課題2　土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) (5).ppt

1、課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),課題背景,1.尿素的利用:尿素CO(NH2)2重要的農(nóng)業(yè)氮肥。只能被土壤中細(xì)菌分解為NH3才能被植物吸收利用。,2.細(xì)菌利用尿素的原因：,CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3,細(xì)菌脲酶,課題目標(biāo),1.從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌,2.統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌,尿素分子的立體結(jié)構(gòu),一、研究思路,（一）篩選菌株,1.實(shí)例：PCR技術(shù)：一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫的DNA聚合酶。,提出的問題如何尋找耐高溫的DNA聚合酶？,解決問題的思路尋找耐高溫環(huán)境。,原因：高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物。,獲得

2、啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,2.實(shí)驗(yàn)室微生物的篩選原理,人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。,本課題使用的培養(yǎng)基KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 .7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 瓊脂 15.0g 將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到1000mL。,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,能。只有產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌才能利用尿素作為氮源而生存。,3.選擇培養(yǎng)基,問題1：該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長(zhǎng)提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？,問題2：此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的

3、細(xì)菌？為什么？,在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。,加入青霉素的培養(yǎng)基,（1）概念：,（2）例子：,細(xì)菌不生長(zhǎng)，酵母菌、霉菌等真菌能生長(zhǎng)。,不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基,分離自養(yǎng)型微生物。,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌 不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌 不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物,（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,1.顯微鏡直接計(jì)數(shù),(1)原理:利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量。,(2)具體做法：,（3）

4、優(yōu)缺點(diǎn)：,缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌和活菌。,優(yōu)點(diǎn)：能準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)微生物的實(shí)際數(shù)目。,每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為 1mm ，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3。,以一個(gè)大方格有25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行計(jì)算：設(shè)五個(gè)中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，一個(gè)大方格中的總菌數(shù)是多少?,5A,1ml菌液中的總菌數(shù)?(1ml=1cm3=1000mm3）,5AB104,1mm,2.間接計(jì)數(shù)（活菌計(jì)數(shù)法）,C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(m)，M代表稀釋倍數(shù)。,當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的

5、一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。,（2）原理：,稀釋涂布平板法。,（1）常用方法：,計(jì)算公式：,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M,【例1】某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基上測(cè)得平板上的菌落數(shù)的平均值為234，那么每毫升樣品中菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1 mL）（ ） A.2.34108B.2.34109 C.234D.23.4,（3）計(jì)數(shù),【解析】稀釋倍數(shù)為106，0.1 mL稀釋液的菌落數(shù)的平均值為234，則每毫升樣品中菌落數(shù)就為234/0.1106=2.34109。,B,統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目高還是低，

6、為什么？,低。因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。,【例2】：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230。 2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個(gè)平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯(cuò)在哪？,甲：沒有重復(fù)實(shí)驗(yàn)（至少涂布3個(gè)平板）。,乙：A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計(jì)算平均值。,啟示： 1.在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

7、時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性。 2.在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。,1.目的：排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。,設(shè)置對(duì)照,2.實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。其他同學(xué)認(rèn)為A同學(xué)結(jié)果有問題，可能是A同學(xué)培養(yǎng)基被雜菌污染，或者培養(yǎng)基混入其他含氮物質(zhì)，導(dǎo)致其他雜菌生長(zhǎng)。,但A同學(xué)認(rèn)為自己選用土壤樣品不同導(dǎo)致結(jié)果不同，但是A同學(xué)沒有設(shè)

8、計(jì)對(duì)照，拿不出讓同學(xué)信服的證據(jù)。你能通過設(shè)置對(duì)照，幫助A同學(xué)排除上述兩個(gè)可能影響因素嗎？,方案2：其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,方案1：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與記數(shù),1.土壤取樣,3.樣品稀釋、取樣涂布,4.微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果,5.細(xì)菌的計(jì)數(shù),二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),1.土壤取樣,從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照，

9、判斷選擇培養(yǎng)基是否起到選擇作用。,選用稀釋倍數(shù)為103107的稀釋液。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基（平行重復(fù)原則），1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，共需要制備5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和15個(gè)選擇培養(yǎng)基，準(zhǔn)備好無菌試管和移液管。,3.樣品稀釋、取樣涂布,測(cè)定土壤細(xì)菌數(shù)量，一般選用104、105和106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)；測(cè)定放線菌的數(shù)量，一般選用103、104和105倍稀釋液；測(cè)定真菌的數(shù)量，一般選用102、103和104倍稀釋液。,因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量是不同的，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,將10g土樣加入盛有90mL無菌生理

10、鹽水的錐形瓶中,充分搖勻，吸取上清液1mL，轉(zhuǎn)移至盛有9mL水的無菌試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107至103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進(jìn)行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。,注意：由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103107。,4.微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果,將涂布好的培養(yǎng)皿放在30下培養(yǎng)。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。,不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌一般在3037的溫度下培養(yǎng)12d；放線菌一般在2528的溫度下培養(yǎng)57d；而霉菌一般在25

11、28的溫度下培養(yǎng)34d。,一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間)，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如菌落形狀、大小、隆起程度和顏色。,5.細(xì)菌的計(jì)數(shù),當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。,統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目高還是低，為什么？,低。因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。,(一)無菌操作,1.取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。,2.應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火

12、焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。,3.在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。,(二）做好標(biāo)記,注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。,（三）規(guī)劃時(shí)間,三、操作提示,四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià),（一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選菌落。,對(duì)照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已經(jīng)篩選出一些菌落。,（二）樣品的稀釋操作是否成功。,如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30 300平板，說明稀釋比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。,（三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致。,如果選取的是同一種土樣，

13、統(tǒng)計(jì)結(jié)果應(yīng)該相近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要分析產(chǎn)生差異原因。,五、課題延伸,本課題對(duì)能分解尿素的細(xì)菌進(jìn)行初步篩選。對(duì)分離的菌種進(jìn)一步鑒定，需要借助生物化學(xué)方法。,在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成了 氨 。氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng) ，PH 升高 。因此，我們可以通過檢測(cè)培養(yǎng)基pH變化來判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。,在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅 ，說明該細(xì)菌能夠分解尿素 。,【典型例題】,（2016課標(biāo)1卷.39） 空氣中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小組欲用平板收集教室空氣中的微生物，以了解教室內(nèi)不同高度

14、空氣中微生物的分布情況。實(shí)驗(yàn)步驟如下： 配置培養(yǎng)基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）; 制作無菌平板； 設(shè)置空白對(duì)照組和若干實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行相關(guān)操作； 將各組平板置于37恒溫箱中培養(yǎng)一段時(shí)間，統(tǒng)計(jì)各組平板上菌落的平均數(shù)?；卮鹣铝袉栴}: （1）該培養(yǎng)基中微生物所需的氮來源于_。若要完成步驟，該培養(yǎng)基中的成分X通常是_。 （2）步驟中，實(shí)驗(yàn)組的操作是_ _。 （3）若在某次調(diào)查中，某一實(shí)驗(yàn)組平板上菌落平均數(shù)為36個(gè)/平板，而空白對(duì)照組的一個(gè)平板上出現(xiàn)了6個(gè)菌落，這種結(jié)果說明在此次調(diào)查中出現(xiàn)了_現(xiàn)象。若將30（即36-6）個(gè)/平板作為本組菌落數(shù)的平均值，該做法_（填“正確”或“不正確”）。,牛肉膏、蛋白胨,瓊脂,將各實(shí)驗(yàn)組平板分別放置在教室不同高度的位置上，開蓋暴露一段時(shí)間,污染,不正確,【課堂小結(jié)】,一、選擇培養(yǎng)基的成分：,分