獸醫(yī)臨床進(jìn)展

1、獸醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展王 米1，2 胡元亮2 （1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 上海 200241 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)研究室 江蘇南京 210095）摘要：獸醫(yī)臨床工作的基本任務(wù)，在于防治動(dòng)物疾病，保障畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。正確的診斷是制訂合理、有效防治措施的根據(jù)。隨著近代理論科學(xué)與技術(shù)科學(xué)的新成就在診斷學(xué)上的運(yùn)用，顯著促進(jìn)了獸醫(yī)臨床學(xué)科的發(fā)展，提高了診斷水平和工作效率。本文綜述了分子生物學(xué)技術(shù)及B型超聲診斷技術(shù)在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)技術(shù)；B型超聲診斷技術(shù)；獸醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)The Development of Veterinarian Clinical Medici

2、neWang mi1,2 Meng xinyu1 Yang ruile1 Hu yuanliang2 Xue feiqun11.Shanghai Veterinary Research Institute of Chinese academy of agricultural sciences,Shanghai 200241;2.Institute of Traditional Chinese Veterinary Medicine, Nanjing Agriculture University ,Nanjing 210095Abstract: Prevention and cure anima

3、l diseases ,ensuring husbandry farming healthy development is basic task of Veterinarian clinic. Correct diagnosis is very important for taking reasonable and effective measures. With the development of modern theory and technology science, much new technology was applied in veterinarian clinical di

4、agnosis, which remarkably promoted the development. This paper was summaried the development of Veterinarian clinical medicine.Key words: Biological technology B-mold ultrasoundscanner Veterinarian clinical medicine獸醫(yī)臨床工作的基本任務(wù)，在于防治動(dòng)物疾病，保障畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。防治動(dòng)物疾病，必須首先認(rèn)識(shí)疾病。正確的診斷是制訂合理、有效防治措施的根據(jù)。所以，診斷是防治疾病的前

5、提，是臨床工作的基礎(chǔ)。近代理論科學(xué)與技術(shù)科學(xué)的新成就在診斷學(xué)上的運(yùn)用，如分子生物學(xué)技術(shù)與大量精密的診斷儀器，如心電圖機(jī)、內(nèi)窺鏡、電子顯微鏡、B超、X光、CT、核磁共振和放射性同位素等，促進(jìn)了本學(xué)科的發(fā)展，提高了診斷水平和工作效率。今天，生物技術(shù)不斷向深度和廣度迅猛發(fā)展。它的發(fā)展與動(dòng)物疫病的診斷、預(yù)防和治療技術(shù)之間已并無(wú)明顯的界限，并且起了不可替代的作用1。生物大分子結(jié)構(gòu)和功能與臨床疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，研究生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，為利用分子生物學(xué)理論和技術(shù)探索某些疾病的機(jī)制提供了有益的參考2。而大量精密儀器在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用也促進(jìn)了本學(xué)科的發(fā)展。1 分子生物學(xué)技術(shù)在臨床獸醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用1

6、.1核酸的分子雜交基因探針技術(shù)基因探針技術(shù)是臨床應(yīng)用最早的分子生物學(xué)技術(shù)，至今仍長(zhǎng)盛不衰。它不僅用于微生物等基因鑒定方面，而且在印跡技術(shù)（如Southern blot）方面以及新近成為熱門的基因芯片技術(shù)方面都有廣泛應(yīng)用，不少探針已商品化3。1.2 PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction， PCR)技術(shù)是特定DNA片段體外擴(kuò)增的新技術(shù)4，5，可以在短時(shí)間內(nèi)大量復(fù)制出原來(lái)很少的DNA。其作為一種新的疾病檢測(cè)手段，具有靈敏、特異、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，可以從一根毛發(fā)、一滴血、一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析診斷。PCR技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于對(duì)突變基因和癌基因的檢測(cè)，包

7、括從基因組DNA、RNA和cDNA直接克隆目的基因，體外誘變和DNA工程，傳染病原分析，基因序列變異分析等方面。在臨床上適用于細(xì)菌，病毒，支原體、螺旋體等病原體感染引起的疫病的診斷。應(yīng)用PCR技術(shù)可檢測(cè)鴨的疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)6，鑒定類志賀氏菌素型變異體(SLT-e)大腸桿菌、沙門氏菌和綠膿桿菌外毒素A(ETA)7-9。多聯(lián)PCR可對(duì)引發(fā)豬繁殖障礙有關(guān)病毒：日本乙型腦炎病毒(JEV)，豬細(xì)小病毒(PPV)，豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒(PRRSV)及偽狂犬病病毒(PRV)進(jìn)行鑒定，達(dá)到診斷的目的10。PCR還可檢測(cè)豬偽狂犬病及禽腺病毒11。最新報(bào)

8、道表明，該技術(shù)還可用于檢測(cè)診斷傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、禽白血病病毒(ALV)等病毒性疾病12-14。1.3 DNA(基因)酶切圖譜分析DNA(基因)酶切圖譜分析是指用特定的限制性酶消化DNA長(zhǎng)鏈后，可以得到核酸的片段。由于不同的DNA堿基序列不同，用識(shí)別某一特定堿基序列的限制酶進(jìn)行酶切時(shí)，所得到的DNA鏈片段的長(zhǎng)短也不一樣。片段的長(zhǎng)短可用凝膠電泳進(jìn)行分離后，與一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行比較，大體計(jì)算出各片段的分子量或堿基數(shù)。該法已廣泛應(yīng)用于臨床基因診斷。臨床和科研中沿用多年的DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)，就是本法的具體應(yīng)用。1.4 單

9、鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism,SSCP）分析是一種簡(jiǎn)單、有效、快捷、廉價(jià)的檢測(cè)非常少量的基因組DNA或cDNA突變的技術(shù)。其原理及技術(shù)要點(diǎn)是:由于單一堿基的替代，引起DNA鏈構(gòu)象改變。后者可導(dǎo)致DNA在非變性凝膠電泳中出現(xiàn)遷移率的改變。因此，首先用PCR技術(shù)擴(kuò)增所檢驗(yàn)的模板，然后進(jìn)行變性、電泳、顯示。根據(jù)顯示的條帶與標(biāo)準(zhǔn)參照物對(duì)比，即可判斷所測(cè)DNA鏈?zhǔn)欠裼凶儺?。由于該方法具有快速、?jiǎn)便、靈敏度高及適用于大群體篩選等優(yōu)點(diǎn),因而該技術(shù)廣泛用于各類群體點(diǎn)突變的檢測(cè),包括人類遺傳病基因突變的探測(cè)、癌基因或抑

10、癌基因的突變探測(cè)等。在動(dòng)物中,該技術(shù)也已應(yīng)用于小鼠、牛、豬等的多種基因的檢測(cè)。隨著該方法的普遍運(yùn)用,也使其本身得到進(jìn)一步的完善和發(fā)展15。1.5 DNA微陣列(DNA microarray)技術(shù)基因芯片(gene-chip ) , 又稱DNA 微陣列(DNA microarray) , 是指固著在載體上的高密度DNA 微點(diǎn)陣?；蛐酒墓ぷ髟砼c經(jīng)典的核酸分子雜交方法是一致的, 都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶核苷酸序列雜交, 通過(guò)隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析, 其最大的優(yōu)點(diǎn)在于能在一微小的基片(硅片、玻片、塑料片等) 表面集成大量的分子識(shí)別探針, 在同一時(shí)間內(nèi)平行分析大量基因, 進(jìn)

11、行大信息量的篩選與檢測(cè)分析16。目前國(guó)內(nèi)外已制出多種生物芯片商品，其實(shí)際應(yīng)用亦已逐步展開。該技術(shù)應(yīng)用范圍極廣如致病微生物的檢出、癌基因及抑癌基因、組織配型、基因表達(dá)的研究、基因功能分析、基因制圖、基因突變和多態(tài)性的檢測(cè)等，是一項(xiàng)非常有發(fā)展前景，適合臨床檢驗(yàn)應(yīng)用的先進(jìn)技術(shù)。1.6 熒光原位雜交染色體分析(FISH)熒光原位雜交染色體分析是一種在染色體上進(jìn)行基因定位的技術(shù)，其基本原理和步驟是:在已知某靶基因核苷酸序列的前提下，先合成與靶基因互補(bǔ)的經(jīng)熒光標(biāo)記的DNA探針，與常規(guī)方法制備的中期染色體進(jìn)行原位雜交。在熒光顯微鏡下可以觀察到該靶基因所在的染色體(臂、區(qū)、帶、亞帶)。該技術(shù)不僅可用于基因在染

12、色體上定位的研究，而且可直接用于實(shí)驗(yàn)室診斷。在基因定性、定量、整合、表達(dá)等方面的研究中頗具優(yōu)勢(shì)。1.7 單抗阻斷ELISA檢測(cè)副雞嗜血桿菌血清型特異性抗體苗得園等17在副雞嗜血桿菌A、C型特異性單克隆抗體的基礎(chǔ)上成功建立了能區(qū)分A、C血清型抗體的阻斷ELISA診斷方法。同時(shí)應(yīng)用本方法對(duì)9種常見病原體陽(yáng)性血清及多份免疫雞、人工感染雞、臨床可疑病雞血清和陰性血清進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明該方法具有較好的特異性和敏感性，并且操作簡(jiǎn)便、快速，是一種適用于雞傳染性鼻炎的診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢疫和監(jiān)測(cè)的良好方法。2B型超聲診斷技術(shù)在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用隨著集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，以及診療水平和預(yù)防措施的提高，畜禽

13、傳染病的發(fā)生相對(duì)減少，但一些代謝病、腫瘤、器官功能障礙等疑難雜癥有增加的趨勢(shì)，發(fā)病原因也越來(lái)越復(fù)雜，因此，傳統(tǒng)的診斷手段已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足獸醫(yī)臨床診斷的需要。B型超聲診斷儀作為一種現(xiàn)代化的輔助診斷技術(shù)，在獸醫(yī)臨床診斷中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用18，19。2.1在獸醫(yī)內(nèi)科方面的應(yīng)用一些常見的消化道疾病，如胃腸道異物、腸梗阻、腸套疊、腸纏結(jié)等，B超探查均能及時(shí)、有效地對(duì)其作出診斷；胃腸道異物或腸梗阻、腸套疊或腸纏結(jié)、肝膽疾病。對(duì)腎臟病變的診斷一般來(lái)說(shuō)，B超診斷腎臟疾病比X光攝影技術(shù)準(zhǔn)確率高，并能特異性地診斷出具體病灶區(qū)，對(duì)腎臟疾病和輸尿管疾病是最有效的診斷方法。對(duì)結(jié)石的診斷，可診斷腎結(jié)石、膀胱結(jié)石、尿道

14、結(jié)石。2.2 在獸醫(yī)外科方面的應(yīng)用20，21在手術(shù)過(guò)程中的應(yīng)用，B超對(duì)手術(shù)定位有較大幫助。超聲引導(dǎo)穿刺技術(shù)具有直觀、快速、準(zhǔn)確、損傷小的優(yōu)點(diǎn)，已在醫(yī)學(xué)界得到廣泛應(yīng)用，在疾病的診治上發(fā)揮著重要作用。B超已應(yīng)用于牛體人工培植牛黃的監(jiān)測(cè)及活熊取膽手術(shù)的指導(dǎo)。在活熊取膽的整個(gè)過(guò)程中，特別是當(dāng)膽囊由于感染或異物刺激而引起變化時(shí)，B超探查便顯得特別重要。創(chuàng)傷疾病腰椎間盤脫出及切除術(shù)后椎管內(nèi)觀察，超聲診斷犬椎間盤脫出、脊椎脫位和脊髓受到壓迫等效果良好。B超診斷犬的髖關(guān)節(jié)是否發(fā)育異常，其準(zhǔn)確率達(dá)87%以上。B超可以檢查腰椎間盤突出癥術(shù)后椎管內(nèi)的改變，探頭可通過(guò)切除椎板后的間隙，清楚的顯示硬脊膜的波動(dòng)，椎管徑線

15、及相應(yīng)腰椎管前壁和神經(jīng)根周圍的解剖及病理變化；可顯示由于手術(shù)的干擾和損傷，所致的硬膜外脂肪纖維化、硬膜外間隙消失及切除椎間盤后病灶處的團(tuán)塊樣回聲。對(duì)于腹部外傷，B超能較準(zhǔn)確地判斷內(nèi)臟有無(wú)損傷及所損傷的臟器部位、程度及內(nèi)出血量，為獸醫(yī)臨床診斷提供依據(jù)，以便選擇治療方案。B超檢查結(jié)果陽(yáng)性病畜中肝、脾、腎實(shí)質(zhì)性臟器挫傷、破裂，表現(xiàn)為所損傷的臟器有不同程度的腫大與形態(tài)改變，實(shí)質(zhì)密度不均，回聲紊亂，腹腔可見形態(tài)不規(guī)則液性暗區(qū)。而空腔臟器損傷或穿孔及腹腔內(nèi)小血管破裂，B超只能見到腹腔液性暗區(qū)，一般不易直接看到損傷圖像，容易漏診。目前，B超已用于引導(dǎo)腹腔穿刺、肝臟穿刺檢查，有助于及時(shí)、正確的診斷疾病。2.3

16、 在產(chǎn)科學(xué)方面的應(yīng)用22，23B超可監(jiān)測(cè)卵巢發(fā)育，以便適時(shí)配。B超可監(jiān)測(cè)卵巢發(fā)育情況，確定排卵期，為交配或人工授精提供最佳時(shí)期。監(jiān)測(cè)卵巢發(fā)育時(shí)可從多個(gè)切面計(jì)算發(fā)育成熟的卵泡數(shù)，當(dāng)成熟卵泡太少(5個(gè)以下)或同步增長(zhǎng)的卵泡數(shù)量少、速度慢時(shí)，可適量使用促性腺激素，促進(jìn)卵巢發(fā)育和排卵，提高受胎率，增加產(chǎn)仔數(shù)。B超可進(jìn)行早期妊娠診斷，能直觀地在屏幕上顯示胚囊、胚胎等懷孕特征，準(zhǔn)確率高。動(dòng)物早孕的B超判斷主要根據(jù)在子宮區(qū)超聲切面聲像圖上觀察到圓形液性暗區(qū)的孕囊及子宮角斷面增大、子宮壁增厚等為指標(biāo)。探查方法多為腹底壁或兩側(cè)腹壁剪毛后用5或7.5 MHz的線陣或扇掃探頭作橫向、縱向和斜向3個(gè)方位的平掃切面觀察

17、，當(dāng)見到有1個(gè)或多個(gè)孕囊暗區(qū)時(shí)即可判為已孕。犬配種后20-24 d，B超妊娠診斷的陽(yáng)性率為80%；25-30 d可達(dá)90%以上。同時(shí)，可用B超對(duì)胚胎發(fā)育、懷孕胎數(shù)、妊娠日齡、死胎進(jìn)行監(jiān)測(cè)；對(duì)移植胚胎的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；診斷產(chǎn)科疾病，如卵巢囊腫、子宮積液、難產(chǎn)、乳腺疾病及前列腺疾病等。3小結(jié)一般來(lái)說(shuō)，常規(guī)診斷技經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的歷史發(fā)展過(guò)程，得以鞏固和完善，具有應(yīng)用簡(jiǎn)便、快速、易于掌握、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，具有比較強(qiáng)的生命力。而生物高科技診斷技術(shù)卻不具備這樣的優(yōu)勢(shì)，不論是單克隆抗體還是核酸探針PCR等，其試劑的制備方法都比較復(fù)雜，需要昂貴的儀器設(shè)備和診斷試劑，對(duì)操作者的技術(shù)要求也較高，甚至對(duì)檢測(cè)結(jié)果的綜合評(píng)價(jià)也不容

18、易掌握。但是，現(xiàn)代生物技術(shù)作為一種高新技術(shù)，有著常規(guī)診斷方法難以比擬的優(yōu)越性，具有極高的敏感性與特異性。雖然在短時(shí)間內(nèi)這些診斷新技術(shù)難以真正普遍推廣應(yīng)用，但對(duì)于重大疫情的及時(shí)預(yù)報(bào)和準(zhǔn)確定性都是不可或缺的。在獸醫(yī)臨床中，不論是動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還是動(dòng)物繁殖學(xué)領(lǐng)域，B超都發(fā)揮著非常重要的作用。利用B超可以清晰地顯示各臟器及周圍器官的各種斷層圖像，圖像富于實(shí)體感，接近于解剖的真實(shí)結(jié)構(gòu)，有助于早期確診。目前在我國(guó)獸醫(yī)臨床上，動(dòng)物疾病的B超診斷主要還是局限于犬、貓等小動(dòng)物，而在大動(dòng)物方面應(yīng)用較少。隨著我國(guó)畜牧業(yè)的快速發(fā)展，B超診斷應(yīng)逐漸應(yīng)用于大動(dòng)物疾病的診治，尤其是在產(chǎn)科學(xué)方面發(fā)揮更重要的作用。參考文獻(xiàn)1 宋

19、文學(xué)，謝光洪，王哲分子生物學(xué)技術(shù)在臨床獸醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2007，34（6）：93-952 蔡皓，王雪東分子生物學(xué)技術(shù)與臨床獸醫(yī)學(xué)畜牧獸醫(yī)科技信息，2009，（4）：8-93 Hutvagner G，Zamore P D AmioroRNA in a multiple-turover RNAi enzyme complexJ Science， 2002， 297(5589)：20562060，586458744 Cadwell R C，Wellet F CMutagenic PCRMNew York Cold Spring Harbor Laboratory Press，1994：6

20、8-755涂健，祁克宗，潘鑫PCR在畜禽疫病診斷上的應(yīng)用及研究進(jìn)展動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25(3)：22-246 胡清海，劉曉文，趙世華，等應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌的研究J中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，1(6)：247 徐建生，成大榮，李俊寶利用PCR法鑒定產(chǎn)SLT-e大腸桿菌J中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，21(5)：339-3408 章新生，臧富妍應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌J中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，19(2)：146-1479 李雅林，牛鐘相，姜世金，等綠膿桿菌PA-SD-1株外毒素A區(qū)基因的克隆及序列分析J中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，9(5)：24-2610 孫 明，涂長(zhǎng)春，李紅衛(wèi)，等應(yīng)用多重PCR對(duì)引發(fā)豬繁殖障礙有關(guān)病毒的檢測(cè)J中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，1(1)：20-2411 謝芝勛應(yīng)用PCR檢測(cè)禽腺病毒J中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，7(4)：2