全； 有利于將燃燒分解產(chǎn)物較快地吸收到吸收液中； 防止爆炸的可能性。,測定含氟有機(jī)藥物時(shí)，用石英制 燃燒瓶,鉑絲燃燒時(shí)起催化作用,應(yīng)同時(shí)做空白試驗(yàn),燃燒時(shí)要注意防爆,燃燒要完全,燃燒產(chǎn)生的煙霧完全被吸收,（5）應(yīng)用,例 磺溴酞鈉的含量測定 ChP (2005),燃燒分解,O2,HBr + Na2S + Na2SO4 + ,溴 取本品約0.2g，照氧瓶燃燒法（附錄 C）進(jìn)行有機(jī)破壞，選用1000ml燃燒瓶，以0.4%氫氧化鈉溶液10ml，濃過氧化氫溶液0.5

11、ml與水10ml作為吸收液，俟生成的煙霧完全吸入吸收液后，用水稀釋至100ml，煮沸5分鐘，放冷，加稀硝酸使成酸性，精密加硝酸銀滴定液（0.1mol/l）20ml，搖勻，再加硫酸鐵銨指示液2mL，用硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1mL硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于7.990mg的溴(Br)。,例 碘苯酯的含量測定 ChP（2005）,原理 碘苯酯系有機(jī)碘化物，用氧瓶燃燒分解，轉(zhuǎn)變?yōu)榈饣?，繼而氧化為游離的I2，并被定量地吸收于吸收液中，和NaOH反應(yīng)，生成I-與IO3-，加入Br2-CH3COOH溶液，使全部轉(zhuǎn)變?yōu)镮O3- ，過量的溴以HCOO

12、H及通空氣去除。加入KI，使與IO3-反應(yīng)析出游離I2，用Na2S2O3液滴定， I2與淀粉結(jié)合所顯的藍(lán)色消失即為終點(diǎn),取本品約20mg，精密稱定，照氧瓶燃燒法進(jìn)行有機(jī)破壞，用氫氧化鈉試液2ml與水l0ml為吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液(取醋酸鉀10g，加冰醋酸適量使溶解，加溴0.4ml，再加冰醋酸使成1000m1)l0ml，密塞，振搖，放置數(shù)分鐘，加甲酸約lml，用水洗滌瓶口，并通入空氣流約35min以除去剩余的溴蒸氣，加碘化鉀2g，密塞，搖勻，用硫代硫酸鈉滴定液(0.02 mol/L)滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每lml的硫代硫酸

13、鈉滴定液(0.02mol/L)相當(dāng)于1.388mg的C19H29IO2。,滴定度的計(jì)算 放大反應(yīng),2mol碘苯酯1molI2 1molI21molNaIO+1molNaI 1molNaIO1/3molNaIO3+2/3molNaI,即2mol碘苯酯2molNaIO3,2mol NaIO3+10I-6molI2,即2mol碘苯酯1molI2 6molI212molI12molNa2S2O3,反應(yīng)摩爾比為16,98：140. 氧瓶燃燒法中的裝置有 A. 磨口硬質(zhì)玻璃錐形瓶 B. 磨口軟質(zhì)玻璃錐形瓶 C. 鉑絲 D. 鐵絲 E. 鋁絲,96：133（99x：138）選擇氧瓶燃燒法所必備的實(shí)驗(yàn)物品 A

14、. 磨口硬質(zhì)玻璃錐形瓶 B. 鉑絲 C. 普通濾紙 D. 氫氣 E. 無灰濾紙,99：76氧瓶燃燒法測定含氯有機(jī)藥物時(shí)所用的吸收液多數(shù)為 A. H2O2溶液 B. H2O2NaOH溶液 C. NaOH溶液 D硫酸肼飽和液 E. NaOH硫酸肼飽和液,99：134. 氧瓶燃燒法可用于 A. 含鹵素有機(jī)藥物的含量測定 B. 醚類藥物的含量測定 C. 檢查甾體激素類藥物中的氟 D. 檢查甾體激素類藥物中的硒 E. 芳酸類藥物的含量測定,二、含金屬有機(jī)藥物的分析,A. 含金屬的有機(jī)藥物 金屬原子不與碳原子直接相連，通常為有機(jī)酸及酚的金屬鹽或配位化合物，其分子結(jié)構(gòu)中的金屬原子結(jié)合不夠牢固 如酒石酸銻鉀、

15、葡萄糖酸銻鈉、富馬酸亞鐵,酒石酸銻鉀 抗血吸蟲病藥,硬脂酸鎂 醫(yī)藥片劑的潤滑劑和脫模劑,富馬酸亞鐵 抗貧血藥,葡萄糖酸銻鈉 抗寄生蟲藥，治療黑熱病,B. 有機(jī)金屬藥物 金屬原子直接與碳原子以共價(jià)鍵相連，結(jié)合比較牢固。在溶液中一般不解離成離子狀態(tài)。應(yīng)該根據(jù)共價(jià)鍵的牢固程度，經(jīng)適當(dāng)處理，將其金屬轉(zhuǎn)變?yōu)檫m于分析的狀態(tài)，方可進(jìn)行其金屬的鑒別或含量測定。 如卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利,卡巴胂 用于陰道滴蟲病及絲蟲病,醋酸苯汞 外用避孕藥,汞撒利 利尿及脫水藥，用于心臟性和肝性水腫,含金屬有機(jī)藥物定量分析前的處理方法,不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法 直接測定法;經(jīng)水解后測定法;經(jīng)還原-汞齊化后測定法 經(jīng)有機(jī)破壞的分

16、析方法 濕法破壞(硝酸-高氯酸法;硝酸-硫酸法;硫酸-硫酸鹽法等);干法破壞；氧瓶燃燒,（一）不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法,1. 直接測定法,適用于金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬有機(jī)藥物或某些CM鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物。 在水溶液中可以電離的藥物。,富馬酸亞鐵的含量測定 ChP (2005),取本品約0.3g，精密稱定，加稀硫酸 15ml，加熱溶解后，放冷，加新沸過的冷水50ml與鄰二氮菲指示液2 滴，立即用硫酸鈰滴定液(0.1mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml硫酸鈰滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于16.99mg 。,原理,Fe2+ + Ce4+ Ce3+ + Fe2+

17、,2. 用硫酸水解后測定法,例 硬脂酸鎂的測定 ChP（2005）,取本品約0.1g，精密稱定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L) 50ml，煮沸至油滴澄清，繼續(xù)加熱10min，放冷至室溫，加甲基橙指示液12滴，用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于2.016mg的MgO。,原理：,某些含汞有機(jī)藥物，由于CHg鍵不牢固，在水溶液（冰?。┲械渭恿蛩崾蛊渌?，將有機(jī)汞定量轉(zhuǎn)化成硫酸汞，再用硫氰酸銨滴定液滴定。,例 汞撒利的測定,取本品約0.5g，精密稱定，加蒸餾水10ml，置冰浴中，滴加硫酸10ml，隨滴隨攪拌，至產(chǎn)生的沉淀復(fù)溶解，再加蒸餾水5

18、0ml，硫酸鐵銨指示液2ml，用硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于25.29mg的汞撒利。,3. 經(jīng)還原-汞齊化后測定法,本法系在酸性或堿性溶液中，加鋅粉、加熱回流，將藥物中有機(jī)結(jié)合的汞還原析出金屬汞，并與過量的鋅生成鋅汞齊。將鋅汞齊溶于硝酸后，選用適當(dāng)?shù)姆椒y定汞的含量，并換算成含汞有機(jī)藥物的含量。,如 醋酸苯汞的含量測定 取本品約0.5g，精密稱定，置100ml燒瓶中，加水15ml，甲酸5ml與鋅粉1g，附回流冷凝器，煮沸30min。放冷，濾過，濾紙和鋅汞齊用蒸餾水洗滌至洗液對(duì)石蕊試紙不顯酸性反應(yīng)。將鋅汞齊溶解在稀硝酸(12)40ml中

19、，置蒸氣浴上加熱3min，加尿素0.5g和足夠的高錳酸鉀試液至顯桃紅色。冷卻后，加過氧化氫溶液脫色，加硫酸鐵銨指示劑lml，用硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)滴定，即得。每1ml硫氰酸銨液(0.1mol/1)相當(dāng)于16.84mg的C8H8O2Hg。,4.利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量 例如含銻和含鐵的藥物，在酸性溶液中可游離出具有氧化性的Sb5+ 、Fe3+氧化碘化鉀析出碘，用硫代硫酸鈉滴定。（間接碘量法）。,例 葡萄糖酸銻鈉的測定 ChP（2005） 取本品約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水100ml、鹽酸15ml與碘化鉀試液10ml，密塞、振搖后，在暗處靜置10min

20、，用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每lml的硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于6.088mg的Sb。,例 枸櫞酸鐵銨的測定 ChP（2005） 取本品約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中。加水15ml溶解后，加硫酸lml，加熱至溶液由暗棕色變成淡黃色，放冷至約15，滴加高錳酸鉀試液至溶液顯粉紅色并持續(xù)5s，加鹽酸15ml與碘化鉀試液15ml，密塞，靜置3min，加水50ml稀釋后，用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液2ml，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校

21、正。每lml的硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于5.585mg的Fe。,（二）經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法,適用于金屬原子與碳原子結(jié)合牢固的有機(jī)金屬藥物。 一般包括濕法破壞、干法破壞及氧瓶燃燒法三種方法。,（1）硝酸-高氯酸 消解,消煮時(shí)HNO3具有強(qiáng)的氧化力，熱的濃HClO4是最強(qiáng)的氧化劑和脫水劑，能將組分氧化成高價(jià)態(tài)。加熱時(shí)生成無水HClO4，可進(jìn)一步與有機(jī)質(zhì)作用，使有機(jī)物很快被氧化分解成簡單的可溶性化合物，二氧化硅則脫水沉淀。,HNO3-HClO4消解樣品是破壞有機(jī)物比較有效的方法，但要嚴(yán)格按照操作程序，防止發(fā)生爆炸。,1. 濕法破壞,本法適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞，有機(jī)金屬藥物

22、經(jīng)破壞后，得到的無機(jī)金屬離子一般呈高價(jià)態(tài)。 本法不能用于含氮雜環(huán)藥物的破壞。此時(shí)宜選用干法灼燒進(jìn)行破壞。 本法破壞能力強(qiáng)，反應(yīng)比較激烈。故進(jìn)行破壞時(shí)，必須嚴(yán)密注意切勿將容器中的內(nèi)容物蒸干，以免發(fā)生爆炸。,（2）硝酸-硫酸 消解,兩種酸都有較強(qiáng)的氧化能力，其中HNO3沸點(diǎn)低，而H2SO4沸點(diǎn)高（338）； 熱的濃H2SO4具有強(qiáng)的脫水能力和氧化能力，可以比較快地分解試樣，破壞有機(jī)物； 二者結(jié)合使用，可提高消解溫度和消解效果。,硝酸-硫酸 消解,常用的HNO3與H2SO4的比例為5:2，消解時(shí)，先將HNO3加入樣品中，加熱蒸發(fā)至小體積，稍冷，再加入H2SO4、HNO3，繼續(xù)加熱蒸發(fā)至冒大量白煙，冷

23、卻，加適量水，溫?zé)崛芙饪扇茺}，若有沉淀應(yīng)過濾。為提高消解效果，常加入少量H2O2。,硝酸-硫酸法適用于大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)的破壞，如染料、中間體或藥物等。破壞得到的無機(jī)金屬離子均為高價(jià)態(tài)。 本法不能用于含堿土金屬有機(jī)藥物的破壞 因堿土金屬可與硫酸形成不溶性的硫酸鹽，將會(huì)吸附被測定的金屬離子，使測定的結(jié)果偏低。 改用硝酸一高氯酸法,（3） 硫酸-硫酸鹽法 加入濃硫酸作氧化劑 加入硫酸鹽（硫酸鉀或硫酸鈉，因硫酸鈉為含水化合物，不利于有機(jī)破壞，故一般多采用硫酸鉀） 加入硫酸鹽目的： 提高硫酸的沸點(diǎn)，增強(qiáng)硫酸的氧化破壞能力，以使樣品破壞完全。 防止硫酸在加熱過程中過早地分解為三氧化硫而損失。 本法常用于含砷

24、或銻有機(jī)藥物的破壞，破壞得到的無機(jī)金屬離子多為低價(jià)態(tài)。,（4）硫酸-磷酸 消解,兩種酸的沸點(diǎn)都比較高，其中H2SO4氧化性較強(qiáng)，H3PO4能與一些金屬離子如Fe3+等絡(luò)合，故二者結(jié)合消解樣品，有利于測定時(shí)消除Fe3+等離子的干擾。,（5） 其它濕法 硝酸硫酸高氯酸法 硫酸氧化劑法（過氧化氫法、高錳酸鉀） 破壞后，金屬呈高價(jià)態(tài),該方法常用于測定汞的樣品。KMnO4是強(qiáng)氧化劑，在中性、堿性、酸性條件下都可以氧化有機(jī)物，其氧化產(chǎn)物多為草酸根，但在酸性介質(zhì)中還可繼續(xù)氧化。,硫酸-高錳酸鉀 消解,用濃H2SO4-H2O2氧化劑消煮植物樣品時(shí)，其中的有機(jī)物經(jīng)脫水碳化、氧化分解，變成CO2和水，使有機(jī)氮和磷

25、轉(zhuǎn)化為銨鹽和磷酸鹽，可在同一份消煮液中分別測定全氮、磷、鉀。,總氮、總磷、總鉀的測定，樣品的消化均采用H2SO4-H2O2消解法進(jìn)行消解。,硫酸-過氧化氫 消解,多元 消解法,為提高消解效果，在某些情況下需要采用三元以上酸或氧化劑消解體系，混合溶劑具有更強(qiáng)的溶解能力，應(yīng)用廣泛。,目的及前提,多元 消解法,硝酸-硫酸-五氧化二礬消解法,硝酸-氫氟酸-高氯酸消解法,硝酸-硫酸-高錳酸鉀消解法,鹽酸-硝酸-氫氟酸-高氯酸消解法,硝酸-硫酸-高氯酸消解法,注意事項(xiàng)： 1.濕法破壞所用的儀器，一般為硅玻璃或硼玻璃制成的凱氏燒瓶； 2.所用試劑及蒸餾水均不應(yīng)含有被測金屬離子或干擾測定的其他金屬離子等組分；

26、 3.由于整個(gè)操作過程所用礦酸量數(shù)倍于樣品，所以必須按相同條件進(jìn)行空白試驗(yàn)校正； 4.操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。,樣品的取用量，應(yīng)視被測含金屬有機(jī)藥物中所含金屬元素的量和破壞后所用測定方法而定。 含金屬元素量在10g一100g范圍內(nèi)時(shí)，取樣量為10g; 如果測定方法靈敏度較高，取樣量可相應(yīng)減少。 對(duì)于生物樣品，一般血樣10ml一15ml或尿樣50ml,2. 干法破壞,將有機(jī)物灼燒灰化以達(dá)分解的目的。 將適量樣品置于瓷、鎳、鉑坩堝中，常加無水碳酸鈉或輕質(zhì)氧化鎂等以助灰化， 混合均勻后，先小火加熱，使樣品完全炭化， 然后放入高溫爐中灼燒，使其灰化完全，即可。,適用于濕法不易破壞完全的有機(jī)物（如含氮雜

27、環(huán)類有機(jī)藥物）以及某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物。 不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）有機(jī)藥物的破壞,注意事項(xiàng)： （1）加熱或灼燒時(shí)，應(yīng)控制溫度在420以下 （2）一定要灰化完全 （3）經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但不要輕易棄去,4.3 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證,一、目的,證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測要求，方法驗(yàn)證過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)準(zhǔn)起草和修訂說明中。,二、用途,（一）藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草時(shí)，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證。,（二）藥物合成方法變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證。,三、需驗(yàn)證的分析項(xiàng)目,1. 鑒別試驗(yàn)； 2. 雜質(zhì)定量或限度檢查； 3. 原料

28、或制劑中有效成分含量測定； 4. 制劑中其它成分（降解產(chǎn)物、防腐劑等）的 測定； 5. 溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測試方法。,準(zhǔn)確度 精密度（重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性） 專屬性 檢測限 定量限 線性 范圍 耐用性,四、驗(yàn)證內(nèi)容,（一） 準(zhǔn)確度（accuracy） 準(zhǔn)確度是指用該方法測定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度。 測定結(jié)果與真實(shí)性的差異 用回收率R（recovery）表示 接近100% 相對(duì)恒定,測定回收率的具體方法可采用“回收試驗(yàn)法”和“加樣回收試驗(yàn)法”。,回收試驗(yàn) 空白+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測定，測定值為M,加樣回收試驗(yàn) 已準(zhǔn)確測定藥物含量P的真實(shí)樣品+已知量A

29、的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測定，測定值為M,數(shù)據(jù)要求 規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測定結(jié)果評(píng)價(jià)，如制備三個(gè)不同濃度樣品各測三次。 RSD一般在2%以內(nèi)。,1. 含量測定方法的準(zhǔn)確度,原料藥可用已知純度的對(duì)照品或樣品進(jìn)行測定，或用本法所得結(jié)果與已建立準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。,制劑可用含己知量被測物的各組分混合物進(jìn)行測定，即采用在空白輔料中加入原料藥對(duì)照品的方法。 如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測物進(jìn)行測定，或與另一個(gè)已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。,中藥分析的準(zhǔn)確度一般用加樣回收試驗(yàn)衡量。中藥回收率一般要求在95105%范圍內(nèi)，有些方法操作步驟繁多時(shí)，可要求在90110%范圍內(nèi)

30、。,2雜質(zhì)定量測定的準(zhǔn)確度 可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測定。如果不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，可用本法測定結(jié)果與另一成熟的方法進(jìn)行比較。,（二）精密度（precision） 精密度是指在規(guī)定條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次（n）取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。 系指每次測定結(jié)果與多次測定的平均值的偏離程度 用偏差（d）、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)（變異系數(shù)，CV）表示。,方法精密度 表示該分析方法的可重復(fù)性(reproducibility) 反映分析方法的可操作性，是方法驗(yàn)證的基本要點(diǎn)之一,精 密 度,精 密 度,在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析者測定結(jié)果的精密度。 (藥典分析方法的建立

31、）,第一章,（1） 重現(xiàn)性 (reproducibility),重現(xiàn)性指采用相同方法，在不同實(shí)驗(yàn)室用同一試驗(yàn)物質(zhì)，由不同操作者使用不同設(shè)備所得試驗(yàn)結(jié)果的一致性。,當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時(shí)，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)。 如建立藥典分析方法時(shí)通過協(xié)同檢驗(yàn)得出重現(xiàn)性結(jié)果，協(xié)同檢驗(yàn)的過程、重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。,精 密 度,指同一實(shí)驗(yàn)室,不同的時(shí)間由不同分析者或使用不同的儀器進(jìn)行測定的結(jié)果的精密度。,第一章,同一實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備所得結(jié)果的精密度。 考察隨機(jī)變動(dòng)因素的影響。 變動(dòng)因素為不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備,精密度,重復(fù)性指采用相同方法，在同一實(shí)驗(yàn)室用同一試驗(yàn)物質(zhì)，

32、同一操作者使用同一設(shè)備，在短時(shí)間間隔內(nèi)，在相互獨(dú)立試驗(yàn)中所獲得結(jié)果的一致性。,第四章,在相同條件,由一個(gè)分析者測定所得結(jié)果的精密度。,在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測定結(jié)果評(píng)價(jià)，如制備三個(gè)不同濃度樣品各測三次或把被測物濃度當(dāng)作100%，至少測6次進(jìn)行評(píng)價(jià)。,精密度,以標(biāo)準(zhǔn)差SD或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD表示。,第四章,表示方法,絕對(duì)偏差 相對(duì)偏差 d r = 100% = 平均值,精 密 度,偏差 系指測得的結(jié)果與平均值之差。 絕對(duì)偏差 d i = 測得值平均值 =x i - x （i=1，2，n）,=,=,%,平均偏差,絕對(duì)偏差：單項(xiàng)測定與平均值的差值,平均偏差:指單項(xiàng)測定值與平均值的偏差（取絕對(duì)值）之

33、和，除以測定次數(shù)。平均偏差是代表一組測量值中任意數(shù)值的偏差。所以平均偏差不計(jì)正負(fù)。,例1：計(jì)算下面這一組測量值的平均值（ ），平均偏差（d平均），相對(duì)偏差（d平均 ） 55.51, 55.50, 55.46, 55.49, 55.51,解：平均值 =xi/n,平均偏差=di/n=xi- /n,=(55.51+55.50+55.46+55.49+55.51)/5 =55.49,=(0.02+0.01+0.03+0.00+0.02)/5=0.016 平均相對(duì)偏差= di/n 100% =0.016/55.49100% =0.028 ,表示方法,精密度一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviati

34、on，SD或)或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)表示 若設(shè)供試品的測定值為Xi，則其平均值為 ，且有n個(gè)測定值， SD=,RSD= =,包括批內(nèi)(within-run或intra-assay)RSD日內(nèi)(within-day) 和批間(between-run或inter-assay)RSD日間(between -day，day-to-day),標(biāo)準(zhǔn)偏差 是反映一組供試品測定值的離散的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。,SX =,=,=,=,=,=,？,2. 測定法分別測定法(),照準(zhǔn)確度項(xiàng)下方法，取空白生物基質(zhì)(如血漿)數(shù)份，分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高、中、低 3個(gè)濃

35、度的QC樣品，并分析測定。 批內(nèi)RSD 每一濃度56個(gè)樣品，每個(gè)樣品測定1次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算3個(gè)濃度及每1濃度的RSD 批間RSD 每1分析批內(nèi)每一濃度制備1個(gè)樣品，每個(gè)樣品測定1次；用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3個(gè)濃度(每一濃度56個(gè)分析批數(shù)據(jù))的RSD,2. 測定法連續(xù)測定法(),若實(shí)際樣品測定所用的分析批次少于5批，也可進(jìn)行3個(gè)批次的連續(xù)分析(每1濃度的每1批次為56個(gè)樣本)方差分析法 批間RSD = 批內(nèi)RSD = =,第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求,例2 用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）法檢測vero-E6，細(xì)胞培養(yǎng)上清正常標(biāo)本10份的結(jié)果（100 OD49

36、0值）為2，3，3，4，4，5，5，5，6，8，求標(biāo)準(zhǔn)差。,解：先計(jì)算 Xi=2+3+3+6+8=45 Xi2=22+32+32+62+82=229,精密度和準(zhǔn)確度的關(guān)系,準(zhǔn)確度和精密度是兩個(gè)不同的概念，但它們之間有一定的關(guān)系。 應(yīng)當(dāng)指出的是，測定的精密度高，測定結(jié)果也越接近真實(shí)值。 但不能絕對(duì)認(rèn)為精密度高，準(zhǔn)確度也高，因?yàn)橄到y(tǒng)誤差的存在并不影響測定的精密度，相反，如果沒有較好的精密度，就很少可能獲得較高的準(zhǔn)確度。,（1）精密度是保證準(zhǔn)確度的先決條件。 （2）高精密度不一定保證高準(zhǔn)確度。,精密度高 準(zhǔn)確度較差， 即系統(tǒng)誤差較大；,甲,乙,丙,準(zhǔn)確度高， 但精密度較差， 即偶然誤差較大；,精密度

37、比較好 準(zhǔn)確度比較好， 稱為精確度高， 偶然誤差比較小 系統(tǒng)誤差比較小,用打靶時(shí)彈著點(diǎn)為例，說明上述二個(gè)詞的意義。用靶心表示其值位置，星點(diǎn)為每次測得值的位置,偏差（d）：測量值與平均值之差,標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（SD或S）,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（RSD），也稱變異系數(shù)（CV）,（三） 檢測限（limit of detection， LOD） 檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。是限度試驗(yàn)參數(shù)，無需定量測定。常用%、ppm、ppb表示。,1非儀器分析目視法 用已知濃度的被測物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。,2信噪比法 用于能顯示基線噪音的分析方法（儀器分析方法），是把已知低濃度試樣測出的信號(hào)

38、與空白樣品測出的信號(hào)進(jìn)行比較，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比（S/N）31或21時(shí)的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測限。,3數(shù)據(jù)要求 應(yīng)附測試圖譜，說明測試過程和檢測限結(jié)果。,（四）定量限（1imit of quantitation，LOQ） 指樣品中被測物能被定量測定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度。常用%、ppm、ppb表示。,常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為101時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定，也可用儀器所測空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計(jì)值，再經(jīng)試驗(yàn)確定。,（五）專屬性（specificity） 指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能

39、存在情況下采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性，能反映該方法在有共存物時(shí)對(duì)供試物準(zhǔn)確而專屬的測定能力。是指該法用于復(fù)雜樣品分析時(shí)相互干擾程度的度量。,能準(zhǔn)確并專一測出被測物的能力。是在分析復(fù)雜樣品混合物時(shí)衡量其是否受到干擾及其程度的一種方法。,專 屬 性,藥物分析中考慮:雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、相關(guān)物質(zhì)、制劑輔料。,生物藥物分析中考慮:內(nèi)源性物質(zhì)干擾,代謝產(chǎn)物的干擾,同時(shí)服藥時(shí)的干擾。,（六） 線性(linearity) 在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。 數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖。,指在一定的濃度范圍內(nèi),測試結(jié)果與供試物濃度呈正比關(guān)系的程度。,線 性,第

40、一章,方法 用作圖法或計(jì)算回歸方程建立。 Y=ax+b r=0.999,濃度 應(yīng)包括一定梯度的5-8個(gè)濃度。對(duì)于含量測定要求濃度上限為樣品最高濃度的120%,下限為樣品最低濃度的80%,但應(yīng)高于LOQ。,（七）范圍 指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性的條件下，測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。,（八） 耐用性 (robusness) 指測定條件稍有變動(dòng)時(shí)，結(jié)果不受影響的承受程度，為常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。是衡量實(shí)驗(yàn)室和工作人員之間在正常情況下實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性的尺度。,目的 為常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù). 體現(xiàn)耐用性因素： 被測溶液的穩(wěn)定性 樣品提取次數(shù) 時(shí)間 試劑來源,耐 用 性,指在測定條件有小的變動(dòng)時(shí),分析相

41、同樣品所測得的試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)程度.,2. 雜質(zhì)的限量檢查除專屬性、檢測限、耐用性外，其它都不要求。雜質(zhì)的定量測定除檢測限外，其它都要求。,3. 含量測定及溶出量測定除檢測限、定量限外，其它都要求。,（九）應(yīng)用 1. 鑒別試驗(yàn)除專屬性、耐用性外，其它都不要求。,不同分析方法對(duì)驗(yàn)證參數(shù)的要求,（十）各種含量測定方法對(duì)效能指標(biāo)的要求 1. 容量分析法： 用原料藥精制品(含量99.5)或?qū)φ掌房疾旆椒ǖ木芏?，相?duì)標(biāo)準(zhǔn)差一般應(yīng)不大于0.2； 進(jìn)行回收率試驗(yàn)?；厥章室话阍?9.7100.3之間。,2. UV法： 用適當(dāng)濃度的精制品進(jìn)行測定，其RSD一般不大于1。制劑的測定，回收率一般應(yīng)在98102之間。,線性：吸光度A一般在0.20.7，濃度點(diǎn)n5。用濃度c對(duì)A作線性回歸處理，得一直線方程，r應(yīng)大于0.999(n5)，方程的截距應(yīng)近于零。,3. HPLC法： 要求RSD2，回收率98102之間。 線性范圍：用精制品配制一系列