牛大力多糖對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的雙向調(diào)節(jié)作用

1、牛大力多糖對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的雙向調(diào)節(jié)作用摘要目的：提取純化雞血藤多糖。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)多糖對(duì)刀豆球蛋白A(ConA)刺激小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響，探討多糖對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制，為牛大力臨床治療各種慢性疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：從牛大力中提取純化多糖，用CFDA染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)多糖對(duì)柯納誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：160g/mL、800g/mL、4mg/mL和20mg/mL的終濃度對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖有劑量依賴性抑制作用，而5、25、50和125g/mL的終濃度對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖有劑量依賴性促進(jìn)作用。結(jié)論：牛大力多糖能雙向調(diào)節(jié)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖。關(guān)鍵詞牛大力；多糖；t淋巴細(xì)胞。C

2、FDA東南MillettiaSpeciosaChamp。又名山藕和大理馬鈴薯，是雞血藤的干燥根。屬豆科，主要產(chǎn)于粵東。牛大力的藥最早使用于生草藥性備要 2，歷史悠久，味甘平，具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)筋活絡(luò)的功效。主要用于治療肺熱咳嗽、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、胃潰瘍、慢性肝炎、肺結(jié)核等疾病1。早在20世紀(jì)70年代，牛大力作為壯腰沈劍丸和李強(qiáng)健身膠囊的原料，就已經(jīng)用于中成藥的生產(chǎn)3。目前，已有關(guān)于大鯢的免疫活性的報(bào)道4，但其多糖的藥理活性未見(jiàn)報(bào)道。本文從牛大力中提取、分離、純化多糖，鑒定其主要理化性質(zhì)，并通過(guò)ConA硒染色和流式細(xì)胞術(shù)研究多糖對(duì)刀豆球蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖的影響，為闡明其

3、對(duì)免疫系統(tǒng)的作用和臨床治療各種疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為牛大力的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。1種材料1.1動(dòng)物雄性SPF Balb/c小鼠，4 5周齡，體重(122)g，由中山大學(xué)動(dòng)物研究所提供(合格證號(hào)00A005)。1.2試劑和儀器牛大力購(gòu)自廣州天河石牌東白康源藥店，經(jīng)鑒定為雞血藤的根。vy-branttmfda-secelltracerkit(c-1288)是從美國(guó)MolecularProbes公司購(gòu)買的。ConA、RPMI-1640、胎牛血清、谷氨酰胺和-二巰基乙醇都是從西格瑪公司購(gòu)買的。流式細(xì)胞儀，美國(guó)貝克頓迪金森公司的產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠。2方法和結(jié)果2.1牛大力

4、多糖理化性質(zhì)的測(cè)定2.1.1牛大力多糖的提取和純化稱取鮮干牛大力片800克，粉碎，用6倍量的水在90下煮沸1小時(shí)，過(guò)濾，加入5倍量的水，煮沸1小時(shí)，過(guò)濾，再次重復(fù)，合并3次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，向濃縮液中加入無(wú)水乙醇，使溶液中乙醇濃度達(dá)到80%，沉淀出大量白色絮狀沉淀，并在4 8放置過(guò)夜，然后過(guò)濾。用適量水溶解，加入總體積為25%的Sevage試劑(氯仿戊醇=51)，搖勻成膠狀，離心除去沉淀和乳化層中的蛋白質(zhì)，重復(fù)上述操作兩次除去蛋白質(zhì)。將上清液濃縮，放入分子量為8000-10000的透析袋中，在流動(dòng)蒸餾水中透析過(guò)夜，取出透析袋中的溶液，濃縮后加入無(wú)水乙醇至乙醇濃度達(dá)到80%，在4 8放置過(guò)夜，

5、然后過(guò)濾。沉淀物依次用丙酮和甲醇洗滌脫色，在50下干燥，得到牛大力多糖5。2.1.2多糖含量測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)6，7，用蒽酮-硫酸法測(cè)定粗產(chǎn)品中的糖含量，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，得到線性回歸方程y=0.0047x-0.0003通過(guò)活髓切斷術(shù)殺死Balb/c小鼠，無(wú)菌取小鼠的頸部、腋窩、腹股溝和腸系膜的淋巴結(jié)，取出膠囊，收集細(xì)胞并用PBS (180g，10分鐘)離心兩次，并用PBS重懸。2.2.2淋巴細(xì)胞CFDA-硒染色CFDA-硒溶于含二甲基亞砜的10毫升/升貯存溶液中，貯存于-20。使用前，用1摩爾/升的工作溶液稀釋適量的硒化鎘，平衡至室溫，備用。將淋巴細(xì)胞懸液的密度調(diào)至107個(gè)細(xì)胞/毫升，將細(xì)胞懸

6、液按100001的體積比加入CFDA-硒工作液中，室溫下避光混勻10分鐘，然后用RPMI-1640全培養(yǎng)液(含10個(gè)細(xì)胞，180克，10分鐘)洗滌細(xì)胞兩次，將細(xì)胞濃度調(diào)至2106個(gè)細(xì)胞。2.2.3多糖對(duì)小鼠t淋巴細(xì)胞增殖的影響將CFDA-硒標(biāo)記的淋巴細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，分別設(shè)空白對(duì)照組、ConA組和ConA多糖溶液實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組多糖的最終濃度分別為5、25、50、125、160、800g/mL、4、20g/mL，體積固定為200L/孔。上述實(shí)驗(yàn)組的ConA濃度為5微克/毫升。在5% CO2培養(yǎng)箱中于37孵育48小時(shí)后檢測(cè)CFSE熒光強(qiáng)度(FL1)。2.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)、分析和數(shù)據(jù)

7、統(tǒng)計(jì)羧基熒光素乙酰乙酸(CFDA-硒)是一種染色細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的熒光染料。本文中，CFDA-SE標(biāo)記技術(shù)是利用CFDA-SE隨著細(xì)胞每一代增殖，熒光強(qiáng)度減半的系列，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，動(dòng)態(tài)跟蹤分析細(xì)胞增殖技術(shù)，計(jì)算增殖指數(shù)(pi)，即增殖后細(xì)胞總數(shù)與增殖前細(xì)胞總數(shù)的比值)，并研究t細(xì)胞的增殖8，9。從流式細(xì)胞儀和CELLQuest軟件獲取數(shù)據(jù)。淋巴細(xì)胞區(qū)在FSC和SSC的二維散點(diǎn)圖中畫出，并分別檢測(cè)各組該組細(xì)胞的FL1強(qiáng)度。在每個(gè)試管樣本中檢測(cè)到10000個(gè)細(xì)胞，并通過(guò)CELLQuest軟件分析獲得的數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)方法是t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(xs)表示。培養(yǎng)48小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)空白對(duì)照組

8、，結(jié)果顯示大多數(shù)細(xì)胞處于親本峰，分別為1.01和1.00，表明T淋巴細(xì)胞不增殖(見(jiàn)圖2A和3A)。在ConA組中，除了母峰外，T淋巴細(xì)胞也出現(xiàn)子峰(見(jiàn)圖2B和3B)，這表明在ConA刺激48小時(shí)后，T淋巴細(xì)胞顯著增殖。與對(duì)照組相比，子代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度減半。處理48小時(shí)后，濃度為5、25、50和125g/mL的多糖均可促進(jìn)ConA刺激的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖。這些實(shí)驗(yàn)組的PI值高于相應(yīng)的ConA刺激組，但沒(méi)有劑量依賴關(guān)系(見(jiàn)圖2c 2f)。然而，濃度為160g/mL、800g/mL、4mg/mL和20mg/mL的實(shí)驗(yàn)組均抑制了ConA刺激誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖，且其PI值明顯低于ConA刺激組，且

9、呈劑量依賴性抑制(見(jiàn)圖3c 3f)。其中，最終濃度為160g/mL、800g/mL和4mg/mL的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)母峰、第一代峰和第二代峰(見(jiàn)圖3c 3e)。20毫克/毫升的最終濃度僅顯示一個(gè)親本峰和一個(gè)弱子代峰，其值為1.03，這幾乎完全抑制了由ConA刺激的小鼠t淋巴細(xì)胞的增殖(見(jiàn)圖3F)。綜上所述，在最終濃度為5、25、50和125g/mL時(shí)，牛大力多糖能促進(jìn)小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖，但其量效關(guān)系不明顯。在最終濃度為160g/mL、800g/mL、4mg/mL和20mg/mL時(shí)，能抑制小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖，且呈劑量依賴性。3討論本實(shí)驗(yàn)用ConA刺激T細(xì)胞增殖，牛大力多糖對(duì)ConA刺激誘導(dǎo)的T細(xì)胞增

10、殖的抑制或促進(jìn)作用可以通過(guò)CFSE熒光強(qiáng)度的變化來(lái)表現(xiàn)。增殖指數(shù)通過(guò)CELLQuest軟件擬合得到，并對(duì)多糖的影響進(jìn)行可視化、量化和量化本研究發(fā)現(xiàn)牛大力多糖是調(diào)節(jié)免疫功能的主要活性成分之一。牛大力多糖對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖具有雙向調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞是整個(gè)免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵細(xì)胞之一，干預(yù)T淋巴細(xì)胞的行為可以有效調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。這為探討牛大力的抗炎和免疫增強(qiáng)作用提供了線索。認(rèn)為炎癥如肝炎與淋巴細(xì)胞活化和增殖直接或間接相關(guān)。慢性肝炎的發(fā)病機(jī)制與輔助性T細(xì)胞的免疫功能密切相關(guān)。由于牛大力高濃度多糖能抑制T淋巴細(xì)胞增殖，且具有明顯的劑量依賴性。牛大力可能通過(guò)多糖抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，從而抑制Th細(xì)胞的功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫。這可能是牛能有效治療這些疾病的原因之一。在已報(bào)道的牛大力治療慢性肝炎的中藥方劑中，牛大力用量最大1。牛大力處方的高劑量可以形成更高濃度的多糖溶液。此外，牛大力具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)筋活絡(luò)、強(qiáng)身健體、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗病能力的作用8，而低濃度的牛大力多糖能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖。因此，推測(cè)牛大力可能通過(guò)多糖促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力。然而，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牛大力低濃度多糖對(duì)T細(xì)胞沒(méi)有明顯的劑量依賴性作用。本研究為調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抑制炎癥、增強(qiáng)免疫力等