科技探索之路　基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程

1、1.2基因工程的基本 操 作 程 序,1.2 基因工程的基本操作程序,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測(cè)與鑒定,1.2 基因工程的基本操作程序（第1課時(shí)）,一、目的基因的獲取,1、目的基因：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。 2、獲取方法： （1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因； （2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因； （3）通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法 直接人工合成,未知序列,補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序

2、列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。,轉(zhuǎn)錄開(kāi)始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。,轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來(lái)，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來(lái)。,不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能 編碼蛋白質(zhì)。,能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能 編碼蛋白質(zhì),編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核 苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區(qū)上 游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動(dòng)子,終止子,補(bǔ)：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn),內(nèi)含子,外顯子,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋

3、白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,內(nèi)含子：,外顯子：,結(jié)構(gòu)基因,外顯子,內(nèi)含子,轉(zhuǎn)錄、加工修飾,mRNA,真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的RNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,思考,編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,基因表達(dá)的計(jì)算,在真核生物中，對(duì)應(yīng)的是 的堿基數(shù),631,氨基酸數(shù),堿基數(shù),？,補(bǔ)充資料,基因中外顯子,(一)從基因文庫(kù)中

4、獲取目的基因,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù),1.基因文庫(kù)概念,2.基因文庫(kù)類(lèi)型,（包含一種生物的所有基因）,（包含一種生物的一部分基因）,（cDNA文庫(kù)）,（未知序列）,基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系,提取某種生物的全部DNA,用適當(dāng)?shù)?限制酶,一定大小的DNA片段,將DNA片段 與載體連接,導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,基因組文庫(kù),3.基因文庫(kù)的構(gòu)建,（1）基因組文庫(kù)的構(gòu)建直接分離法(鳥(niǎo)槍法),提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA,單鏈DNA,雙鏈cDNA片段,重組載體,與載體 連接,cDNA文庫(kù),反（逆）轉(zhuǎn)

5、錄酶,DNA 聚合酶,導(dǎo)入受體菌 中儲(chǔ)存,（2）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建（反轉(zhuǎn)錄法）,以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，再反轉(zhuǎn)錄酶的催化下反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，即cDNA，從而獲得所需的基因。,思考,為什么用生物發(fā)育某個(gè)時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄得的DNA只有這種生物的部分基因？,某個(gè)時(shí)期的發(fā)育是基因選擇性表達(dá)的結(jié)果,基因組DNA文庫(kù),cDNA文庫(kù),基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較,基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的比較,小,大,無(wú),有,無(wú),有,某種生物的部分基因,某種生物的全部基因,可以,部分基因可以,怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因呢?,根據(jù)基因的核苷

6、酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA、基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來(lái)獲取目的基因。,例1、構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)時(shí)，首先應(yīng)分離細(xì)胞 （ ） A、染色體DNA B、線粒體DNA C、總mRNA D、tRNA,例2、目的基因可從基因文庫(kù)中獲得，下列有關(guān)基因 文庫(kù)的描述正確的是（ ） A、某生物的全套基因就是一個(gè)基因文庫(kù) B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導(dǎo)入某個(gè)生 物 體內(nèi)，則這個(gè)生物就是一個(gè)基因文庫(kù) C、含有一種生物所有基因的基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù) D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫(kù)叫cDNA文庫(kù),A,C,1、概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)，是一項(xiàng)在生 物_復(fù)制_的核酸合

7、成技術(shù),3、條件：,2、原理：_,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA復(fù)制,(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,模板,（目的基因）,原料(脫氧核苷酸),引物（一小段單鏈DNA）,熱穩(wěn)定DNA聚合酶（耐高溫）,溫度控制,4、操作前提：,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。,（已知序列）,PCR技術(shù),PCR擴(kuò)增儀,以_方式擴(kuò)增， 即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,指數(shù),2n,5、擴(kuò)增形式,在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因,6、擴(kuò)增結(jié)果,7、過(guò)程：,a、變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作 用下，_斷裂，形成_,b、退火（復(fù)性）（55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與DNA模板結(jié)合，形成局部_。

8、,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從 引物開(kāi)始進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，合成與 模板互補(bǔ)的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,過(guò)程,變性、退火、延伸三步曲,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因動(dòng)畫(huà)演示,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過(guò)程 PCR的特點(diǎn),引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過(guò)程 PCR的特點(diǎn),引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過(guò)程 PCR的特點(diǎn),第1輪結(jié)束,第2輪開(kāi)始,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過(guò)程 PCR的特點(diǎn),Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR

9、過(guò)程 PCR的特點(diǎn),第2輪結(jié)束,PCR的基本反應(yīng)步驟,變性 90-95C,延伸 70-75C,退火 55-60C,PCR總結(jié)：,思考？,1個(gè)DNA分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增,循環(huán)4次， 理論上至少需要幾個(gè)引物？,2（2n-1）(n為循環(huán)次數(shù)),（24-1）2=30,PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較,堿基互補(bǔ)配對(duì),四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復(fù)制,細(xì)胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整個(gè)DNA分子,例1、 PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA,需要的條件是（ ） 目的基因 引物 四種脫氧核苷酸 DNA聚合酶等 mRNA 核糖體 A、 B

10、、 C、 D、,A,C,例2、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過(guò)程一般經(jīng)歷下述三十多次循環(huán)：95下使模板DNA變性、解鏈55下復(fù)性（引物與DNA模板鏈結(jié)合）72下引物鏈延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。下列有關(guān)PCR過(guò)程的敘述中不正確的是（ ） A變性過(guò)程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵， 也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn) B復(fù)性過(guò)程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ) 配對(duì)原則完成 C延伸過(guò)程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸 DPCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要酶的最適溫度較高,（三）人工合成法,DNA合成儀,推測(cè),推測(cè),合成,1、前提：基因比較小、核苷酸

11、序列已知,蛋白質(zhì)的氨基酸順序,mRNA核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,（序列已知）,2、方法：通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因,3、過(guò)程：,1、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_,總結(jié)：獲取目的基因的三種方法應(yīng)用,1、如果知道目的基因兩端的核苷酸序列，而且基因比較大，可采用_,2、如果知道目的基因的序列，而且基因比較小，可采用_,PCR技術(shù)擴(kuò)增,化學(xué)方法人工合成,從基因文庫(kù)獲取的方法,提取目的基因的方法與比較,合作指導(dǎo),1.2 基因工程的基本操作程序（第2課時(shí)）,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心,目的： 組成：,1、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可 以遺

12、傳給下一代； 2、使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因+復(fù)制原點(diǎn),調(diào)節(jié)基 因,操縱基 因,結(jié)構(gòu)基因,RNA聚合酶,半乳糖苷酶,酶,酶,啟動(dòng)子,RNA聚合酶,啟動(dòng)子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。,思考1：表達(dá)載體為什么一定要有啟動(dòng)子？,（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能有利于基因的表達(dá)； （2）通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞無(wú)法轉(zhuǎn)錄。,是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基

13、因的細(xì)胞篩選出來(lái)。,思考3：標(biāo)記基因有什么作用？,思考2：終止子的作用是什么？,終止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。,載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。,注意,用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵。,啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少。,目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。,基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程,質(zhì)粒,DNA分子,限制酶處理,兩個(gè)切口 四個(gè)黏性末端,DNA連接酶,基因表達(dá)

14、載體 （重組DNA分子或重組質(zhì)粒）,同一種,一個(gè)切口 兩個(gè)黏性末端,例：如圖為基因表達(dá)載體的模式圖，下列有關(guān)基因工程中載體的說(shuō)法錯(cuò)誤的是(),A基因工程的核心步驟是基因表達(dá) 載體構(gòu)建 B任何基因表達(dá)載體的構(gòu)建都是一 樣的，沒(méi)有差別 C圖中啟動(dòng)子位于基因的首端，是 RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位 D抗生素抗性基因的作用是作為標(biāo) 記基因，用于鑒別受體細(xì)胞中是 否導(dǎo)入了目的基因,B,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,（一）轉(zhuǎn)化：,（二）方法,將目的基因?qū)?植物細(xì)胞,將目的基因?qū)?動(dòng)物細(xì)胞,將目的基因?qū)?微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞,目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在

15、受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過(guò)程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,特點(diǎn)： 易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力,原理： Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞：,轉(zhuǎn)化過(guò)程:,Ti質(zhì)粒 目的基因,構(gòu)建,表達(dá)載體,植物細(xì)胞,植物細(xì)胞染色DNA,新性狀,農(nóng)桿菌,基因槍法又稱(chēng)微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。,（2）基因槍法,適用于單子葉植物,（3）花粉通道法,植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊。花粉管通道法就

16、是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。,適用于被子植物,（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提 純，用顯微儀注射到受精卵中）,思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？,2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,（2）操作程序:,提純含目的基因表達(dá)載體,取受精卵,顯微注射,移植到子宮,受精卵發(fā)育,新性狀動(dòng)物,常用法：Ca2+處理,常用菌：大腸桿菌,微生物作受體細(xì)胞原因： 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少,過(guò)程：,Ca2+處理大腸桿菌,感受態(tài)細(xì)胞,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,思

17、考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？,用Ca2處理，增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性,體細(xì)胞 受精卵,受精卵,細(xì)胞/個(gè)體,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注 射技術(shù),用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞,小結(jié),1. 采用基因工程的方法培育抗蟲(chóng)棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是（ ） 將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng) A B C D,C,2. 下列屬于基因工程中導(dǎo)入目的基因方法的是（ ） 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管道法 顯微注射法 胚胎移植 DNA分子雜交法 A B C D,C,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢測(cè),導(dǎo)入檢測(cè)：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞,方法,DNA分子雜交,表達(dá)檢測(cè),轉(zhuǎn)錄檢測(cè)分子雜交,翻譯檢測(cè)抗原-抗體雜交,分子