液相色譜柱的選擇和方法開發(fā).ppt

1、液相色譜柱的選擇和方法開發(fā),天津博納艾杰爾科技/Agela Technologies （US）,內(nèi)容概要,色譜基本概念回顧 色譜柱類型、選擇和方法開發(fā) 制備液相 混合固定相-優(yōu)化復(fù)雜樣品分離的一個(gè)新策略 如何改善強(qiáng)水溶性化合物的保留和分離,色譜基本概念回顧,色譜（chromatography）,色譜原理 色譜分類：氣相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/離子交換/HILIC/混合固定相 色譜功能：分析（種類/定量），純化 液相色譜儀器結(jié)構(gòu)及功能：泵，脫氣機(jī)，混合器，進(jìn)樣器（閥），色譜柱，柱溫箱，檢測器（流通池）,幻燈片制作：WSY18,分離度,Rs - Resolution N Theo

2、retical Plate Number Selectivity k Retention Factor 拖尾,幻燈片制作：WSY18,1.Separation of Compounds A and B,靈敏度,：Limit of Detection ：Limit of Quantification 柱效 峰形（拖尾因子）,重現(xiàn)性,分離度（） 保留時(shí)間（，） 選擇性（ ） 柱效（） 靈敏度,色譜柱類型、選擇和方法開發(fā),色譜柱與色譜條件對色譜性能的影響,分離度 - 選擇性 鍵合類型，基質(zhì)表面特性；流動(dòng)相、溫度 - 柱效 保留體積，粒徑，柱長，基質(zhì)表面特性；流動(dòng)相， 溫度，上樣量，流速 峰對稱性 基

3、質(zhì)表面特性，鍵合類型，流動(dòng)相，溫度 保留體積 柱長，孔隙率，比表面積，基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度 靈敏度 粒徑，基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性 基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度 流動(dòng)相 pH，緩沖鹽種類，溶劑；,影響色譜柱性能的主要因素,1、 色譜柱的構(gòu)型 色譜柱內(nèi)徑 色譜柱長度 2、 固定相柱填料 粒徑 比表面積 孔徑 孔隙率 基質(zhì)表面特性： - 表面活性：硅膠純度、硅羥基的酸性、均勻性和數(shù)量 - 耐堿性 鍵合類型 - 官能團(tuán)、是否封尾 - 鍵合相的保留行為、耐酸性,色譜柱的構(gòu)型對色譜柱性能的影響,色譜柱的構(gòu)型對色譜柱性能的影響：長度和直徑,色譜柱尺寸 對

4、色譜分離的影響： 短柱 (15-100mm) - 運(yùn)行時(shí)間短, 柱壓低 長柱 (150-250mm) - 分辨率高, 運(yùn)行時(shí)間長 窄徑柱 ( 2.1mm) 滿足檢測器和樣品量限制 寬徑柱 (3-7.8 mm) - 載樣量高，抗污染，壽命 制備柱 (內(nèi)徑 10 mm) 用于純化制備,柱填料對色譜柱性能的影響,柱填料對C18色譜柱性能的影響：粒徑,硅膠粒徑和類型對柱效的影響,d,硅膠粒徑和類型對壓力的影響,柱填料對C18色譜柱性能的影響：粒徑II,目前市場主要可供選擇的填料粒徑 1.7m，1.8m，2.2m 快速液相色譜柱：匹配快速色譜儀 2.7m 多孔殼層：在常規(guī)液相色譜儀上實(shí)現(xiàn)快速分離(Hal

5、o) 3.0m，3.5m 普通快速分析 5.0m 常規(guī)分析,顆粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱壓升高.,柱填料對C18色譜柱性能的影響：比表面積,每克填料的表面積，與粒度，孔徑有關(guān) 比表面積大，保留增加，載樣量增加，平衡時(shí)間增加(梯度洗脫尤為注意) 根據(jù)需要選擇合適的比表面積,柱填料對C18色譜柱性能的影響：孔徑I,多孔材料的95%以上表面在孔內(nèi)部 樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進(jìn)入微粒內(nèi)部 孔徑至少是樣品流體學(xué)直徑的4倍 300孔徑用于：超過50個(gè)氨基酸的肽或25個(gè)殘基的低聚寡核苷酸,樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進(jìn)入微粒內(nèi)部,柱填料對C18色譜柱性能的影響：孔徑II,由于小孔徑填

6、料比表面積大，小分子的保留值在小孔徑填料通常更大,條件：C8色譜柱，4.6150mm，3.5um， A溶劑，0.1%TFA水溶液； B溶劑，0.1%TFA于80%乙腈水中； 20min梯度，1030%B；60C，1.5ml/min,柱填料對C18色譜柱性能的影響：硅膠純度I,2.3-二羥基萘,2.7-二羥基萘,TF=1.31,Brand W, AQ Column 5m, 4.6mm150mm,Brand Z,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Venusil MP C18 5m, 4.6mm150mm,Brand H, C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Bra

7、nd U,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,！,TF=1.42,TF=1.39,TF=1.69,TF=？,流動(dòng)相： 甲醇：水=65：35 流速： 1 mL/min 溫度： 35 檢測波長： 230 nm 進(jìn)樣量： 20 L,硅膠純度金屬含量,硅膠基質(zhì)類型及發(fā)展史,Type A：原料來源：水玻璃；高金屬含量，高活性，極性化合物容易形成拖尾和死吸附 Type B：原料來源：有機(jī)硅烷（四乙氧基硅烷）水解/燒結(jié)/酸洗 雜化及表面雜化 整體柱 殼層柱,柱填料對C18色譜柱性能的影響：硅膠純度II,硅膠純度金屬含量,d,固定相對色譜柱性能的影響：硅羥基的影響,殘余硅羥基的影響 普通硅膠當(dāng)

8、流動(dòng)相的 pH 值大于 4.5-5.0 時(shí)，表面的硅羥基會(huì)帶負(fù)電荷，堿性化合物拖尾。 解決方法 封尾 雙層表面修飾 表面雜化,固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響,封尾 鍵合填料與小硅烷進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，如三甲基氯硅烷，反應(yīng)掉部分殘余硅羥基，以增加表面覆蓋率。 缺點(diǎn)： 不能完全反應(yīng)（仍有50%的硅羥基未被反應(yīng)） 在pH3時(shí)，TMS易流失，耐用性，穩(wěn)定性不好,TMS,固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響,不同長度和體積的鍵合相對表面覆蓋率的影響,固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響,雙層表面修飾 降低表面硅羥基活性，硅膠表面更加均勻,固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響,硅膠

9、雙層表面修飾后 新增加表面層硅羥基活性更低新硅羥基pH=5.2， 普通硅羥基pH約為3.5 更對稱的峰型，提高柱效，提高靈敏度 硅膠表面更均勻硅膠微晶形成過程中的不光滑表面被覆蓋 重現(xiàn)性更好 表面純度更高硅膠金屬雜質(zhì)被覆蓋 極性化合物保留和分離更好,鍵性化合物峰形對比,Test conditions: Column dimension: 4.6 mm x 150mm Sample: doxepin, nortriptyline, trimipramine amitriptyline Mobile phase: Acetonitrile/0.01M sodium phosphate (pH=6)

10、 = 70/30 Temperature: 30 oC Flow: 1 mL/min Detection: UV 254 nm,Brand A C18( non-endcapped, ),C18 (non-endcapped, twin-layer,ASB C18,Zorbax SB C18,Saponins Extract,4.6x150 mm column, 1% formic acid/MeOH= 80/20,固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響,雙層表面修飾 代表產(chǎn)品： Venusil MP C18，Venusil ASB C18，Venusil HILIC,0.01 ng/mL

11、 Pseudoephedrine,Agela Venusil ASB C18, 2.150mm, 5m,Brand A C18 2.150mm, 5m,Phenomenex Luna C18, 2.050mm, 5m,固定相對色譜柱性能的影響：鍵合類型,A 縱向交聯(lián)：保留和選擇不穩(wěn)定 B 橫向交聯(lián)：寬pH適用，Durashell，Gemini C 單體鍵合：重現(xiàn)性好，柱效高 D 單體（空間保護(hù)）：低pH穩(wěn)定（Zorbax SB，Venusil ASB） 極性官能團(tuán)嵌合反相固定相 ( Zorbax Bonus RP, Venusil HLP),固定相對色譜柱性能的影響：基質(zhì)表面特性+鍵合類型 反

12、相鍵合相的保留行為,同一廠家相同硅膠基質(zhì)的反相柱： 保留值隨含碳量的增加而增加 比表面積越大，保留值越大 鍵合碳鏈越長，保留越大 C18 C8C3C1，長鏈之間差別不大,反相鍵合相的保留行為,不同廠家色譜柱的 保留值，選擇性與峰型 色譜柱：4.6*150mm，流動(dòng)相：乙腈0.05M磷酸鉀緩沖液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，,拖尾峰,T0（尿嘧啶）,P: 吡啶 L: 苯酚 N: N,N-二甲基苯胺B: 4-丁基苯甲酸 J: 甲苯,固定相對色譜柱性能的影響： 基質(zhì)表面特性+鍵合類型 鍵合相的穩(wěn)定性,鍵合相的穩(wěn)定性 低pH值，鍵合相流失 高pH值，硅膠溶解 影響色譜柱壽命，方法不

13、重現(xiàn),鍵合類型對鍵合相穩(wěn)定性影響,低pH值，鍵合相流失,鍵合類型對鍵合相穩(wěn)定性影響（II）,空間位阻保護(hù)，延緩鍵合相流失,空間位阻鍵合代表產(chǎn)品： Venusil ASB C18 Zorbax SB C18,固定相對色譜柱性能的影響： 鍵合硅膠的穩(wěn)定性,高pH值，硅膠基質(zhì)溶解,pH9時(shí)，色譜柱的穩(wěn)定性,固定相對色譜柱性能的影響： 鍵合硅膠的穩(wěn)定性,碳雜化，延硅膠緩高pH值水解,表面碳雜化 Agela Durashell RP Phenomenex Gemini,雜化顆粒： Waters Xterra,表面碳雜化示意圖,pH=12 條件下的穩(wěn)定性,4 amines, ACN/ 1% Ammonia

14、 aqueous= 25%:75%, 40oC, 4.6 x 150 mm, 5um,1h,200 h,總結(jié)：如何選擇色譜柱和相應(yīng)的色譜條件,了解目標(biāo)化合物的性質(zhì)：結(jié)構(gòu)（官能團(tuán)）、pKa、分子量、濃度范圍、溶解度、極性 了解色譜柱的性質(zhì) 粒徑，孔徑，比表面積 保留強(qiáng)度和柱效；抗污染性 基質(zhì)表面特性，鍵合類型保留強(qiáng)度，選擇性，柱效，對稱性，靈敏度，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性 選擇相應(yīng)的色譜條件,色譜柱選擇（）,替代：粒徑，比表面，基質(zhì)表面特性，鍵合類型相似 新方法開發(fā)： 粒徑：2um vs 3um vs 5um （分析時(shí)間，靈敏度，儀器，價(jià)格，壽命） 內(nèi)徑柱長：內(nèi)徑3mm vs 4.6 vs 7.8（對分離

15、影響不大，成本）；柱長與粒徑相關(guān) 比表面：（低比表面耐污染，高比表面利于分離） 孔徑：在滿足比表面前提下大孔徑較好 硅膠基質(zhì)表面特性：）盡可能使用高純硅膠；）盡可能使用低酸性硅膠；）當(dāng)流動(dòng)相盡可能使用表面雜化；）使用多硅羥基殘留，可加強(qiáng)對于極性化合物保留或削弱對于非極性化合物保留 鍵合類型：取決于選擇性和流動(dòng)相要求；具有一定極性的（）可以作為首選嘗試；耐酸：選擇；耐堿：Durashell 封尾與不封尾：封尾削弱硅羥基影響；不封尾：提高硅羥基影響，增強(qiáng)極性物質(zhì)保留，降低柱流失。,乙腈水,乙腈水,乙腈水,KH2PO4 pH=4.2,混合固定相-優(yōu)化復(fù)雜樣品分離的一個(gè)新策略,混合固定相的意義,系統(tǒng)化

16、的改變選擇性，便于優(yōu)化分離度；使難以在同一固定相上分析的強(qiáng)極性和非極性化合物得以解決 降低離子交換柱的保留強(qiáng)度，降低緩沖鹽濃度，從而使離子交換柱可以與質(zhì)譜檢測器相匹配,混合相比例與保留時(shí)間曲線,a,b,c,色譜條件 ACN : 50 mM KH2PO4 = 30:70; 1.5ml/min; 240 nm; 5 um, 300 A; 4.6250; 2 ul; Room temp.; 樣品： Phenol and melamine,通過混合柱改善分離度,SCX,SCX : ASB C8 = 9 : 1 (B0014),HPLC conditions： ACN : 50 mM KH2PO4 =

17、30 : 70; 1.5 ml/min; 35 ; 20 uL; Melamine: 2 ppm; column: 4.6 250 mm;,降低緩沖鹽濃度（倍）以用于,Sample Melamine (100ppm) LC Conditions 1 ACN : 50 mM KH2PO4 = 30 : 70;1.5ml/min; 240nm; 5ul; 5um, 300A, 4.6250mm LC Conditions 2 ACN : 10 mM KH2PO4 = 80 : 20;1.5ml/min; 240nm; 5ul; 5um, 300A, 4.6250mm Fig. a was test

18、ed under conditions 1 Fig. b and c were tested under conditions 2,a,b,c,SPE procedures Fig. a LC Condition Column: Venusil AS-T C18 (SCX/C18）2.1 150mm; 5 um, 300 Mobile Phase： ACN : Buffer = 50:50; Buffer:10mM NH4Ac, HAc adjust pH to 3.0 240nm, 0.2ml/min, 10 ul Mass Condition ESI，5KV; Capillary Temp

19、 300, Capillary Voltage 15V; N2 Flow 35 arb; Positive ion detection Scan mode: TIC (MS), TIC (MS/MS); Range (m/z) 50140,a,標(biāo)準(zhǔn)曲線,Precision: RSD=2.83% (n=5) Reproducibility：RSD=4.45% (n=5) LOD: 0.002ug/mL LOQ: 0.01ug/mL Recovery: 89.7% RSD=7.3% (n=9),空白樣品,三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品,三聚氰胺添加樣品,如何改善強(qiáng)水溶性化合物的保留和分離,改進(jìn)水溶性化合物的保留和

20、分離,使用極性反相色譜柱，高水相流動(dòng)相；調(diào)整pH值抑制分析物的離子化。 使用離子對試劑，選擇低比表面、短鏈鍵合相 使用HILIC分離技術(shù) 使用離子交換/反相混合固定相,2，-0-甲基-腺嘌呤核苷HPLC方法,RT樣品峰=18.902min RT主雜質(zhì)峰=21.024min 主峰與后雜峰 （RT=20.634min）的分離度R=7.81, 主峰后雜峰（RT=20.634min）與主要雜質(zhì)的分離度R=1.70,色譜柱：MP C18 5um 100 4.6*250mm; 波 長：260nm; 柱 溫：30; 流 速：1.0mL/min 流動(dòng)相：流動(dòng)相A：0.63g甲酸銨溶解于900ml水中，并用甲酸

21、調(diào)PH=3.00，再加水使溶液為1L,過濾即得； 流動(dòng)相B：乙腈 樣 品：流動(dòng)相A溶解，待分離樣品1mg/mL；進(jìn) 樣：5ul 梯度表：,阿奇霉素有關(guān)物質(zhì)檢測,空白,藥典方法,樣品，100%水,次黃嘌呤有關(guān)物質(zhì)分析,色譜柱：MP C18 5um 100 4.6*250mm 流動(dòng)相：0.1%磷酸氫二鈉溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.50） 流 速：1.0ml/min 柱 溫：室溫 波 長：254nm 樣 品：樣品2.0mg/ml（水溶解），對照品0.2408mg/ml（客戶原液） 進(jìn) 樣：5ul,Venusil HILIC (丙酰胺鍵合相）,鍵合相，原理和目的,丙酰胺鍵合硅膠 已腈水流動(dòng)相中主要依靠氫

22、鍵合和電子極化作用，對于多羥基，多氨基，酰胺類和有機(jī)酸有很好的保留和分離 在弱極性流動(dòng)相中，對于極性化合物的保留與相似或略低，有利于極性化合物的洗脫 水溶液中穩(wěn)定性明顯優(yōu)于氨基柱或純硅膠柱,正相條件下與氨基柱比較,Test in Traditional Normal Phase Mode Columns: 5um, 4.6 x 150 mm Mobile phase: Chloroethane/methanol/water=91.8:8:0.2 Sample: Toluene, Nitrobenzene, 4- Bromoaniline acetate, 3-nitroaniline,Unis

23、ol Amide less polar,Venusil NH2,分離模式,N-aceto uracil,uracil,Column: Venusil Silica, 5um, 4.6 x150 mm Mobile Phase: 10 mmol sodium phosphate(pH7.0)/ACN= 35/65 Temperature: ambient Detection: UV 254 nm,分離模式,N-aceto uracil,uracil,Column: Venusil HILIC, 5um, 4.6 x150 mm Mobile Phase: 10 mmol sodium phosp

24、hate(pH7.0)/ACN= 35/65 Temperature: ambient Detection: UV 254 nm,Venusil HILIC (丙酰胺固定相）,N-aceto uracil,Ganciclovir,Ganciclovir,Column: Venusil Hilic, 5um, 4.6 x150 mm Mobile Phase: 10 mmol sodium phosphate(pH7.0)/ACN= 35/65 Temperature: ambient Detection: UV 254 nm,水溶性維生素分離,Time,Samples: VB1, VB6, V

25、C, VB2 HPLC Conditions Column: Venusil HILIC 4.6 x 150 mm, 5um Mobile Phase：0.1%TFA:ACN = 90:10 Det: 280nm; Flow: 1.0mL/min; Temp: 30； Inj: 2 L, Column, 5m, 4.6mm150mm Part No.: 951505-0,Brand P , NH2 Column, 5m, 4.6150mm,Brand W Silica Column, 5m, 4.6150mm,Mobile Phase:A: 0.1% TFA in Water ；B: 0.1%

26、 TFA in Acetonitrile A:B = 90:10 Flow Rate:1 mL/min Temperature:30 Detection:UV280 nm Sample: VB1+VB6+VC+VB2,選擇性比較,VB1+VB6+VC+VB2,VC+VB6+VB1+VB2,VB1+VB6+VB2+VC,穩(wěn)定性比較 (aging: pH=7, 20 mM phosphate buffer/MeOH=40/60; 100h),100h,Venusil HILIC,silica,VB1,VB2,VB1,VC,VB2,VB1,VC,VB6,VB2,VB1,VB2,VB6,VB1,VB2

27、,VB1,VB2,35 h,100h,NH2,Decitabine and Impurity Analysis,Venusil HILIC 4.6150mm，5m，ACN： H2O964，1ml/min， UV244nm，room temp.,Analysis of Acarbose and Impurity,ACN : KH2PO4(4.4 mmol/L) -Na2HPO4(2.0 mmol/L) = 70 : 30; 1.5 ml/min; 35 ; 210 nm; Venusil HILIC，5 um，100 ，4.6 150 mm,Separation of Shikimic Acid

28、 (3,4,5, trihydroxy-1-cyclohexene-1-carboxylic acid,Venusil HILIC 4.6 x 250 mm, 5um; ACN/1% formic acid 90-60% in 20 min, ambient temperature, 1mL/min, UV210 nm,Comparison: Validamycin,Atlantis-C18( AQ), 4.6 x 250 mm, TFA 1%,Venusil HILIC , 4.6 x 250 mm, ACN/water 85-40% in 30 min, UV 210nm,博納艾杰爾科技及

29、其產(chǎn)品介紹汪群杰,Who is America-gel-Asia Technologies?,2004成立于美國特拉華州，開發(fā)和生產(chǎn)液相色譜填料和色譜柱 2005年成立北京艾杰爾科技有限公司，負(fù)責(zé)艾杰爾科技產(chǎn)品的中國和亞洲市場開發(fā) 2007年在天津?yàn)I海新區(qū)成立博納艾杰爾科技有限公司，投資近2000萬，建立中國最大色譜分離材料研發(fā)和生產(chǎn)基地；產(chǎn)品擴(kuò)充到5大類，上千個(gè)規(guī)格 2008銷售額3400萬；2009年目標(biāo)5000萬；,核心業(yè)務(wù),分離材料,固相萃取,解決方案,固相萃取和色譜 分離純化設(shè)備,創(chuàng)新成就夢想!,全球最大色譜柱研發(fā)團(tuán)隊(duì)之一：歸國博士4名；碩士12名，本科11名 開發(fā)色譜相關(guān)設(shè)備和材料

30、5大類（液相色譜柱、固相萃取柱、快速純化柱、全自動(dòng)制備色譜儀、固相萃取儀），近百個(gè)系列，上千個(gè)規(guī)格的商業(yè)化產(chǎn)品；申報(bào)專利11個(gè)（其中2個(gè)已獲授權(quán)） 2006年10月成功主標(biāo)科技部十一五重大支撐項(xiàng)目項(xiàng)目中的課題四“高性能色譜填料和色譜柱的研制”；成功參標(biāo)科技部十一五重大項(xiàng)目科研試劑項(xiàng)目中“固相萃取材料的研制與開發(fā)” 入圍天津市2009年15個(gè)自主創(chuàng)新重大專項(xiàng),不斷完善的質(zhì)量保證體系,充分的技術(shù)投入以打造堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ) 質(zhì)量方針：質(zhì)量第一、全員參與；滿足客戶，不斷進(jìn)取 全方位質(zhì)量控制體系：研發(fā)、原材料供應(yīng)、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量檢驗(yàn)、跟蹤/反饋 2007年10月成功獲得ISO9001質(zhì)量認(rèn)證 - 2007

31、年分別通過美國第一大和 第二大集成供貨商THERMO Fisher 和VWR公司的現(xiàn)場考核,全球一體化的研發(fā)、生產(chǎn)、銷售和服務(wù),公司分布： Newark, Delaware, USA：研發(fā)和銷售中心 天津：2600m2 研發(fā)、生產(chǎn)和物流中心 國內(nèi)辦事處：北京、上海、廣州、杭州、南京、濟(jì)南、鄭州、沈陽 全球銷售渠道和客戶： - 26 代理商遍布全球五大洲，包括美國、加拿大、日本、法國、德國、印度、韓國、泰國、巴西、南非等。 - VWR （全球第二大實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和耗材供應(yīng)商）的6大色譜產(chǎn)品供應(yīng)商之一 - 全球客戶包括著名儀器廠家Thermo；著名制藥企業(yè) 默克（默沙東）、莉萊、Amgen、Sanof

32、i、Shering-Plough； 著名制藥技術(shù)服務(wù)公司 考文斯、XenoBiotek、QPS、Frontage Labs。,客戶評價(jià)Merck,“the ASB C18 column outperformed any other column I could get my hands on and I was able to handle the hundreds of COMT compounds I was presented with.” McClain Ray T., Ph.D Merck Plates:3224,After column washing and re-equilib

33、rium in 100% water (0.1% formic acid); Plates:3045,After 500 sample injections; Plates:2810,Sample: uridine of calf blood plasm (dilute 20 times with 0.1% formic acid) Injection: 1uL Column: Unisol C18 2.150mm,5m Flow:0.3mL/min Mobile phase: 0.1% formic acid solution (100% aqueous phase) Injection frequency：500 /8min, After 500 injection, wash with methanol /0.1% formic acid solution =50/50 for 30mins，column temperature 40 ; rinse with 95%MeOH for 30mins, column temperature