DNA分子遺傳標記在中藥中的應用.ppt

1、DNA分子遺傳標記在中藥中的應用,DNA分子遺傳標記,廣義的分子標記（molecular marker）是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。常用的是狹義的分子標記概念，即DNA分子標記。DNA分子標記主要分為以下三類 一、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）：是發(fā)展最早的分子標記技術(shù)，以分子雜交為核心技術(shù)。 二、DNA序列測定,三、基于PCR的分子標記：根據(jù)引物的選擇可分為隨機引物擴增和特定序列位點擴增。 隨機擴增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）。隨機引物擴增PCR（Arbitrary Primer-PCR,AP-PCR）,2、DNA

2、擴增產(chǎn)物指紋分析（DNA amplification fingerprinting,DAF）:與RAPD技術(shù)不同的是引物濃度更高，長度更短（58個bp），只有2個溫度循環(huán)（在RAPD中是3個溫度循環(huán)），一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳。 3、特征擴增區(qū)段測序（Sequence-characterized amplified regions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目標RAPD片段進行測序，根據(jù)RAPD片段兩末端的序列設計特定引物（一般比RAPD引物長，24bp），再進行PCR擴增，可把與原RAPD片段相對應的單一位點鑒定出來，可重復性高。,RFLP技術(shù)及其應用,RFLP(Restrict

3、ion Fragment Length Polymorphism，限制性內(nèi)切酶切片段長度多態(tài)性)是70年代發(fā)展起來的DNA片段分析技術(shù)。該技術(shù)不僅在生物學、醫(yī)學、農(nóng)學的許多領(lǐng)域都有了成功的應用，而且在中藥材品種基源及其地理品系、栽培品系的質(zhì)量評價方面也有許多應用。,基本原理,生物在進化過程中，由于種種原因引起基因突變和DNA分子結(jié)構(gòu)重排，造成了分子內(nèi)核苷酸排列順序的改變，當這種改變涉及到限制性酶切位點時，酶切后產(chǎn)生的DNA片段長度將發(fā)生變化，限制性片段的長度在不同個體間呈多態(tài)性現(xiàn)象，即稱為限制性片段長度多態(tài)(Restriction Fragment Length Polymorphism,簡稱

4、RFLP),Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP),Enzymes cut DNA at specific sequences Restriction sites are often palindromes: 6-cutter GAATTC4-cutter TCGA CTTAAGAGCT,DNA多態(tài)性根據(jù)其產(chǎn)生的兩種基本方式,堿基對突變類型(基因點突變),即限制性內(nèi)切酶識別位點上發(fā)生了單個堿基替換(轉(zhuǎn)換或顛換)，使原有切點消失或產(chǎn)生新的切點。 結(jié)構(gòu)重排型，這是由DNA內(nèi)部發(fā)生較大的順序變化所引起的 。,RFLP與鐮狀細胞貧血,基本實驗步驟

5、,靶DNA的準備 核酸探針的標記 雜交顯示,RFLP的優(yōu)點及局限性,優(yōu)點： (1)普遍存在 (2)穩(wěn)定性 (3)共顯性 (4)探針與限制酶的組合數(shù)量無限 局限性： （1）用RFLP僅能檢測出影響到限制性內(nèi)切酶識別位點的突變 （2）步驟多，工作量大，而且接觸的放射性污染也多 （3）RFLP分析技術(shù)要求DNA無顯著降解，因此只適用于新鮮的材料，難適用于干燥藥材的鑒別 （4）限制性內(nèi)切酶價格較貴,RFLP用于親緣關(guān)系分析,“Ladder”,RFLP在中藥材鑒別中的應用,（一）近緣種的鑒別 如：海馬的PCR-RFLP分析 （二）藥用植物親緣關(guān)系的研究 如：羽扇豆屬植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及與生 物堿分布的關(guān)系

6、,RAPD技術(shù)及其應用,RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)技術(shù)是1990年由杜邦公司W(wǎng)illiams和Welsh兩個研究小組同時發(fā)展起來的一項DNA多態(tài)檢測技術(shù)。該技術(shù)高效、靈敏、簡便、快速，一經(jīng)出現(xiàn)就被普遍用于物種種屬分類、親緣關(guān)系分析、物種起源鑒定、目的基因篩選、農(nóng)作物育種等研究領(lǐng)域。近年，RAPD技術(shù)又進入了中藥材的鑒別研究領(lǐng)域，并得到廣泛應用，已成為目前用于中藥材鑒定報道最多的分子遺傳標記技術(shù)。,RAPD技術(shù)基本原理,RAPD的核心技術(shù)是PCR反應，但又不同于經(jīng)典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸為引物進行PCR擴增，Wi

7、lliams稱之為RAPD，引物通常為10個堿基；Welsh稱之為AP-PCR(Arbitrary Primer PCR)，引物為2030個堿基。對于任一引物，如在一定范圍內(nèi)模板DNA上有與之互補的反向重復序列時，就可擴增出此范圍的DNA片段。,RAPD: randomly amplified polymorphic DNA,基本實驗步驟,模板DNA的制備 PCR擴增，通常RAPD擴增條件為：93預變性200s，開始如下循環(huán)：94變性lmin，36退火1min，72延伸2min；經(jīng)過40個循環(huán)后，72延伸5min，循環(huán)結(jié)束后反應產(chǎn)物置于4保存。 擴增產(chǎn)物20l反應產(chǎn)物走凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色

8、檢測擴增的情況 RAPD圖譜的數(shù)據(jù)處理,RAPD分析的優(yōu)越性和不足,優(yōu)越性： (1)無需預知被研究的生物基因組核苷酸順序，也無需專門設計RAPD擴增反應的引物，引物隨機合成或是任意選定的,長度一般為9-10個寡核苷酸； (2)擴增沒有特異性； (3)退火溫度較低，一般為36，這能保證短核苷酸引物與模板的穩(wěn)定配對，同時也允許了適當?shù)腻e誤配對，以擴大引物在基因組DNA中配對的隨機性。 (4)簡便易行，省力省時。 （5）檢測靈敏方便； （6）所需樣品DNA量極少，僅為10ng,為RFLP的1/l000l/2000。 （7）能自動化。,不足： （1）重復性不高。RAPD在擴增反應時使用的是低溫復性(通

9、常為36),特異性不高,引物與模板間有較高的錯配率,結(jié)果容易受到多種因素的影響,不同的實驗室這間有時不能重復； （2）對模板DNA質(zhì)量要求高，操作要求嚴格，檢驗成本相對較高； （3）由于存在共遷移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一條帶中可能含有不同的擴增產(chǎn)物； （4）RAPD標記難以區(qū)分開雜合子和純合子基因型，不能有效的鑒定出雜合子。,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516,不同Mg2+和dNTP濃度對RAPD帶型的影響,1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112M,不同Taq和Primer濃度對RAPD帶型的影響,M 1 2 3 4 5 6 7 8

10、9 10 11 12 13,M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25,不同循環(huán)量和模板DNA濃度對RAPD帶型的影響,M 1 2 3 4 5 6 CK 7 8 9 10 11 12,不同復性溫度對RAPD帶型的影響,圖4 不同復性溫度對RAPD帶型的影響 Fig 4 Effect on RAPD profiles in different annealing temperature,M 1 2 3 4 5 6 CK 7 8 9 10 11 12,不同復性溫度對RAPD帶型的影響,RAPD分析在中藥研究中的應用,道地藥材的評價 例：當歸藥材道地性的RAPD

11、分析 野生與栽培種及不同農(nóng)家品種 親緣關(guān)系分析 例：人參及山參RAPD指紋 動物藥的鑒定 例：蛇類藥材分子遺傳標記鑒別的研究,AFLP技術(shù)及其應用,擴增酶切片段多態(tài)性 (Amplified Restriction FragmentPolymorphism)是一種基于PCR的DNA指紋技術(shù) ，AFLP是近幾年來繼RFLP、RAPD之后發(fā)展最快的DNA分子標記技術(shù)。被譽為新一代的分子標記技術(shù)，近年來已得到廣泛的應用。,AFLP基本原理,AFLP的基本原理是對基因組DNA限制性酶切片段進行選擇性擴增。 先將基因組DNA用限制性酶消化，產(chǎn)生粘性末端。然后使用人工合成的雙鏈接頭（artificial a

12、dapter）,與基因組DNA的酶切片段相連接形成擴增反應的模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片段的幾個堿基序列作為引物的結(jié)合位點。AFLP反應的結(jié)果是主要擴增那些由上述兩種酶共同酶切的片段。,基本實驗步驟,模板的制備：即DNA酶切及人工接頭的連接（Restriction of the DNA and ligation of oligonucleotide adapters） 限制性片段的選擇性擴增（Selective amplification of sets of restriction fragments） 擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析（Gel analysis of the amplified fr

13、agments）,AFLP的實驗過程,AFLP反應流程： AFLP反應程序主要包括模板DNA制備，酶切片段擴增及凝膠電泳分析這3個基本步驟。各步驟具體的過程有： 首先要制備高分子量(HMW)基因組DNA，選擇6個堿基識別位點的限制性內(nèi)切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。 酶切后的限制性片段在T4連接酶的作用下與特定的接頭相連接，形成帶有接頭的特異性片段。 DNA片段的預擴增。 在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴增。 PCR產(chǎn)物變性后在含尿素的聚丙烯酰胺變性膠上電泳。 多態(tài)性比較分析，特異片段回收克隆分析。,為什么用雙酶解?,適合PCR擴增的效率與變性膠的分辨率 減少PCR

14、擴增的片段,從而減少使用選擇性堿基的數(shù)目 使標記單鏈成為可能 增加PCR擴增的靈活性 增加使用引物的靈活性,為什么要預擴增?,減少選擇性堿基的錯配 降低背景噪音,AFLPs,熒光標記全自動AFLP,For ABI 377 DNA Sequencer and AFLP Kits,AFLP技術(shù)特點,擴增效率高，多態(tài)性比例高 AFLP標記穩(wěn)定可靠，不受基因組來源和復雜度的影響，沒有種屬特異性 AFLP技術(shù)較簡便易行，不需要Southern雜交，不需要預先知道DNA的順序信息，對模板濃度的變化不敏感，允許一定程度的共擴增，且只需要極少量的DNA材料 AFLP是一項專利技術(shù)，受專利權(quán)保護，其分析試劑盒價

15、格偏高,AFLP的重復性問題,Jones et al.（1997）同一實驗在歐洲的8個實驗室重復，172條帶只有1條在一次實驗中沒有，重復率99.4%，與SSR的水平相當。（Jones, C. J. et al. 1997. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories. Mol. Breed. 3:381-390),AFLP在分子中藥中的應用,AFLP技術(shù)可產(chǎn)生豐富而穩(wěn)定的遺傳標記，它可以用于藥用植物遺傳分析的各個方面，如分類、系統(tǒng)發(fā)育

16、、品種鑒別、遺傳圖譜構(gòu)建及目的基因的定位等 例：AFLP法構(gòu)建人參、西洋參基因組 DNA指紋圖譜,微衛(wèi)星標記分析（SSR）,微衛(wèi)星中重復單位的數(shù)目存在高度變異，這些變異表現(xiàn)為微衛(wèi)星數(shù)目的整倍性變異或重復單位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多個位點的多態(tài)性。如果能夠?qū)⑦@些變異揭示出來，就能發(fā)現(xiàn)不同的SSR在不同的種甚至不同個體間的多態(tài)性。 SSR標記又稱為sequence tagged microsatellite site,簡寫為STMS，是目前最常用的微衛(wèi)星標記之一。由于基因組中某一特定的微衛(wèi)星的側(cè)翼序列通常都是保守性較強的單一序列，因而可以將微衛(wèi)星側(cè)翼的DNA片段克隆、測序，然后根據(jù)

17、微衛(wèi)星的側(cè)翼序列就可以人工合成引物進行PCR擴增，從而將單個微衛(wèi)星位點擴增出來。由于單個微衛(wèi)星位點重復單元在數(shù)量上的變異，個體的擴增產(chǎn)物在長度上的變化就產(chǎn)生長度的多態(tài)性，這一多態(tài)性稱為簡單序列重復長度多態(tài)性(SSLP)，每一擴增位點就代表了這一位點的一對等位基因。由于SSR重復數(shù)目變化很大，所以SSR標記能揭示比RFLP高得多的多態(tài)性。,SSR位點標記的優(yōu)點,約50%呈多態(tài)性 共顯性 數(shù)目多且在基因組中均勻分布 多數(shù)位點呈選擇中性，符合群體遺傳學了理論 技術(shù)上適合用PCR分析半自動化，結(jié)果可靠 部分降解的DNA樣品也可用 適合于等位酶變異小的居群水平的研究,SSR位點標記的缺點,可用的位點數(shù)目

18、少 設計引物的費用高，耗時長 物種專一性 在說明群體分化和物種分化時可能產(chǎn)生錯誤,SSR標記的應用領(lǐng)域,遺傳圖譜的構(gòu)建 連鎖分析特殊的基因（如感病基因） 姻親分析樣品鑒定（如父本分析、血緣分析、等號樣品分析、雜種分析） 物種和居群的遺傳多樣性 群體遺傳學分析（如有效群體大小、群體遺傳結(jié)構(gòu)、群體分化、遷移與基因流動） 傳粉生物學與散布生物學（如花粉和種子的散布、交配系統(tǒng)） 保護生物學,Comparison among genetic markers,由微衛(wèi)星衍生的微衛(wèi)星標記,微衛(wèi)星引物PCR(MP-PCR) 也叫單引物擴增RCP(single amplification PCR,簡寫為SPAR)

19、 該方法是利用單個微衛(wèi)星的人工合成寡核苷酸片段為引物進行PCR擴增?？梢韵胂?，如果兩個反向排列的微衛(wèi)星出現(xiàn)于同一可擴增的范圍內(nèi)，這兩個反向排列的微衛(wèi)星間的序列就可擴增出來，因而該方法稱為微衛(wèi)星引物PCR。 用此方法擴增出來的是兩個反向排列的微衛(wèi)星之間的序列，并非微衛(wèi)星位點本身。實踐證明，用該方法對三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重復的微衛(wèi)星位點的擴增效果較好，而對二核苷酸位點重復的擴增效果較差。,ISSR(Intersimple sequence repeat) 這是Zietkiewitcz等(1994)發(fā)展起來的又一種微衛(wèi)星基礎上的分子標記。 與SSR標記相反，該法是直接利用同位素標記的SSR序

20、列為引物，用PCR的方法擴增兩個SSR之間的單拷貝序列。 為增加特異性，設計引物時在引物的5端和3端分別引入12個選擇性堿基，引物長度1618bp，擴增產(chǎn)物通過放射自顯影顯現(xiàn)，這樣其擴增物就是MP-PCR擴增產(chǎn)物中的一部分，提高了實驗結(jié)果的可重復性。 ISSR引物的開發(fā)不象SSR引物一樣需測序獲得SSR兩測的單拷貝序列，開發(fā)費用降低。與SSR標記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，不象SSR標記一樣具有較強的種特異性；與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美，檢測非常方便，因而是一種非常有發(fā)展前途的分子標記，已用于遺傳作圖、品種鑒定等研究。,DNA測序技術(shù)及其應用,DNA測序原理 及方法 優(yōu)點及不足 優(yōu)點：DNA測序技術(shù)重現(xiàn)