微生物平板劃線試驗

1、平板劃線實驗實習(xí)，一是培養(yǎng)相關(guān)基礎(chǔ)理論細菌，一般細菌都可以用人造的方法培養(yǎng)，使之繁殖，可以進一步觀察研究他們的各種生物學(xué)特征。 為了獲得良好的細菌培養(yǎng)物，在分離培養(yǎng)細菌時，采用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，除了考慮其他的培養(yǎng)條件外，掌握各種分離培養(yǎng)和接種的基本技術(shù)也是重要的一環(huán)。 1、培養(yǎng)基在土壤、水、食品、空氣以及人和動物、植物中，混雜著不同種類的細菌生活。 研究其中的任何一種細菌，需要分離每種細菌，得到只含有那種細菌的純粹培養(yǎng)。 細菌分離為純種后，需要接種相關(guān)的培養(yǎng)基來測定各種生物科學(xué)性狀，需要根據(jù)細菌在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 1、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基按其物理性狀分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基

2、根據(jù)用途分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基。 按物理狀態(tài)劃分，在固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑制成固體狀態(tài)，瓊脂含量通常為1.5%-2.0%，瓊脂含量通常為0.2%-0.7%，不加任何凝固劑，觀察半微生物的運動特征、分類鑒定以及噬菌體效價滴定， 在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和實驗室對微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用進行了研究，按用途分類，是基礎(chǔ)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、或從混合微生物群中分離某種微生物的培養(yǎng)基、鑒別不同種類微生物的培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入特殊營養(yǎng)物質(zhì)制成的營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物， 與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化，牛漿

3、蛋白培養(yǎng)基是最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加富培養(yǎng)基，2，常見培養(yǎng)基即基礎(chǔ)培養(yǎng)基肉浸液培養(yǎng)基：一般細菌可以在該培養(yǎng)基內(nèi)生長營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：一般細菌培養(yǎng)是蛋白蛋白水培養(yǎng)基：靛藍常見培養(yǎng)基，加富培養(yǎng)基血瓊脂培養(yǎng)基：作為肺炎雙球菌、鏈球菌、葡萄球菌、嗜血桿菌等的分離培養(yǎng)也可用于某些菌落的溶血作用的朱古力瓊脂培養(yǎng)基：淋球菌和腦膜炎奈瑟氏菌在該培養(yǎng)基上生長良好，2，優(yōu)選常見培養(yǎng)基， 選擇亞硒酸鹽增菌液作為培養(yǎng)基：沙門氏菌屬屬和某志賀氏菌屬增菌用伊紅美青瓊脂：分離沙門氏菌屬和志賀氏菌屬細菌的Baird-Parker培養(yǎng)基：鑒別用于培養(yǎng)分離金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基三糖鐵元素瓊脂：用于鑒定腸道細菌的二糖鐵元素瓊脂：用于鑒

4、定腸道細菌的葡萄糖檸檬酸鹽瓊脂：鑒別大腸菌群和瓦斯氣體發(fā)生劑桿菌的二、接種細菌的方法、分離混合細菌的方法有幾種細菌分離為純種后，還可以在斜坡、液體、半固體培養(yǎng)基上檢測細菌的培養(yǎng)特性，因此接種方法可以相應(yīng)分為4種。 表3中常見的一些細菌培養(yǎng)和化學(xué)基接種方法的例子，1、斜面培養(yǎng)基接種法常用于細菌大量繁殖、菌種保藏或?qū)σ恍┥匦缘挠^察。 瓊脂、尿素、二糖、鐵元素、檸檬酸等具有斜面外形的固體培養(yǎng)基可用此法接種。 1、斜面培養(yǎng)基接種法、步驟： (1)在用標(biāo)記物接種的培養(yǎng)管上標(biāo)明標(biāo)記物。 (2)點燃酒精燈。(3)左手大拇哥、食指、中指及無名指分別保持與菌種接種的培養(yǎng)基管，使菌種管位于左側(cè)，斜面部朝上。

5、(4)用右手大拇哥和食指捏住試管的插頭，在接種時進行拔出。 (5)右手拿著接種環(huán)，在火焰上灼燒滅菌。 1、斜面培養(yǎng)基尺接種；(6)右手掌和小拇指、小拇指和無名指分別拔下2根試管塞夾持，對2根管口進行滅菌。 (7)將經(jīng)滅菌蒸發(fā)制冷的接種放入菌種管內(nèi)，從斜面上輕輕取出少量的菌苔，退出菌種管。 再放入接種的培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)基接種，從斜面底部向前端輕輕地彎曲劃線，使其不接觸培養(yǎng)基表面。 1、斜面培養(yǎng)基接種法、(8)完成接種，滅菌兩試管管口，堵塞試管塞子，置于原位。 再灼燒接種環(huán)，滅菌后返回試管架子。 所接種的試管在37溫箱中培養(yǎng)，1824年觀察生長狀況。 1、斜面培養(yǎng)基接種法、圖2-1斜面培養(yǎng)基

6、接種法、2、液體培養(yǎng)基接種方法，可用于觀察細菌的不同生長狀況，有的均勻混濁，有的沉淀生長，有的在液體表面形成菌膜。 此外，也可用于測定細菌的生化特性。 肉湯、葡萄糖蛋白胨水和各種單糖發(fā)酵管等液體培養(yǎng)基都用此法接種。 2 .液體培養(yǎng)基的接種方法，在步驟：(1)用標(biāo)記接種的培養(yǎng)基上標(biāo)明標(biāo)記。 (2)與斜面培養(yǎng)基的接種方法相同，握住與菌種管接種的肉湯管。 (3)接種環(huán)滅菌蒸發(fā)制冷后，放入菌種導(dǎo)管中，內(nèi)投射少量細菌，放入肉湯導(dǎo)管內(nèi)，并在靠近液面導(dǎo)管壁的表兄弟處輕輕研磨，沾少量肉湯，并混合細菌。 堵塞試管后，搖動液體，使細菌在液體中均勻分布。 (4)接種完成后，將接種環(huán)滅菌后放回試管支架。 肉湯管放入3

7、7溫箱進行培養(yǎng)，1824小時后觀察生長情況。 2 .液體培養(yǎng)基接種方法，圖2-2液體培養(yǎng)基接種法，3 .穿刺接種法常用于半固體瓊脂、醋酸鉛培養(yǎng)基、二糖鐵元素培養(yǎng)基等接種，前者用于測定細菌的動力，后者用于觀察細菌的生化反應(yīng)。 3、穿刺接種，在步驟：(1)用標(biāo)記接種的培養(yǎng)基上標(biāo)明標(biāo)記。 (2)如斜面培養(yǎng)基接種法，與菌種管接種，把持半固體瓊脂培養(yǎng)基。 (3)右手拿著接種針，滅菌蒸發(fā)制冷后，用針取出菌苔，垂直刺入半固體瓊脂培養(yǎng)基的中心，雖然接近管底，但即使不及管底，然后沿著原路退出。 (4)接種完成后，將接種針再次滅菌后放入試管支架，擰緊試管塞子，37培養(yǎng)1824小時后觀察細菌生長情況。 3、穿刺接種

8、法、圖2-3穿刺接種法、4、平板劃線接種法常用于分離單一菌落，觀察細菌生長情況，也可觀察某些生化反應(yīng)。 沙門氏菌屬的各屬在亞硫酸鉍瓊脂平板上呈黑色，而具有金屬光澤的志賀氏菌屬在HE瓊脂大板塊、SS瓊脂大板塊、麥康凱瓊脂大板塊上呈無色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。 4、平板劃線接種的接種方法，(1)在培養(yǎng)皿底面，用標(biāo)記明確記載接種的菌名、接種者名、日期等。 4、平板劃線接種法，(2)滅菌接種環(huán)點燃酒精燈，右手拿筆拿著接種環(huán)，在火焰中灼燒滅菌，首先把接種環(huán)的接種絲部分放在火焰中，在合十禮球發(fā)紅甚至蔓延到金屬端之后，直接灼燒金屬環(huán)，然后從金屬環(huán)向金屬棒方向4、平板劃線接種法，圖2-4滅菌接種環(huán)，4、平板劃線

9、接種法，(3)取菌種左手拿放金黃色葡萄球菌或大腸菌群菌液的試管，拿著接種環(huán)用右手掌和小拇指拔出試管塞子，迅速地用火焰滅菌試管管口23次。將經(jīng)滅菌、蒸發(fā)制冷的接種環(huán)放入菌種管，取出接種環(huán)的菌液，退出菌種管，再次在菌種管管口用火焰滅菌23次，堵塞試管塞子，放在原來的位置。 4、平板劃線接種法，(4)分離劃線接種細菌(四區(qū)接種法)左手拿瓊脂平板培養(yǎng)基(將皿蓋放置在桌上的酒精燈附近)，盡量使空氣中的細菌不掉落，使其直立，接近火焰。 右手拿著接種環(huán)往來于瓊脂大板塊的上端，涂上細菌薄膜(約占大板塊的1/10 )，作為一個區(qū)。 劃線時使接種環(huán)和接種平板面成3040度的角度，用手臂的力使平板表面輕快地進行往復(fù)

10、折射動作。 使瓊脂大板塊旋轉(zhuǎn)90度，灼燒接種環(huán)，殺死環(huán)上的殘留細菌，使接種環(huán)接觸培養(yǎng)基表面進行蒸發(fā)制冷。 滅菌接種環(huán)通過薄膜進行連續(xù)平行劃線(約占平板的1/5 )，將其作為兩區(qū)。 4、平板劃線接種法，瓊脂平板旋轉(zhuǎn)90度，灼燒接種環(huán)，滅菌蒸發(fā)制冷。 對滅菌接種環(huán)連續(xù)2區(qū)進行平行劃線(約占平板的1/4 )，這是3區(qū)。 瓊脂大板塊旋轉(zhuǎn)90度，接種環(huán)不再需要滅菌，連續(xù)劃3區(qū)平行劃線，填滿大板塊佝僂部分，視為4區(qū)。 各區(qū)的接種管線之間盡量不相互交接，達到細菌逐漸稀釋的目的。 4、平板劃線接種法，圖2-5四區(qū)劃線，4、平板劃線接種法，4、平板劃線接種法，(5)完成劃線后，將瓊脂平板放入皿蓋，放倒培養(yǎng)皿，放

11、入37個溫箱進行培養(yǎng)。 (培養(yǎng)1824h后取出培養(yǎng)皿。 觀察瓊脂平板表面生長的各種菌落，注意其大小、形狀、邊緣、表面結(jié)構(gòu)、透明度、顏色等性狀。 三、金黃色葡萄球菌和普通大腸菌群的平板劃線接種實驗，1、實驗內(nèi)容2、實驗?zāi)康?、實驗用品4、實驗步驟5、觀察結(jié)果1、實驗內(nèi)容；(1)用四區(qū)劃線法將金黃色葡萄球菌放在血瓊脂培養(yǎng)基的平皿上；(2)用四區(qū)劃線法接種普通大腸；(2)實驗器材：酒精燈4、實驗程序，參照前面介紹的四區(qū)劃線法的操作程序操作，在無菌條件下培養(yǎng)無菌意識。 (1)標(biāo)記(2)滅菌接種環(huán)(3)菌種(4)分離劃線接種細菌(5)的劃線完成，送到37溫箱培養(yǎng)(6)中培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果，5，觀察結(jié)果，5，觀察結(jié)果，(1)菌落的形態(tài)特征：大小邊緣(平滑、波形、鋸齒狀、卷曲狀等)，5，觀察結(jié)果，(2)菌落溶血特征：菌落溶血有以下3種情況。 溶血：也稱為草綠色溶血，是在菌落周圍培養(yǎng)基上出現(xiàn)12mm的草綠色環(huán)，由高鐵元素血色素引起的溶血：也稱為完全溶血，是在菌落周圍形成完全清晰的透明溶血環(huán)，細菌產(chǎn)生的溶血素使血紅細胞完全溶解引起的溶血：即不溶血5、觀察結(jié)果： (3)色素：部分細菌產(chǎn)