液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的原理ppt課件

1、匯報人：XXX 2015-12-18,液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),1,簡 介,液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。 LC-MS除了可以分析氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）所不能分析的強極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物之外，還具有以下幾個方面的優(yōu)點：分析范圍廣、分離能力強、定性分析結(jié)果可靠、檢測限低、分析時間快、自動化程度高,2,液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別:,氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物

2、；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標準譜庫對比。 液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。,3,LC-MS由以下幾部分組成 數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng) 液相色譜 接口 質(zhì)量分析器 檢測接收器 （離子源 ） 真空系統(tǒng),4,真空系統(tǒng),5,質(zhì)譜儀的離子產(chǎn)生及經(jīng)過系統(tǒng)必須處于高真空狀態(tài)。若真空度過低，則會造成離子源燈絲損壞、本底增高、圖譜復雜化、干擾離子源的調(diào)節(jié)、加速極放電等問題。 一般質(zhì)譜儀都采用機械泵預抽真空后，再

3、用高效率擴散泵連續(xù)地運行以保持真空?，F(xiàn)代質(zhì)譜儀采用分子泵可獲得更高的真空度。,離子源,6,離子源的作用是將欲分析樣品電離，得到帶有樣品信息的離子。,1.質(zhì)譜檢測的是離子 2.離子源=接口,7,ESI是近年來出現(xiàn)的一種新的電離方式。它主要應用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。流出液在高電場下形成帶電噴霧，在電場力作用下穿過氣簾；從而霧化、蒸發(fā)溶劑、阻止中性溶劑分子進入后端檢測。,電噴霧電離（ESI）,8,ESI是一種軟電離方式，即便是分子量大，穩(wěn)定性差的化合物，也不會在電離過程中發(fā)生分解，它適合于分析極性強的有機化合物。 ESI的最大特點是容易形成多電荷離子。目前采用電噴霧電離，可以測量大分子量的蛋白質(zhì)。

4、,大氣壓化學電離源(APCI),9,APCI噴嘴的下游放置一個針狀放電電極，通過放電電極的高壓放電，使空氣中某些中性分子電離，產(chǎn)生H3O+，N2+，O2+ 和O+ 等離子，溶劑分子也會被電離，這些離子與分析物分子進行離子-分子反應，使分析物分子離子化。,10,電噴霧與大氣壓化學電離的比較,電離機理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成MH+或M-H-離子。 樣品流速：APCI源可從0.2到2 mlmin；而電噴霧源允許流量相對較小,一般為0.2-1 mlmin. 斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，對熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解. 靈敏度：通常認為電噴霧有利于分析

5、極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。 多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子,11,質(zhì)量分析器,12, 質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核心, 質(zhì)量分析器的作用是將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序分開并排列。, 不同類型的質(zhì)量分析器構(gòu)成不同類型的質(zhì)譜儀。, 不同類型的質(zhì)譜儀其功能，應用范圍，原理， 實驗方法均有所不同。,單聚焦磁場分析器,13,在一定的B、V下，不同m/z 的離子其R不同，由離子源產(chǎn)生的離子，經(jīng)過分析器后可實現(xiàn)質(zhì)量分離。,離子進入分析器后，由于磁場的作用，其運動軌道發(fā)生偏轉(zhuǎn)改作圓周運動。其運動軌道半徑R可由下式表示：,上式中， m -離

6、子質(zhì)量 Z -離子電荷量 V -離子加速電壓 B -磁感應強度,14,單雙聚焦質(zhì)譜儀體積大； 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器的發(fā)展及儀器小型化（臺式）需要 體積小的質(zhì)量分析器：,四極桿質(zhì)量分析器 飛行時間質(zhì)量分析器 離子阱質(zhì)量分析器,體積小，操作簡單； 分辨率中等；,15,四極桿質(zhì)量分析器,四極桿質(zhì)譜結(jié)構(gòu)簡單，價廉，體積小，易操作，掃描速度快，適合于GC-MS, LC-MS。,16,飛行時間質(zhì)譜儀（Time of Flight MS, TOF-MS）,TOF-MS的核心部分是一個無場的離子漂移管；,加速后的離子具有相同的動能,m/z小的離子，漂移運動的速度快，最先通過漂移管; m/z大的離子，漂移運動的速

7、度慢，最后通過漂移管。 適合于生物大分子，靈敏度高，掃描速度快，結(jié)構(gòu)簡單，分辨率隨m/z的增大而降低。,17, FT-MS的核心為分析室，分析室由三對平行的極 板構(gòu)成。磁力線沿z軸方向，離子的回旋運動垂直于z軸， 在與x軸方向垂直的兩極板上施加激發(fā)射頻，在與y軸方 向垂直的兩極板上檢測信號。,(Fourier Transform ion cyclotron resonance Mass Spectrometer, FTICR-MS),傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀,離子阱質(zhì)量分析器,18,特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達檢測器；,19,檢測系統(tǒng),質(zhì)

8、量分析器分離并加以聚焦的離子束， 按m/z的大小依次通過狹縫，到達收集器, 經(jīng)接收放大后被記錄。,20,質(zhì)譜儀的檢測主要使用電子倍增器，也有的使用光電倍增管。由倍增器出來的電信號被送入計算機儲存，這些信號經(jīng)計算機處理后可以得到色譜圖，質(zhì)譜圖及其它各種信息。,LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化,1.接口的選擇： ESI適合于中等極性到強極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預先形成離子的化合物和可以獲得多個質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)） APCI不適合可帶多個電荷的大分子，其優(yōu)勢在于弱極性或中等極性的小分子的分析。,21,2.正、負離子模式的選擇：,選擇的一般原則為： 正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸

9、或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優(yōu)先考慮使用正離子模式。 負離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進行堿化。樣品中含有較多的強伏電性基團，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負離子模式。,22,3.流動相的選擇,常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。 LCMS接口避免進入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須lmmol/l。（鹽分太高會抑制離子源的信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸銨10一5 mm

10、ol/l。 送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。,23,4.流量和色譜柱的選擇,不加熱ESI的最佳流速是150ulmin，應用4.6 mm內(nèi)徑LC柱時要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm內(nèi)徑的微柱，TIS源最高允許lmlmin，建議使用200400ulmin APCI的最佳流速lmlmin，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。 為了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱（此時UV圖上并不能獲得完全分離，由于質(zhì)譜定量分析時使用MRM的功能，所以不要求各組分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時間。,24,5.輔助氣體流量和溫度的選擇,霧化氣對流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級質(zhì)譜的產(chǎn)生。 操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點20 左右即可。對熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。 選用干燥氣溫度和流量大小時還要考慮流動相的組成，有機溶劑比例高時可采用適當?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c的。,25,具體應用領域,醫(yī)藥學：藥物代謝、藥物動力學、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析 生物化學：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖 環(huán)