簡化糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化與現(xiàn)狀.ppt

1、糖化血紅蛋白的現(xiàn)狀與標(biāo)準(zhǔn)化,馮仁豐,糖尿病的嚴(yán)重性,糖尿病是全世界主要的公共的健康問題，已經(jīng)影響了幾億人。 美國糖尿病的發(fā)病率為5.1%。另外，發(fā)病率正在快速增長：年齡在4074歲的人群，在19761980年發(fā)病率為8.9%，19881994年上升為12.3%。 疾病并發(fā)癥很嚴(yán)重：視力喪失、腎衰、非外傷性的截肢等。,糖尿病的嚴(yán)重性,疾病的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)很重，據(jù)1992年實際計算，費用為1000億美金；估計每7個健康美國人的錢用于一個糖尿病病人，主要用于處理治療糖尿病的慢性并發(fā)癥，而不是初級預(yù)防。 我國的糖尿病發(fā)病率同樣很高。最近報道：上海的糖尿病發(fā)病率為10。,認(rèn)識糖尿病的重大步驟,美國衛(wèi)生部（U.

2、S.Department of Health and Human Services ） 美國衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health,NIH） 美國國家糖尿病、消化病、腎病研究院（National Institute of Diabetes and Dogestive and Kidney Diseases，NIDDK），于1983年開展了9年的糖尿病控制與并發(fā)癥研究（Diabetes Control and Complications Trial，DCCT) 。,引起糖尿病并發(fā)癥的原因很復(fù)雜，特別是糖血癥和并發(fā)癥的關(guān)系已經(jīng)被關(guān)注了50年。 研究說明，使血糖水平盡

3、可能保持于正常水平，有可能減緩因糖尿病引起的眼、腎、與神經(jīng)等疾病的出現(xiàn)與進(jìn)展。事實上，顯示了如果個體具有血糖控制不良史的，能維持降低血糖的都有好處。,DCCT認(rèn)識糖尿病的重大步驟,依據(jù)DCCT結(jié)果，NIH、美國糖尿病學(xué)會（American Diabetes Association,ADA）和其他專家組建議：對所有糖尿病病人治療時，應(yīng)該使血糖水平控制到正常水平，以減少并發(fā)癥。也是第一次依據(jù)DCCTGHB值，確定了科學(xué)的血糖目標(biāo)。例如，ADA 推薦所有糖尿病病人必須將GHB控制在以下（非糖尿病的參考范圍為）；超過的病人應(yīng)該考慮需要“有進(jìn)一步的措施”。,DCCT認(rèn)識糖尿病的重大步驟,什么是糖化蛋白？

4、,糖尿病病人的血液內(nèi)糖濃度較健康人要高，血液中的各種蛋白“浸潤”于富含糖的環(huán)境中。引起葡萄糖等加成于蛋白上，形成 “糖化”蛋白。 葡萄糖及其他單糖和蛋白質(zhì)的自由氨基反應(yīng)，取決于它們的濃度。另一方面，就蛋白質(zhì)而言，各氨基的pK和鄰近的多肽結(jié)構(gòu)是反應(yīng)的關(guān)鍵限速步驟。這種不可逆的、非酶催化的反應(yīng)稱為糖基化。,什么是糖化蛋白？,如：糖化血清/血漿蛋白；因血漿蛋白的半衰期和濃度不同以及有時體內(nèi)波動相對大，用于常規(guī)監(jiān)測糖尿病病人長期血糖狀態(tài)較差。使用得很少。 紅細(xì)胞內(nèi)的糖化血紅蛋白作為一個長期的參數(shù)評定血糖濃度特別適合。,糖化血紅蛋白,血紅蛋白的半衰期定義為紅細(xì)胞存活時間，相對恒定在100120天。除血紅

5、蛋白半衰期的影響外，糖化程度基本取決于血糖升高的程度以及持續(xù)時間。因此檢測糖化血紅蛋白對于了解病人在以往的生活中，控制血糖是否良好是很有用的項目。,糖化血紅蛋白的歷史,早于1955年，研究者注意到成年人血紅蛋白為非均相的。 1958年，Allen報告，在離子交換層析上的人血紅蛋白可以被分離出三個小的組分，它們較HbA的負(fù)電荷更強(qiáng)。這三個血紅蛋白被命名為HbA1a、HbA1b、HbA1c。但是，并沒有被認(rèn)識到與糖尿病的關(guān)系。 Rahbar使用瓊脂電泳，報告糖尿病患者的這些小血紅蛋白組升高。,在1970年代中期，弄清楚了是葡萄糖對血紅蛋白HbA的非遺傳修飾，產(chǎn)生了HbA1c；HbA1c與空腹葡萄糖

6、、糖耐量試驗時的葡萄糖峰值、葡萄糖耐量試驗的曲線下的面積、以及在以往數(shù)個星期的平均葡萄糖水平等均有關(guān)系。 1980年早期，GHB試驗被廣泛應(yīng)用。,糖化血紅蛋白的歷史,血紅蛋白（Hb）,成年人的血紅蛋白通常的組成為： Hb A （占總的97）； Hb A2 （占總的2.5）； Hb F （占0.5）。 每個Hb A有四條多肽鏈兩個為a-鏈、兩個為b-鏈。,人的血紅蛋白,糖化血紅蛋白,根據(jù)每個糖化位點和反應(yīng)參與物，總的糖化血紅蛋白可分成若干個亞組分。 天然（非糖化）血紅蛋白是Ao（2、2鏈）HbAo。 血紅蛋白-鏈N-末端纈氨酸的游離氨基與不同碳水化合物糖基化形成糖化亞組分（HbA1a1，HbA1

7、a2，HbA1b和HbA1c）。這些亞組分總稱為HbA1。,糖化血紅蛋白,除了血紅蛋白鏈的N-末端纈氨酸外，血紅蛋白分子內(nèi)其它游離氨基也參與糖基化（鏈N末端纈氨酸、賴氨酸-氨基）。相對于HbA1，所有-鏈N-末端和其它游離氨基糖基化的血紅蛋白被稱作總糖化血紅蛋白。,糖化血紅蛋白,除基本的成人血紅蛋白A0外，在健康人里發(fā)現(xiàn)少量的胎兒血紅蛋白HbF（2a，2g鏈）和血紅蛋白A2（2a、2d鏈）。纈氨酸在g鏈N-末端，以類似的方式糖基化，例如，通過與葡萄糖的共價鍵形成HbA2c。,糖化血紅蛋白（GHB或HbA1）,糖化血紅蛋白（GHB或HbA1）,糖化血紅蛋白結(jié)果的表示,糖化血紅蛋白結(jié)果以糖化血紅蛋

8、白量在總的血紅蛋白量中的比率表示：,GHB檢測結(jié)果差異大,1970年代后期，常規(guī)實驗室開始進(jìn)行GHB的檢測。而DCCT 發(fā)表結(jié)果在1993年，當(dāng)時已經(jīng)有許多不同的GHB 的檢測方法，實驗室間的結(jié)果無可比性。DCCT GHB的結(jié)果是為研究服務(wù)的，一般的糖尿病病人和醫(yī)務(wù)人員還無法使用。所以兩個不同的方法，對同一份血標(biāo)本的結(jié)果差異很大。CAP Survey的GHB結(jié)果數(shù)據(jù)反映，即使相似的方法結(jié)果差異很大，室間變異系數(shù)很大。,CAP調(diào)查,測定糖化血紅蛋白的方法,按照電荷差異的離子交換層析、HPLC、電泳、等電聚焦等； 按照結(jié)構(gòu)差異的親和層析、免疫測定； 或化學(xué)反應(yīng)：光電比色、分光測定等。 無論什么方法

9、，報告結(jié)果均以總血紅蛋白的表示。,離子交換層析技術(shù),使用陽離子交換樹脂（陰性電荷）柱。使患者標(biāo)本溶血，用溶血液上柱。選擇洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度與pH，使糖化血紅蛋白的陽性電荷弱于血紅蛋白HbA，使它不能與樹脂結(jié)合，首先洗脫下來。用分光檢測糖化血紅蛋白（即：HbA1中的A1cA1bA1c）。用第二個緩沖液洗脫血紅蛋白主要部分，在分光光度計上的讀數(shù)為總血紅蛋白。糖化血紅蛋白HbA1表示為總血紅蛋白的百分率。,高效液相層析（HPLC）,使用HPLC可以分離HbA1c與其他血紅蛋白組分。HPLC檢測的原理是陽離子交換樹脂層析。當(dāng)樣品注射上柱后，使用增加離子強(qiáng)度的磷酸鹽緩沖液逐步洗脫血紅蛋白，在415與6

10、90 nm檢測。該方法全自動，有商品。可以報告HbA1和HbA1c。所有HPLC方法均具有優(yōu)良的精密度。HPLC的Hb A1c在DCCT中，用于所有患者樣品的檢測，被推薦為參考方法。,GHB標(biāo)準(zhǔn)化,1993年，在DCCT結(jié)果公布前，美國臨床化學(xué)學(xué)會(AACC)成立了糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化委員會。委員會的任務(wù)是：實現(xiàn)糖化血紅蛋白可比性。雖然，委員會的第一個目標(biāo)是實現(xiàn)美國實驗室的可比性，肯定了實現(xiàn)GHB檢測國際可比性的重要性；為此，委員會成員包括了歐洲成員，他們在GHB 的可比性和室間評估上有豐富的經(jīng)驗。,GHB標(biāo)準(zhǔn)化,AACC首先確定了，實現(xiàn)可比性計劃的重要內(nèi)容是建立合適的GHB確認(rèn)參考方法和純化G

11、HB的參考標(biāo)準(zhǔn)。在尚無確立參考標(biāo)準(zhǔn)前，委員會建議，在研究和建立純化參考標(biāo)準(zhǔn)和確認(rèn)參考方法時，可以學(xué)習(xí)膽固醇參考方法實驗室網(wǎng)絡(luò)方式進(jìn)行可比性計劃。,GHB標(biāo)準(zhǔn)化,開始時以DCCT參考實驗室作為可比性依靠者，可以加快標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程。常規(guī)實驗室使用協(xié)調(diào)的GHB檢測方法，使報告GHB檢測結(jié)果可以和DCCT值比較；這樣為糖尿病病人和他們的醫(yī)務(wù)人員提供的檢驗結(jié)果可以對平均糖血癥和并發(fā)癥危險予以確認(rèn)。,DCCT的GHB標(biāo)準(zhǔn)化,DCCT參考系統(tǒng)由2部分組成1個在密蘇里大學(xué)（University of Missouri），另1個在明尼蘇達(dá)大學(xué)(University of minnesoda)。密蘇里實驗室是離子交換

12、高效液相層析（HPLC）系統(tǒng)模式，是指定的比較方法，作為DCCT的參考可比者。明尼蘇達(dá)實驗室有自動離子交換HPLC系統(tǒng)，用于GHB測定。實驗室進(jìn)行常規(guī)研究標(biāo)本的分析用。,NGSP,AACC委員會圍繞DCCT參考實驗室發(fā)展了可比性方案，該方案在1995年被美國廠商的協(xié)調(diào)委員會認(rèn)可。1996年AACC委員會解散，被國家糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計劃（National Glycohemoglobin Standardization Program, NGSP）替代，在1996年7月開始工作。,NGSP的任務(wù),NGSP的首要任務(wù)是支持廠商建立完整的校準(zhǔn)，確定他們的檢測結(jié)果和DCCT數(shù)據(jù)的可比性。1996年5月

13、CAP GHB的室間評估計劃開始，是對NGSP的重要配合。使用的是新鮮全血標(biāo)本。1996年12月，第一組GHB檢測方法被正式核實和認(rèn)可為：其檢測結(jié)果可以和DCCT參考方法結(jié)果具可比性。1997年ADA認(rèn)可NGSP。,DCCT結(jié)果的臨床意義,1993年發(fā)表的DCCT結(jié)果說明，在GHB水平和發(fā)展糖尿病并發(fā)癥危險間具有直接關(guān)系。所以要求使各實驗室的GHB結(jié)果和DCCT值具有可比性成為必須了。毫無問題，如果僅確定GHB值在或超出實驗室的正常范圍，意義不大。需要更精確地了解：這個檢測值和DCCT值的關(guān)系是什么？因為只有DCCT結(jié)果直接和平均血糖和后果危險有關(guān)。,ADA對DCCT結(jié)果的認(rèn)可,DCCT結(jié)果對

14、病人治療是如此重要，在DCCT結(jié)果發(fā)表的幾個月內(nèi)，美國糖尿病學(xué)會(ADA)發(fā)表了依據(jù)特定DCCT GHB的檢測結(jié)果，確定糖尿病治療目標(biāo)的規(guī)定。所以，這是臨床后果的數(shù)據(jù)，使GHB檢驗具有可比性被高度重視。,NGSP網(wǎng)絡(luò)的作用,作為GHB可比性，NGSP保持參考實驗室的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)被校準(zhǔn)至DCCT參考值。中心實驗室設(shè)定初次校準(zhǔn)，并負(fù)責(zé)監(jiān)視網(wǎng)絡(luò)實驗室。網(wǎng)絡(luò)實驗室直接和GHB測定方法廠商工作，首先校準(zhǔn)它們的方法，使他們能提供相當(dāng)于DCCT的值，然后按照方案，提供方法確認(rèn)的比較數(shù)據(jù)。,NGSP對于測定方法具有高精密度的、能和網(wǎng)絡(luò)實驗室在新鮮樣品比較結(jié)果上具有所需的可比性的，給予認(rèn)可。以常規(guī)實驗室檢測的新

15、鮮調(diào)查品的室間質(zhì)量評估結(jié)果評估認(rèn)可過程的整個有效性。,NGSP網(wǎng)絡(luò)的作用,NGSP網(wǎng)絡(luò)的作用,總之，可比性過程有三個主要步驟： 第一步是對廠商的測定方法進(jìn)行校準(zhǔn)，使GHB結(jié)果和某NGSP的網(wǎng)絡(luò)實驗室結(jié)果具有可比性； 第二步是由廠商確認(rèn)檢測，用多個新鮮血樣品實現(xiàn)方案確定的可比性； 第三步是各實驗室參加室間評估，對具有NGSP實驗室網(wǎng)絡(luò)定值的新鮮全血樣品檢測。,使用NGSP確認(rèn)方法的基本原理,DCCT說明了GHB檢測和糖尿病的血糖控制、以及發(fā)展為微血管和神經(jīng)病并發(fā)癥危險的關(guān)系。DCCT提供了：為了使糖尿病病人降低并發(fā)癥危險，要求控制GHB和血糖靶值目標(biāo)的最新科學(xué)基礎(chǔ)。,ADA建議：醫(yī)生協(xié)調(diào)的保健機(jī)

16、構(gòu)應(yīng)該重視臨床試驗的結(jié)果，如對1型糖尿病病人治療目標(biāo)時，注意DCCT設(shè)定各個血糖的靶值。目前使用的糖尿病控制推薦GHB靶值來自DCCT導(dǎo)則。醫(yī)生和保健機(jī)構(gòu)應(yīng)確保他們實驗室檢測的GHB結(jié)果是否和DCCT具有可比性。,使用NGSP確認(rèn)方法的基本原理,使用NGSP確認(rèn)的方法可以使臨床實驗室的GHB結(jié)果在數(shù)字上和DCCT結(jié)果相當(dāng)，也可以和其他使用NGSP確認(rèn)方法的臨床實驗室結(jié)果互相比較。所以被NGSP確認(rèn)的方法提供了最佳使用GHB檢測的結(jié)果。,使用NGSP確認(rèn)方法的基本原理,選擇GHB檢測方法考慮要點,為了確保某實驗室的結(jié)果可以在數(shù)字上可以和DCCT結(jié)果相當(dāng)，并和其他實驗室結(jié)果具可比性，ADA建議：實

17、驗室只使用被NGSP確認(rèn)的GHB的檢測方法。除了能提供和DCCT結(jié)果具有可比性、可以使用由DCCT建立的參考范圍外，NGSP確認(rèn)的方法具有良好的重現(xiàn)性；它的總不精密度小于5%，這是廠商進(jìn)行確認(rèn)評估時要求的。,英國UKPDS,1998年英國前瞻性糖尿病研究（UK Prospective Diabetes Study, UKPDS）發(fā)表了結(jié)果。對2型糖尿病病人進(jìn)行了10年研究，重復(fù)了DCCT的發(fā)現(xiàn)，即并發(fā)癥的減少和GHB的降低有關(guān)。UKPDS使用了NGSP認(rèn)可的GHB測定方法，另外，參與NGSP參考網(wǎng)絡(luò)仔細(xì)的比較過程來確保DCCT和UKPDS 檢測結(jié)果間的可比性。所以，DCCT和UKPDS二者的G

18、HB結(jié)果都可以用于1型或2型糖尿病的病人，估計未來發(fā)展為并發(fā)癥個人危險。,NGSP標(biāo)準(zhǔn)化的效果,依據(jù)DCCT的參考方法實施標(biāo)準(zhǔn)化過程，NGSP對實驗室間的GHB的可比性有了巨大的改進(jìn)。2003年CAP的GH2調(diào)查，使用NGSP確認(rèn)方法的參加實驗室，98的報告為HbA1c或HbA1c等當(dāng)值。在瑞典與日本有相似的標(biāo)準(zhǔn)化計劃，使GHB結(jié)果的變異有了顯著的下降。,NGSP對實驗室的認(rèn)證,進(jìn)行HGB檢測的實驗室，必須向NGSP申請被認(rèn)可。并不是使用了被NGSP認(rèn)證的方法（廠商產(chǎn)品）的結(jié)果，就被認(rèn)為符合要求。 只有接受了來自NGSP全血樣品檢測，獲得認(rèn)可的實驗室，才被認(rèn)為：該實驗室可以報告出與NGSP一致

19、的結(jié)果。 這樣的認(rèn)可，每年一次。不保持永遠(yuǎn)有效。,IFCC標(biāo)準(zhǔn)化,在AACC進(jìn)行協(xié)調(diào)GHB結(jié)果可比性的計劃的同時，1995年IFCC組成了HbA1C標(biāo)準(zhǔn)化工作組（IFCC-WG）以實現(xiàn)檢測的統(tǒng)一國際標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)展和確認(rèn)了2個侯選參考方法和HbA1C、HbAo參考物，作為全球可比性分析準(zhǔn)確度的基礎(chǔ)。,幾乎所有商品的檢測都說檢測的是HbA1C形式的糖化血紅蛋白，實際上，有些測定是檢測血中糖化血紅蛋白的總和，但是這些方法都說明以指定的比較方法檢測的HbA1C標(biāo)準(zhǔn)化。DCCT的參考方法檢測的值，并不是真正的唯一HbA1C值。,糖化血紅蛋白（GHB HbA1C）,HPLC方法常被用做“參考方法”，因為精密度

20、好、結(jié)果長期穩(wěn)定，但是非特異。同一個血樣，依據(jù)不同的層析系統(tǒng)會得到不同的HbA1C的結(jié)果。如：樹脂的類型、樹脂的批間差、柱的大小、緩沖液的組成、洗脫時間等。認(rèn)為是HbA1C的峰，但是依據(jù)定義可以不是HbA1C，由于可能缺少免疫活性、或在親和層析時不能結(jié)合等。一些方法間的差異可以很大。,糖化血紅蛋白（GHB HbA1C）,被美國DCCT研究與在NGSP計劃中指定作為比較方法的Bio-Rad 70 HPLC方法；在瑞典推薦Mono S HPLC方法為標(biāo)準(zhǔn)化方法；它們間在判斷限水平處的差異達(dá)20，事實說明這些方法并不僅檢測出HbA1C。很清楚，沒有一個方法在計量上真正符合參考方法要求。,糖化血紅蛋白

21、（GHB HbA1C）,IFCC的HbA1C國際標(biāo)準(zhǔn)化,為了克服這個標(biāo)準(zhǔn)化差的問題，IFCC建立了工作組，以確定國際標(biāo)準(zhǔn)化。工作組決定發(fā)展一個參考系統(tǒng)，使常規(guī)方法可以溯源。參考系統(tǒng)的主要組成是參考方法，它能特異地檢測HbA1C，是對參考物質(zhì)定值的必須手段。方法被要求可特異地檢測血紅蛋白b-鏈糖化N-端殘基。,經(jīng)研究和實驗確定，有兩個分析方法被證實適合要求：HPLC/電霧離子化質(zhì)譜方法（HPLC-ESI/MS）與HPLC/毛細(xì)管等電聚焦電泳方法（HPLC-CE）。二者原理與工作均很好，并得到一樣的結(jié)果。適應(yīng)參考實驗室使用設(shè)備的方便，確認(rèn)了兩個參考方法。,IFCC的HbA1C國際標(biāo)準(zhǔn)化,參考方法程

22、序流程,溶血液,酶切分解,HPLC-毛細(xì)管電泳,HPLC-質(zhì)譜,血紅蛋白鏈蛋白水解的原理,IFCC參考方法的步驟,一共為三步： 紅細(xì)胞分離與溶解 分離人紅細(xì)胞，清洗后用水溶血，儲存于pH6.2的緩沖液。 血紅蛋白的酶解離 使用蛋白酶（endoproteinase Glu-C）水解血紅蛋白，形成多肽混合物，其中有b鏈的糖化（HbA1c）和非糖化（HbAo）的N-端六肽。,分析與校準(zhǔn) 分析檢測糖化與非糖化六肽的比率?？梢杂蒆PLC-ESI/MS（方式A）或HPLC-CE（方式B）作分析。依據(jù)檢測層析血紅蛋白N-端六肽的面積，計算糖化與非糖化多肽的比率。校準(zhǔn)品內(nèi)由純HbA1c和HbAo參考物質(zhì)組成，

23、用于校準(zhǔn)。,IFCC參考方法的步驟,IFCC HbA1C參考物質(zhì),HbA1C參考物質(zhì)：糖化N-端b-鏈人血紅蛋白，純度95；使用標(biāo)準(zhǔn)加入方式確定含量。 HbAo參考物質(zhì)：非糖化N-端b-鏈人血紅蛋白，純度99。,純HbA1C與純HbAo的混合物是參考方法的校準(zhǔn)品。HbA1C與HbAo被分離、純化至均一，并被確定特性。純化與確定特性使用的技術(shù)為離子交換與親和層析，以及HPLC、毛細(xì)管等電聚焦、電霧化的離子化質(zhì)譜和多肽圖譜等。,IFCC HbA1C參考物質(zhì),使用這些方法，對健康的非糖尿病自愿者的血紅蛋白純化，再以離子交換層析（Mono S）確定純度為：HbAo99.%；HbA1C98.5。 但是，

24、從多肽圖譜上顯示了：在HbA1C制品內(nèi)仍然有約5的非N-端b-鏈糖化血紅蛋白和HbA1C一起，從Mono S柱上洗脫下來。這個組分的確實量，采用：標(biāo)準(zhǔn)加入、酶切、最后對產(chǎn)生的b-N-端多肽定量。二者的血紅蛋白量使用ICSH參考方法確定。,IFCC HbA1C參考物質(zhì),HbAo參考物質(zhì)的質(zhì)譜圖,HbA1C參考物質(zhì)的質(zhì)譜圖,HPLC非特異掃描的所有酶解后的多肽,特異性掃描HbA1c與HbAo,4個HPLC-MS方法與6個HPLC-CE方法結(jié)果的比較,11個參考實驗室對10例標(biāo)本檢測的結(jié)果,NGSP與IFCC計劃的主要特征,1996年建立了美國國家糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計劃（NGSP）。,1995年，國

25、際臨床化學(xué)學(xué)會（IFCC）成立HbA1C標(biāo)準(zhǔn)化工作組。,NGSP,IFCC,組成,NGSP與IFCC計劃的主要特征,使糖化血紅蛋白檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，要求各實驗室的檢測結(jié)果與DCCT參考實驗室具有可比性。DCCT的報告中已明確了GHB與血糖平均水平和糖尿病并發(fā)癥發(fā)展的危險關(guān)系。,開發(fā)了使所有檢測HbA1C的常規(guī)方法進(jìn)行國際標(biāo)準(zhǔn)化的參考檢測系統(tǒng)，有參考物質(zhì)與參考方法?？梢詫崿F(xiàn)溯源性。但是，臨床應(yīng)用價值必須詳細(xì)說明IFCC值與DCCT值的關(guān)系。,NGSP,IFCC,任務(wù),NGSP與IFCC計劃的主要特征,HbA1c是根據(jù)指定的比較方法檢測的層析圖中的選定峰值定義的。指定的檢測方法與DCCT參考實驗室方

26、法一致，為HPLC方法，采用Bio-Rax 70樹脂分離層析。,HbA1C是根據(jù)非糖化與糖化血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)，建立HbA1C與HbAo參考物為標(biāo)準(zhǔn)、以確認(rèn)的參考方法，經(jīng)對樣品的紅細(xì)胞分離、溶血、酶解血紅蛋白、用HPLC-ESI/MS或HPLC-CE方法檢測。,NGSP,IFCC,原理,NGSP與IFCC計劃的主要特征,由DCCT參考實驗室對新鮮全血樣品檢測，形成冰凍全血。分發(fā)給廠商，校準(zhǔn)廠商結(jié)果。,直接具有HbA1C與HbAo純物質(zhì)。用配制方法形成參考方法標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)參考實驗室與廠商間對新鮮全血檢測的比對符合要求后，由廠商實驗室確定校準(zhǔn)品的定值。,NGSP,IFCC,校準(zhǔn),NGSP與IFCC計劃

27、的主要特征,NGSP網(wǎng)絡(luò)包括一個一級參考實驗室、一個候補(bǔ)的參考實驗室、遍布全美和歐洲的二級參考實驗室。二級參考實驗室的檢測方法有：離子交換HPLC、親和HPLC、毛細(xì)管電泳、和免疫測定。這些實驗室必須定期接受一級參考實驗室下發(fā)的全血標(biāo)本被監(jiān)視。,IFCC網(wǎng)絡(luò)用于IFCC參考系統(tǒng)與各廠商、EQAS等提供服務(wù)。網(wǎng)絡(luò)由618個參考實驗室組成。 網(wǎng)絡(luò)實驗室每年參加兩次實驗室間比較，依據(jù)網(wǎng)絡(luò)的指標(biāo)（CV2.5，所有實驗室對于均值的離差2.5）更新他們證實的狀態(tài)。,NGSP,IFCC,網(wǎng)絡(luò),NGSP與IFCC計劃的主要特征,廠商與實驗室均可參加認(rèn)證過程，估計精密度和與DCCT值的相對誤差。建立與DCCT的

28、溯源性。目前全球有超過98的實驗室以NGSP為準(zhǔn)。,每年一次準(zhǔn)備8個混合全血，發(fā)送給網(wǎng)絡(luò)實驗室和參加的廠商。IFCC網(wǎng)絡(luò)為每個全血定值，廠商將用來校準(zhǔn)他們的檢測方法。廠商也預(yù)定參加監(jiān)視計劃，該計劃由IFCC連續(xù)提供樣品（每年24個樣品）。,NGSP,IFCC,服務(wù),HbA1c檢測的現(xiàn)實問題,由于美國等較早地注意到實現(xiàn)實驗室間GHB檢測結(jié)果的可比性的重要性，經(jīng)過長期的努力，形成了NGSP/UKPDS系統(tǒng)，以DCCT參考實驗室的值，統(tǒng)一了全球GHB結(jié)果。 大量的臨床研究，肯定了DCCT的GHB值與臨床治療糖尿病應(yīng)用的價值。但是，不能以此對患者作糖尿病的診斷。,DCCT證實了GHB（HbA1C）與糖

29、尿病患者平均血糖濃度間的線性關(guān)關(guān)系。 NGSP/UKPDS系統(tǒng)臨床應(yīng)用效果肯定，全球應(yīng)用廣泛。 雖然，DCCT參考實驗室認(rèn)為，他們檢測的GHB就是糖化血紅蛋白的HbA1C；但是，沒有HbA1C純物質(zhì)予以證實。在溯源性上不明確。,HbA1c檢測的現(xiàn)實問題,DCCT參考系統(tǒng)的結(jié)果是建立于2個參考實驗室的工作。該系統(tǒng)沒有認(rèn)可的參考物質(zhì)。必須在嚴(yán)格控制參考實驗室方法的檢測條件下，確保結(jié)果重現(xiàn)性良好。,HbA1c檢測的現(xiàn)實問題,IFCC系統(tǒng)從檢測上是完整的： 提供了非糖化的b-鏈N-端血紅蛋白純物質(zhì)（HbAo）；也提供了被葡萄糖加成的b-鏈N-端糖化血紅蛋白純物質(zhì)（HbA1C）。 具有兩個參考方法，其檢

30、測的可靠性由純物質(zhì)予以確認(rèn)。 所以，IFCC系統(tǒng)的結(jié)果有強(qiáng)烈的溯源性。,HbA1c檢測的現(xiàn)實問題,明確IFCC與NGSP網(wǎng)絡(luò)間的關(guān)系,在整個檢測范圍內(nèi)，IFCC結(jié)果總是比NGSP偏低1.52。形成了主要等式 （NGSP 0.915IFCC+2.15）。 這個等式將IFCC結(jié)果與DCCT（Diabetes Control and Complications Trial，糖尿病控制與并發(fā)癥研究）、英國前瞻性糖尿病研究（United Kingdom Prospective Diabetes Study，UKPDS）臨床有意義的HbA1c結(jié)果聯(lián)系起來。該主要等式也為NGSP提供了可溯源至較高的參考方法

31、。,明確IFCC與NGSP網(wǎng)絡(luò)間的關(guān)系,IFCC還是NGSP結(jié)果？,全球應(yīng)報告什么結(jié)果？決定實施新參考方法的事宜，應(yīng)由相應(yīng)的國際學(xué)會協(xié)調(diào)。IFCC結(jié)果以準(zhǔn)確為依據(jù)；NGSP結(jié)果可以直接與臨床后果、以及糖尿病治療目標(biāo)有關(guān)。雖然IFCC/NGSP有很好的相關(guān)，但是，絕對值不一。IFCC數(shù)值沒有DCCT(NGSP)-數(shù)值的轉(zhuǎn)換，無法與臨床后果有關(guān)系。,IFCC還是NGSP結(jié)果？,經(jīng)研究，轉(zhuǎn)換IFCC的HbA1c數(shù)值關(guān)系為：MBG(mmol/L)1.84 IFCC-HbA1c 如果這個關(guān)系能被各個研究確認(rèn)，就可以從報告HbA1c指示平均血糖。這個方式的優(yōu)點包括檢測的完全的修訂，伴隨新的參考范圍，將避免

32、混淆；（當(dāng)然，再教育十分必要）；范圍簡化了，讓糖尿病患者從自己的血糖儀就可以理解自己的靶值；在診斷模式上增加了使用的可能性。,IFCC還是NGSP結(jié)果？,今后怎么辦？,ADA/EASD/IDF的HbA1c工作組，建立于2004年，目的是使HbA1C報告一致。 美國糖尿病學(xué)會（ADA） 歐洲糖尿病研究學(xué)會（European Association for the Study of Diabetes，EASD） 國際糖尿病學(xué)會（International Diabetes Federation，IDF） 對全球報告HbA1C結(jié)果具有可比性無異議。,立即實施 1接受IFCC方法參考方法，作為廠商校準(zhǔn)

33、HbA1c檢測的新的全球標(biāo)準(zhǔn)。 2使用新的IFCC方法學(xué)在現(xiàn)有的國際實驗室網(wǎng)絡(luò)內(nèi)確定為“國際證實過程”。 3廠商不需改變現(xiàn)有的報告方式，直至完成以后的工作（即證實IFCC值在臨床上的應(yīng)用價值）；目前繼續(xù)使用DCCT/UKPDS值。,ADA/EASD/IDF的HbA1c工作組推薦,3年后 1要確定是否還有各個研究的數(shù)據(jù)，將HbA1C與MBG聯(lián)系起來。特別是2型糖尿病患者的數(shù)據(jù)最有價值。 2設(shè)計與進(jìn)行對全球不同人群的前瞻性研究，以確認(rèn)/建立HbA1C/MBG關(guān)系。 3對新報告系統(tǒng)計劃對公眾與醫(yī)學(xué)專業(yè)的信息體系。,ADA/EASD/IDF的HbA1c工作組推薦,歡迎指正！,蛋白糖化的化學(xué),蛋白糖化開

34、始于糖的醛基或酮基與游離的蛋白上的氨基間非酶的、不可逆作用，形成易變的Schiff堿。 在數(shù)小時形成平衡，并與周圍的葡萄糖濃度呈比例關(guān)系。 Schiff堿的加成物又緩慢地重新轉(zhuǎn)換為較穩(wěn)定的酮胺“Amadori”產(chǎn)物，約在46周達(dá)到平衡。 “Amadori”產(chǎn)物又經(jīng)數(shù)月的不可逆轉(zhuǎn)換，與游離氨基反應(yīng)，形成熒光的交聯(lián)高級的糖化終端（Advanced Glycation End,AGE）產(chǎn)物。,這些蛋白糖化的“Amadori”產(chǎn)物結(jié)構(gòu)高度非均相。 它們隨著年齡累積，反映了血糖的升高，特別在血糖控制差的患者中表現(xiàn)明顯升高。 基底膜蛋白上的AGE產(chǎn)物，相信會破壞正常的血管功能，也是晚期糖尿病并發(fā)癥的主要影

35、響因子。,蛋白糖化的化學(xué),帶有Amadori產(chǎn)物蛋白的比例與蛋白的半衰期、在過去時間內(nèi)的血糖濃度有關(guān)。 在細(xì)胞外蛋白分子上，糖化產(chǎn)物幾乎全部來自葡萄糖，而細(xì)胞內(nèi)的蛋白可以與許多不同的天然的、磷酸化的糖反應(yīng)。 但是，在細(xì)胞內(nèi)，如紅細(xì)胞可以自由地與葡萄糖接觸的，糖化產(chǎn)物的主要來源是葡萄糖。,蛋白糖化的化學(xué),糖化血紅蛋白,與血紅蛋白發(fā)生糖化作用的產(chǎn)物為糖化血紅蛋白。 糖化發(fā)生于各種類型的Hb（如：HbA、HbA2、與HbF）的多個氨基酸殘基端。 HbA層析分析說明，稱為HbA1或快速血紅蛋白的糖化血紅蛋白系列，有亞屬：HbA1a、HbA1b、和HbA1c。,糖化血紅蛋白 HbA1c,其中HbA1c是

36、HbA的每個b-鏈的N-端與葡萄糖的Amadori產(chǎn)物，約占HbA1的80，占總糖化血紅蛋白（GHB）的一半。 因為這個組分與血液平均葡萄糖濃度具有最佳相關(guān)。由于紅細(xì)胞有很長的半衰期，HbA1c的比例是以往68周時間內(nèi)血液葡萄糖濃度的指數(shù)，從采用層析技術(shù)分離糖化血紅蛋白的上世紀(jì)80年代起，報告的GHB結(jié)果都以HbA1c為代表。 依據(jù)采用的檢測方法，HbA1c參考區(qū)間為總血紅蛋白的46。,以下資料來自Roche,HbA1c的定義,HbA1c的定義是：“在的b-鏈的N-端被糖化的血紅蛋白?！?IFCC的參考方法,為兩個不同的參考方法。 HPLC-毛細(xì)管電泳（HPLC-CE） HPLC-電霧化離子化質(zhì)