化學(xué)發(fā)光免疫標(biāo)記分析技術(shù)(基本原理 )ppt課件

1、.,免疫分析,免疫反應(yīng)： 抗原進(jìn)入機(jī)體，刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這種反應(yīng)叫免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)應(yīng)答包括對(duì)抗原物質(zhì)的感應(yīng)、反應(yīng)、效應(yīng)三個(gè)連續(xù)的階段。 免疫分析（immunoassay，IA）： 在臨床檢驗(yàn)中，基于抗原與其配對(duì)抗體能夠發(fā)生特異反應(yīng)，用已知的抗原或抗體檢測分析體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。,.,抗原抗體免疫反應(yīng)特點(diǎn),高特異性 抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性?？乖贵w反應(yīng)的高特異性是免疫學(xué)檢測的基礎(chǔ)。 高親和性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動(dòng)態(tài)平衡，

2、其反應(yīng)式為：Ag+AbAgAb。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。,.,免疫學(xué)檢測,免疫學(xué)檢測是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計(jì)的一系列測定抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)手段及分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用。它包括： 抗原抗體的檢測技術(shù) 免疫細(xì)胞的檢測 細(xì)胞因子的檢測 免疫相關(guān)基因分析 免疫標(biāo)記技術(shù) 免疫PCR(IM-PCR)技術(shù) 雜交瘤技術(shù)與T細(xì)胞克隆技術(shù),.,1977年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主雅洛 Yalow,雅洛1921年出生于紐約，1945年獲得核物理學(xué)博士學(xué)位，1975年當(dāng)選美國科學(xué)院院士。因?yàn)榘l(fā)明了放射性免疫分析法，雅洛獲得19

3、76年的拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，成為歷史上第一位獲得該獎(jiǎng)的女性科學(xué)家。次年，她因?yàn)榕c同事合作開發(fā)了“針對(duì)多肽類激素的放射性免疫分析法”而成為諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)史上第二位女性獲獎(jiǎng)?wù)摺?.,免疫分析標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,.,化學(xué)發(fā)光,化學(xué)發(fā)光：由于化學(xué)反應(yīng)（通常是氧化）底物從基態(tài)躍遷為激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，躍遷能量以光子形式釋放的現(xiàn)象。,.,化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是將化學(xué)發(fā)光體系與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標(biāo)記免疫測定技術(shù)。 美國臨床化學(xué)會(huì)議規(guī)定：凡是通過測量光子計(jì)數(shù)的方法都是化學(xué)發(fā)光，包括通過酶促luminol發(fā)光。 化學(xué)發(fā)光免疫分析1980s進(jìn)入體外診斷領(lǐng)域，第一臺(tái)全自動(dòng)檢測儀1

4、993年誕生。,化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù),.,發(fā)光免疫分析基本操作步驟(一步法),.,魯米諾化學(xué)發(fā)光系統(tǒng),.,吖啶酯化學(xué)發(fā)光系統(tǒng),吖啶酯化學(xué)發(fā)光系統(tǒng),.,堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光系統(tǒng),.,化學(xué)發(fā)光按化學(xué)反應(yīng)類型分為： 直接化學(xué)發(fā)光（非酶促化學(xué)發(fā)光） 吖啶酯系統(tǒng) 異魯米諾系統(tǒng) 間接化學(xué)發(fā)光（酶促化學(xué)發(fā)光） 辣根過氧化物酶魯米諾系統(tǒng)（HRP系統(tǒng)） 堿性磷酸酶金剛烷系統(tǒng)（AP系統(tǒng)） 其它 電化學(xué)發(fā)光,化學(xué)發(fā)光的檢測類型,.,直接化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)物質(zhì),如異魯米諾、吖啶酯等直接標(biāo)記抗原或抗體，免疫反應(yīng)后，直接引發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測。,產(chǎn)品： 吖啶酯標(biāo)記 : 西門子Siemens Centaur XP CP 雅培

5、Abbott Architect i2000 異魯米諾標(biāo)記 ：索林DiaSoin Liaison 新產(chǎn)業(yè),直接化學(xué)發(fā)光,.,間接化學(xué)發(fā)光：用參與發(fā)光反應(yīng)的酶來標(biāo)記抗原或抗體，免疫反應(yīng)后，加入發(fā)光底物，測定發(fā)光體系的發(fā)光強(qiáng)度來進(jìn)行抗原或抗體的檢測。,兩大反應(yīng)體系： 辣根過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)：氧化還原反應(yīng)，穩(wěn)定性差 源德、科美、安圖 堿性磷酸酶（AP）系統(tǒng)：水解反應(yīng)，靈敏度較高 貝克曼：Access 1、Access 2，DXI600、DXI800 西門子：Immulite1000 , Immulite 2000 達(dá)成生物：AULIN200,間接化學(xué)發(fā)光,以堿性磷酸酶系統(tǒng)為例,.,電化學(xué)發(fā)光：

6、一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，直接由三聯(lián)吡啶釕 Ru(bpy)32+ 標(biāo)記抗體，反應(yīng)時(shí)標(biāo)記物直接發(fā)光。,產(chǎn)品： Roche：Elecsys2010、COBAS e411、COBAS e601,電化學(xué)發(fā)光,.,第一代：魯米諾及其衍生物 第二代： 直接標(biāo)記：吖叮酯標(biāo)記 間接標(biāo)記：堿性磷酸酶-金剛烷系統(tǒng) 電化學(xué)發(fā)光：三聯(lián)砒啶釕,化學(xué)發(fā)光的發(fā)展史,國際主流免疫診斷公司均采用第二代化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物： 吖啶酯（雅培、西門子）、堿性磷酸酶-金剛烷（貝克曼、西門子）、三聯(lián)砒啶釕（羅氏）。,.,化學(xué)發(fā)光按檢測方式分為： 隨機(jī)處理模式：管式化學(xué)發(fā)光（磁微粒分離） 批處理模式： 板式化學(xué)發(fā)光（物理吸

7、附）,化學(xué)發(fā)光的檢測方式,.,適合流行病調(diào)查、疾病預(yù)防與控制、體檢中心，以及醫(yī)院血站等大樣本檢測項(xiàng)目的使用（比如HIV、TP、HCV和乙肝兩對(duì)半等）。,通常采用96孔白色不透明微孔板進(jìn)行包被，不方便隨到隨測和醫(yī)院急診； 對(duì)于定量檢測需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。,國內(nèi)廠家主要是板式化學(xué)發(fā)光系統(tǒng),板式化學(xué)發(fā)光,.,采用管式或微粒子發(fā)光，測定快速、準(zhǔn)確； 可以隨到隨測，適用于醫(yī)院急診； 定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線存儲(chǔ)在試劑條形碼中，可在2-4周內(nèi)直接使用。,國外廠家全部是管式化學(xué)發(fā)光系統(tǒng),管式化學(xué)發(fā)光,.,磁微粒示意圖,磁微粒分離技術(shù)特點(diǎn)： 較微孔板擴(kuò)大抗原抗體結(jié)合表面積，增加抗原或抗體的結(jié)合量，提高檢測靈敏度。 加快

8、反應(yīng)速度，迅速捕獲抗原抗體。 易于結(jié)合相、游離相的分離，提高檢測準(zhǔn)確性。 提高發(fā)光強(qiáng)度，快速達(dá)到穩(wěn)定發(fā)光。,管式化學(xué)發(fā)光大多用磁微粒，板式化學(xué)發(fā)光使用微孔板載體。,磁微粒分離技術(shù),.,化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的優(yōu)越性,靈敏度高：CLIA靈敏度可達(dá)10-16/-21mol/L（RIA為10-12mol/L）。又如化學(xué)發(fā)光底物（如AMPPD）可檢測出的堿性磷酸酶的濃度比顯色底物要靈敏50萬倍。,幾種標(biāo)記/檢測技術(shù)靈敏度的比較,.,化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的優(yōu)越性,幾種標(biāo)記/檢測技術(shù)線性范圍的比較,線性范圍寬：發(fā)光強(qiáng)度在46個(gè)數(shù)量級(jí)之間，與測定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。這與顯色的酶免疫分析吸光度（OD值）為2.

9、0的范圍相比，優(yōu)勢明顯。也優(yōu)于放射免疫分析技術(shù)。,.,化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的優(yōu)越性,幾種標(biāo)記/檢測試劑的有效期比較,試劑有效期長：有效期可長達(dá)1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰變，一般有效期只有一個(gè)月，而酶免的底物貯存性差，都無法與化學(xué)發(fā)光相比，有效期長可以降低使用成本，利于推廣應(yīng)用。,.,安全性好：徹底消除了放射性危害，環(huán)保、安全。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)CLIA的危害性。 光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長：輝光型（glow type）的CLIA產(chǎn)生的光信號(hào)持續(xù)時(shí)間可達(dá)數(shù)小時(shí)甚至一天。簡化了實(shí)驗(yàn)操作及測量。容易實(shí)現(xiàn)連續(xù)、動(dòng)態(tài)、重復(fù)測定。 分析方法簡便快速：絕大多數(shù)分析測定均為僅需加入一種試劑（或復(fù)合試劑）的一步法，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。 結(jié)果穩(wěn)定、誤差?。簶悠废抵苯幼约喊l(fā)光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器等）給分析帶來的影響，使分析結(jié)果靈敏穩(wěn)定可靠。,化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的優(yōu)越性,.,甲狀