堿性磷酸酶的分離純化鑒定

1、分離純化的一般程序,選擇材料,破碎細(xì)胞,提取,分離純化,分析及鑒定,AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中）， AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮（沉淀中），,原理：,操 作,一、取材及勻漿 取兔肝2g，剪碎， 加入6ml 0.01mol/L醋酸鎂和醋酸鈉混合液，充分勻漿。 記錄體積 （取0.1ml至一新EP管留作A液，測定時稀釋25倍） 二、提取 加入2ml正丁醇，攪拌2min，室溫放置30min。過濾，留上清。計體積。,三、分離純化 1、50丙酮沉淀AKP 加入等體積丙酮，3000rpm5min，留沉淀， 加4ml 0.5mol/L醋酸鎂溶解沉淀，記錄體積。 （取0.1ml留作B液，稀釋

2、10倍） 2、30乙醇溶解AKP 每ml溶液中加入95乙醇0.46ml 2000rpm5min，留上清（記錄體積） 3、60乙醇沉淀AKP 每ml溶液中加入95乙醇0.86ml 3000rpm5min，留沉淀， 加3ml 0.5mol/L醋酸鎂溶解沉淀，記錄體積。 （取0.1ml留作C液，使用時稀釋5倍）,4、33丙酮溶解AKP 每ml溶液中加入0.33ml丙酮 2000rpm5min，留上清（記錄體積） 5、50丙酮沉淀AKP 每ml溶液中加入0.36ml丙酮 3000rpm15min，留沉淀， 5ml Ph8.8的Tris-醋酸鎂溶解沉淀 （D液，不稀釋）,四、分析及鑒定 1、堿性磷酸酶的

3、活性測定（磷酸苯二鈉法） 2、堿性磷酸酶蛋白含量測定（BCA法） 3、比活性及純化倍數(shù)計算,分光光度法（Spectrophotometry）,根據(jù)物質(zhì)對不同波長的光線具有選擇性吸收（即可產(chǎn)生吸收光譜）的特性而建立起來的一種定量、定性分析的技術(shù)。也稱為吸收光譜法（Absorption spectrometry）。 不需要把欲分析的樣品從混合物中分離開來,（一）基本原理,光具有波粒二相性。 波長和頻率是光的波動性的特征。,1、光的基本知識,紫外分光光度計（200400nm） 可見光分光光度計（400760nm） 紅外分光光度計（7601000nm）,2、 定量分析的理論基礎(chǔ) LambertBeer

4、定律,A KLC,吸光度 (Aabsorbance,A ) 消光度 (degree of extinction,E ) 光密度 (optical density,D ),K- 吸光系數(shù),是物質(zhì)的特征性常數(shù)。,對比法進(jìn)行定量分析,A樣 = K L C樣,A標(biāo) = K L C標(biāo),A樣,A標(biāo),K L C樣,K L C標(biāo),C樣,C標(biāo),C樣 = A樣 C標(biāo) / A標(biāo),單色光、平行光（max） 溶液均勻、清澈、無散射 溶液性質(zhì)穩(wěn)定，比色皿中無化學(xué)反應(yīng) 適用于稀溶液（A 0.2-0.7）,LambertBeer定律的適用范圍：,溶劑空白： 當(dāng)顯色劑及所用其它試劑在測定波長都沒有吸收峰時，可用純?nèi)軇?如蒸餾水

5、)作參比溶液。 試劑空白： 當(dāng)顯色前的樣品在測定波長沒有吸收峰，而顯色劑或其它試劑在測定波長處有吸收時，可用不加入樣品的“試劑空白”作參比溶液，這種方式最為常用。,參比溶液的選擇,基本組件及常見分光光度計,分光光度計的使用,1. 打開電源預(yù)熱15分鐘 2. 選擇波長（ max ） 3. 光標(biāo)指向Trans 4. 打開光門，調(diào)節(jié)0；關(guān)上光門調(diào)節(jié)100 5. 重復(fù)4一次 6. 將光標(biāo)指向ABS 7. 讀數(shù),磷酸苯二鈉,堿性磷酸酶,苯酚 + 磷酸鹽,堿性,苯酚 + 4-氨基安替吡啉 + 鐵氰化鉀,紅色醌式化合物,AKP活性測定基本原理磷酸苯二鈉法,37保溫 15分鐘 各管加入鐵氰化鉀液2ml，靜置15min,510nm 比色,酚標(biāo)準(zhǔn)液濃度,稀釋倍數(shù) (PH8.8tris醋酸鎂溶液 ） / / 25 10 5 1,蛋白含量測定基本原理BCA法,二喹啉甲酸，BCA,37保溫 30分