實(shí)驗(yàn)一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段

1、實(shí)驗(yàn)一(1) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (pcr)擴(kuò)增dna片段 polymerase chain reaction,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 注意事項(xiàng),實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握pcr反應(yīng)的原理及技術(shù) 實(shí)驗(yàn)原理 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）簡(jiǎn)稱pcr技術(shù)，是一種體外擴(kuò)增特異dna片段的技術(shù)； 利用pcr技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異的dna序列的拷貝；,pcr技術(shù)在分子克隆、遺傳病的基因診斷等方面得到了廣泛的應(yīng)用。 pcr技術(shù)實(shí)際上是在模板dna、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于dna聚合酶的酶促合成反應(yīng)。 pcr技術(shù)的特異

2、性取決于引物和模板dna結(jié)合的特異性。,原理 反應(yīng)體系： 含有目的基因或序列的dna模板 一對(duì)脫氧寡核苷酸引物（primer） 熱穩(wěn)定的dna聚合酶（taq酶） 4種脫氧核苷三磷酸(dntp) buffer及mg 2+等,pcr技術(shù)的參數(shù)主要有7個(gè)： 模板 引物 聚合酶 dntps 反應(yīng)buffer 二價(jià)離子 一價(jià)離子,反應(yīng)過(guò)程： 變性：升高溫度使模板dna變性、雙鏈分開(kāi)； 退火：再降低溫度使引物與模板dna配對(duì)互補(bǔ)結(jié)合； 延伸：然后升溫到聚合酶反應(yīng)適宜的溫度，此時(shí)在聚合酶催化下，從引物3-羥基端開(kāi)始，與模板dna上的堿基配對(duì)逐個(gè)加上核苷酸，合成新的dna鏈。 循環(huán)：其后再按高溫變性、低溫退火

3、、適溫合成三步反復(fù)循環(huán)，新合成的dna在下一循環(huán)中又作為模板使用，每循環(huán)一次，合成的目的序列擴(kuò)增一倍,或者說(shuō)，反應(yīng)分為三步： 變性：在高溫條件下，dna雙鏈解離形成單鏈dna； 退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)引物與其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈； 延伸： 在dna聚合酶、dntps和mg2+存在的條件下，聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的dna鏈延伸反應(yīng)。 以上三步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，幾十個(gè)循環(huán)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性dna片段得到了大量復(fù)制，數(shù)量可達(dá)到106-107個(gè)拷貝。,鎂離子濃度：mg2+離子濃度對(duì)pcr擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低pcr擴(kuò)增的特異性；濃度過(guò)低則

4、影響pcr擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使pcr擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。,循環(huán)次數(shù)：當(dāng)其它參數(shù)確定之后, 循環(huán)次數(shù)主要取決于dna 濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠；循環(huán)次數(shù)過(guò)多,會(huì)使pcr 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。,在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。 平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平,m marker 1-2 普通taq酶 3-4 hotstart taq酶,三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 （一）儀器 1. pcr儀 2. 臺(tái)式離心機(jī) 3. 微量取液器 4. 紫外熒光觀測(cè)儀 5. 高壓滅菌的

5、微量離心管 6. dna擴(kuò)增系統(tǒng) 7. 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng),（二）材料 模板dna : 500bp的片段插入在pmd18-t 載體 （三）試劑 2 pcr mix （tiangen天根） m13f， m13r,pmd18-t vector,四、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 總體系（20l）： ddh2o 7.5l6 m13f（通用引物） 0.75l6 m13r（通用引物） 0.75 l6 模板 1l6 2 mix(含dntp、taq酶、buffer等) 10l 6 注：做一管陰性對(duì)照，即模板為滅菌的雙蒸水,m13f（通用引物）: gag cgg ata aca att tca cac agg m13r（通用

6、引物）: cgc cag ggt ttt ccc agt cac gac,附. 其他實(shí)驗(yàn)步驟 在0.2ml eppendorf管內(nèi)配制25l反應(yīng)體系： ddh2o： 18.25l (25-6.75) 7 10pcr buffer： 2.5l7 dntps（2.5mm4） 2l 7 m13-f(10m)： 0.5l 7 m13-r(10m)： 0.5l 7 taq 酶： 0.25ul 7 模板： 1l /每管 注：做一管陰性對(duì)照，即模板為滅菌的雙蒸水,2. pcr程序 943min； 94 30s，55 30s，72 1min， 30 cycles； 72 7min； 16 ,電泳: 擴(kuò)增結(jié)束后

7、，取大約30l- 50l pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖電泳，檢測(cè)擴(kuò)增情況、分析結(jié)果。 紫外燈下切割擴(kuò)增的瓊脂糖膠塊中的 dna片段、放入eppendorf管中。 4冰箱存放，用于回收。,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 m,使用3 mg的dna marker dl2,000（500 ng/條帶）進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳后，各dna條帶自上至下分別為2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp。,dl2000 1-1 1-2 2-1 2-2 3-1 3-2 4-1 4-2,2000bp,100bp,1. 2639m基因大?。?13bp 2. 4635

8、m基因大?。?45bp 3. 9041m基因大?。?53bp 4. 大約500bp,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 pcr體系的調(diào)制過(guò)程中應(yīng)盡量減少污染的機(jī)會(huì)，以免出現(xiàn)目的條帶以外的雜帶。 如退火溫度過(guò)低，也可能出現(xiàn)雜帶。,六、注意事項(xiàng) pcr反應(yīng)是在一個(gè)在沒(méi)有dna污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。 一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，模板純化的方法越簡(jiǎn)單越好。 要使用新配制的或適當(dāng)貯存的未使用過(guò)的試劑或緩沖液來(lái)提取核酸，不要使用以前用于別的樣品的試劑。 所用的所有溶液都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。配制試劑，操作樣品，建立反應(yīng)和以后的檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)程中最好都使用手套。 所有pcr試劑中使用的水都應(yīng)該用新鮮蒸餾的去離子

9、水，高壓滅菌后分裝備用。,所有試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成小份以確保實(shí)驗(yàn)間的連續(xù)性。 所有試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和離心管，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。 pcr樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。 擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)不加模板的陰性對(duì)照，電泳時(shí)應(yīng)當(dāng)加標(biāo)準(zhǔn)dna分子量標(biāo)記（marker）以估計(jì)產(chǎn)物的大小。,附：引物設(shè)計(jì)原則 寡核苷酸引物長(zhǎng)度一般為1530bp； g+c含量 g+c含量一般在40%-60%； 堿基的隨機(jī)分布： 引物中堿基的分布最好是隨機(jī)分布的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在； 引物自身：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。,引物之間： 兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)性，尤其避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。 引物的3端： 引物的延伸是從3端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。 引物的5端：引物的5端限定著pcr產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。 引物5端的修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入啟動(dòng)子序列等。,密碼子的簡(jiǎn)并： 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第三位，因?yàn)榈谌蝗菀装l(fā)生簡(jiǎn)并，