核酸的分離與純化.pptx

1、核酸的分離與純化,華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科 分子診斷室 王軍,背景,核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核酸提取也成為了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的最重要、最基本的操作。 核酸提取亦是臨床分子診斷最關(guān)鍵的操作，直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗與否，是臨床分子診斷容易發(fā)生問題步驟。,核酸的存在形式,DNA：細(xì)胞核DNP 線粒體 環(huán)狀DNA RNA：細(xì)胞質(zhì)中，mRNA，rRNA，tRNA 通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNP,核酸的理化性質(zhì),DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。D

2、NA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 DNP在低濃度鹽溶液中，幾乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。 RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L氯化鈉中溶解度較大。,核酸提取方法,核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子物質(zhì)分開。 核酸提取時(shí)應(yīng)遵循以下原則: 1、保證核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性; 2、排除其他分子污染。,核酸提取方法,大多數(shù)核酸分離與純化的方法一般都包括：

3、 細(xì)胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化 每一步驟又可由多種不同的方法單獨(dú)或聯(lián)合實(shí)現(xiàn)。,核酸提取方法細(xì)胞裂解,細(xì)胞裂解可通過以下幾種方法實(shí)現(xiàn)： 物理作用 化學(xué)作用 酶作用 （生物作用）,核酸提取方法細(xì)胞裂解,物理作用： 包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等方法。這些方法用機(jī)械力使細(xì)胞破碎,但機(jī)械力也可引起核酸鏈的斷裂,因而不適用于高分子量長(zhǎng)鏈核酸的分離。 超聲裂解法提取的核酸片段長(zhǎng)度從 20kb 之間,而顆粒勻漿法提取的核酸一般 10kb。,核酸提取方法細(xì)胞裂解,化學(xué)作用： 變性： 加熱、加入表面活性劑(SDS、Triton X-100 、Tween 20

4、、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或強(qiáng)離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍) 堿性PH環(huán)境：強(qiáng)堿(NaOH) 或堿性緩沖液 ( TE、STE 等) 在一定的p H 環(huán)境下,表面活性劑或強(qiáng)離子劑可使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,核酸釋放到水相；某些緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA 等) 可螯合對(duì)核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護(hù)核酸不被降解。,核酸提取方法細(xì)胞裂解,酶作用（生物作用）： 主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細(xì)胞破裂,核酸釋放。 蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)

5、,促進(jìn)核酸的分離。其中溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65 及有EDTA、尿素(14mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時(shí)仍保留酶活性,這有利于提高對(duì)高分子量核酸的提取效率。,核酸提取方法酶處理,在核酸提取過程中,可通過加入適當(dāng)?shù)拿甘共恍枰奈镔|(zhì)降解,以利于核酸的分離與純化。 如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質(zhì),滅活核酸酶(DNase 和RNase)； 或者加入DNase 或RNase 去除不需要的DNA或RNA。,核

6、酸提取方法分離與純化,酚氯仿法 簡(jiǎn)介：1976，Stafford及其同事創(chuàng)立?，F(xiàn)已經(jīng)不斷改進(jìn)。 關(guān)鍵技術(shù)： 酚的使用 用酚來分離核酸首先是Kirty，1956年首次報(bào)道。當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)酚可以從水相中抽提蛋白質(zhì)，使用陰離子鹽時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)核酸分配在水相，而蛋白質(zhì)在有機(jī)相。,核酸提取方法分離與純化,酚氯仿法,核酸提取方法分離與純化,酚氯仿法 酚的準(zhǔn)備 重蒸酚(去除可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián)的醌類氧化物）； 加入8一羥基喹嚀，以防止酚氧化，（酚氧化發(fā)黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)）； 水飽和酚、平衡PH（大于7.8）（不飽和的酚能與15%其提及的水互溶，從而降

7、低水相中核酸產(chǎn)量） 發(fā)展和改進(jìn)： SDS取代陰離子鹽 酚：氯仿混合液（增加了對(duì)糖、脂的溶解） 異戊醇的使用（減少泡沫、使RNase失活）,核酸提取方法分離與純化,酚氯仿法 裂解緩沖液（異硫氰酸胍）處理 蛋白酶K消化，（根據(jù)需要亦可加入Dnase或RNAase） 50:48:2苯酚:氯仿:異戊醇混合液，與等量的裂解處理液混合，依據(jù)應(yīng)用目的,兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸) 或簡(jiǎn)單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸) 后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相,核酸則被留于上層水相。 轉(zhuǎn)移水相，重復(fù)步驟3，直至滿意為止。 核酸沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 05. 5 ,終濃度為0.

8、 3M 的NaAc 或KAc 后,鈉離子會(huì)中和核酸磷酸骨架上的負(fù)電荷,在酸性環(huán)境中促進(jìn)核酸的疏水復(fù)性。然后加入23倍體積的預(yù)冷的無水乙醇,經(jīng)一定時(shí)間的孵育,可使核酸有效地沉淀。 14000g離心30分鐘室溫，或者如果產(chǎn)量較大可直接用玻璃鉤子取出。 70%乙醇洗滌2-3次，即可將沉淀溶于TE保存。,核酸提取方法分離與純化,酚氯仿法 純度高，RNA回收效率極高，尤其是200bp的RNA，比如：siRNA，miRNA，mRNA和tRNA等 除核酸外，可提取蛋白質(zhì) 耗時(shí)，繁瑣，不利于自動(dòng)化。 正式名稱：異硫氰酸胍-酚-氯仿核酸提取法 By Piotr Chomczynski and Nicoletta

9、 Sacchi 1987,核酸提取方法分離與純化,鹽析法-miller 1、細(xì)胞裂解同前述； 2、加入2體積的6mol/L的NaCl，與3體積的細(xì)胞裂解液混合，震蕩混勻，2500rmp離心1520min，此時(shí)DNP溶解于上清中，蛋白質(zhì)、RNA等位于離心管底部； 3、小心轉(zhuǎn)移上清，同前步驟用乙醇沉淀法進(jìn)一步純化。,核酸提取方法分離與純化,鹽析法-NaAC 1、細(xì)胞裂解同前述；并加入蛋白酶K消化 2、加入1/10體積的3mol/L的NaAC，與1體積的細(xì)胞裂解液混合，震蕩混勻，-20孵育 15 min；臺(tái)式離心機(jī)最大速度離心1520min； 3、小心轉(zhuǎn)移上清，同前步驟用乙醇沉淀法進(jìn)一步純化。,核酸

10、提取方法分離與純化,鹽析法 產(chǎn)量較低，但方法簡(jiǎn)單，比較酚氯仿方法無化學(xué)危害； 同樣不適合大規(guī)模自動(dòng)化提取。 提取好的DNA用蛋白酶處理純度會(huì)提高。,核酸提取方法分離與純化,硅膠吸附法 1、細(xì)胞裂解和酶處理同前述； 2、處理好的裂解液轉(zhuǎn)入硅膠離心柱，高速離心，利用硅膠可以吸附核酸而不能與其它物質(zhì)如蛋白質(zhì)，脂類等結(jié)合的特點(diǎn)，洗脫這類雜質(zhì)； 3、重復(fù)洗滌，提高純度，最后用核酸洗脫液獲得核酸。,裂解液；洗滌液；洗脫液裝入位置,硅膠層,液體流出管道,核酸提取方法分離與純化,硅膠吸附法 產(chǎn)量較低，純度很好； 也能造成大片段核酸的損傷； 對(duì)極小片段核酸提取不夠好； 簡(jiǎn)單方便，可進(jìn)行自動(dòng)化處理。,核酸提取方法

11、分離與純化,磁性硅膠吸附法 1、細(xì)胞裂解和酶處理同前述； 2、處理好的裂解液與磁性硅膠顆?；靹?，孵育約30分鐘，使裂解液中的核酸物質(zhì)與硅膠粘附； 3、利用磁力架固定吸附了核酸的硅膠顆粒；吸盡管中的液體，加入洗滌液重復(fù)本次步驟2次。 4、洗脫液收獲核酸。,核酸提取方法分離與純化,磁性硅膠吸附法 產(chǎn)量較好，純度很好； 成本較低，無特殊耗材； 可通過設(shè)計(jì)特異探針附著于硅膠顆粒，從而可捕獲特異物種的核酸成分； 可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化作業(yè)。,核酸提取方法分離與純化,加熱煮沸法 1、高速離心富集含核酸物質(zhì)； 2、加入促細(xì)胞裂解的化學(xué)物質(zhì)（SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB

12、、sar-cosyl 、Chelex-100 ）等；加入蛋白酶K消化一段時(shí)間，也可不加，直接95以上加熱10分鐘左右； 3、高速離心，上清中的DNA即可用于PCR擴(kuò)增。,核酸提取方法分離與純化,加熱煮沸法 只能用于DNA提取；一般僅用于血清或體液中病原體DNA的提??； 成本最低，臨床應(yīng)用最廣； 純度低，產(chǎn)量低；除了PCR外不能直接用于其它分子生物學(xué)操作； 純手工操作，臨床PCR工作中最易出問題的環(huán)節(jié)。,核酸提取方法分離與純化,RNA提取應(yīng)該注意的問題： 無處不在的RNase，比較耐高溫，不易失活； 解決的辦法： 1、用于分離RNA的耗材，如有可能必須采用高壓滅菌； 2、用于分離RNA的試劑盡量

13、采用DEPC水配制，（DEPC是RNase的強(qiáng)烈抑制劑） 3、操作人員務(wù)必佩戴一次性乳膠手套操作RNA的提取。 4、RNA提取體系中兩種著名的RNA酶抑制劑,異硫氰酸弧(GTC)和-巰基乙醇 5、低溫離心,核酸提取方法分離與純化,其它核酸分離純化的方法： 1、玻棒纏繞法；玻璃粉（珠）吸附法； 2、甲酰胺解聚法； 3、離子交換層析；親和層析法； 4、密度梯度離心法； 5、等等,核酸提取方法分離與純化,分離純化方法小結(jié)：,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,血清樣本核酸提取方法： 血清中可能存在的核酸及其來源： DNA：HBV，HCMV，EBV等； RNA：HCV，HIV等 胞外游離核酸（循環(huán)核酸） 游離

14、DNA 在血清中以雙鏈形式存在，多數(shù)可與核蛋白形成復(fù)合物，通過瓊脂糖電泳觀察DNA 呈“梯形”分布，片段大小約在180 21000 bp之間。 一般需要0.2-1ml的血清進(jìn)行核酸提取。,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,血清樣本核酸提取方法： 血清中微生物來源DNA提取方法： 1、 加熱煮沸法； A、 高速離心富集病原體顆粒； B、棄上清，加入表面活性劑等，95-10010分鐘； C、高速離心，DNA游離于上清，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)位于管底。 純度極差，但成本很低，手工操作重復(fù)性在臨床可接受范圍。 2、磁珠法； 成本較高,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,血清樣本核酸提取方法： 血清中微生物來源RNA提取方法：

15、 1、 酚氯仿法； 繁瑣，手工操作重復(fù)性較差 2、磁珠法； 方便，易于自動(dòng)化，重復(fù)性很好，成本較高,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,血清樣本核酸提取方法： 血清中循環(huán)核酸提取方法： 1、酚氯仿法； 2、磁珠法； 人類基因組、發(fā)生腫瘤時(shí)異常升高；-孕婦的循環(huán)核酸亦可來源于胎兒。,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,全血樣本核酸提取方法： 1、 酚氯仿法； 純度好，產(chǎn)量較高，完整性高 2、磁珠法； 純度好，產(chǎn)量較高，完整性較高 3、 硅膠柱吸附法； 純度好，產(chǎn)量較低，完整性一般 4、加熱煮沸法 純度差，產(chǎn)量較低，完整性差 前處理：紅細(xì)胞裂解液or低滲液去除紅細(xì)胞 應(yīng)用于：融合基因檢測(cè)，遺傳病檢測(cè)等,實(shí)驗(yàn)室常見

16、樣本核酸提取方法,痰標(biāo)本提取方法： 清晨深部痰，無唾液，無口腔微生物污染； 痰液中大量粘蛋白，需液化后進(jìn)行提取操作。 加熱煮沸法；磁珠法；層吸柱等均可。 常用的痰標(biāo)本液化方法： 1、3-5倍體積1M NaOH，消化30分鐘左右。過程中可加熱。 高速離心后，提取沉淀核酸。 2、蛋白酶消化過夜，直接處理全部液體。 3、Saccomno液+DTT,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,痰標(biāo)本提取方法： Saccomno液：每50毫升固定液中含50 乙醇48 mL，2聚乙二醇1 mL、0.3利福平1 mL ； DTT (二硫蘇糖醇)液: 0.1g DTT、0.78g NaCl、0.02g KCl、0.112g

17、磷酸二氫鈉、0.02g 磷酸二氫鉀，加水至2L，使DTT濃度為0.005； 上述兩種液體等體積混合，12倍體積加入到痰液中，振搖液化30min，高速離心，沉淀提取核酸。 Saccomanno法是1963年由Saccomanno建立的一種經(jīng)典的痰液固定方法，其主要作用是固定痰液中脫落細(xì)胞的形態(tài)，使細(xì)胞膜不致于破裂，防止細(xì)胞崩解，以利于進(jìn)行脫落細(xì)胞學(xué)檢查。DTT法由橋木等人首先應(yīng)用，破壞粘液蛋白中的二硫鍵，對(duì)痰液的液化效果較好，單獨(dú)使用DTT可能導(dǎo)致痰液從溶液向凝膠狀態(tài)轉(zhuǎn)化。Saccomanno固定液能穩(wěn)定分子間的關(guān)系，從而避免痰液凝膠狀態(tài)化，達(dá)到很好的液化效果。,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,尿液

18、標(biāo)本提取方法： 一般采用晨尿檢測(cè)；尿液中的核酸主要為病原體（NG，CT，UU，BK-JC，TB等）少量人類基因組核酸。 無特殊前處理。 一般留取30-50ml尿液，高速離心，用沉淀進(jìn)行核酸提取。沉淀可用PBS或生理鹽水進(jìn)行2-3洗滌。 加熱煮沸法；磁珠法；層吸柱等均可。,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,腦脊液標(biāo)本提取方法： 肉眼觀察，清亮的腦脊液樣本，無特殊前處理；渾濁樣本因其含有較多炎性細(xì)胞或其它粘性細(xì)胞，則需用前述痰標(biāo)本液化方法處理。 腦脊液中的核酸主要來源為病原體，如結(jié)核桿菌等 一般至少用0.2ml腦脊液進(jìn)行核酸提取。 加熱煮沸法；磁珠法；層吸柱等均可。,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,胸腹水標(biāo)

19、本提取方法： 肉眼觀察，清亮的胸腹水樣本，無特殊前處理；渾濁樣本因其含有較多炎性細(xì)胞或其它粘性細(xì)胞，則需用前述痰標(biāo)本液化方法處理。 胸腹水中的核酸主要來源為病原體，如結(jié)核桿菌等 一般至少用15ml左右樣本進(jìn)行核酸提取。 加熱煮沸法；磁珠法；層吸柱等均可。,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,組織切片提取方法： 組織切片中的核酸主要為人類局部病灶基因組，如癌組織基因組。目前實(shí)驗(yàn)室主要用于檢測(cè)Kras和EGFR突變。 一般前處理方法： 1、切除多余石蠟； 2、將組織切碎，是最大徑不超過0.5mm； 3、加入細(xì)胞裂解緩沖液，繼續(xù)搗碎呈勻漿； 4、加入蛋白酶和SDS等，70振蕩孵育過夜； 5、酚氯仿，磁珠，層

20、析柱等分離純化核酸。不推薦加熱煮沸，因其純度過低。,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,血痕，毛發(fā)，口腔拭子標(biāo)本提取方法： 法醫(yī)物證常見樣本。 血痕：約0.5cm大小，浸泡于紅細(xì)胞裂解液約30分鐘，高速離心棄上清，加入0.2ml 10%chelx100和適量蛋白酶K，56孵育約1小時(shí)，加熱煮沸，高速離心獲得DNA； 毛發(fā)：將毛囊部分浸入0.2ml 10%chelx100和適量蛋白酶K液體中， 56孵育2小時(shí)以上，加熱煮沸，高速離心獲得DNA； 口腔拭子：口腔拭子浸入生理鹽水orPBS中，擠壓洗滌數(shù)分鐘。余同血痕DNA提取。,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,前列腺液，精液，宮頸分泌物等標(biāo)本提取方法： 發(fā)生生

21、殖道感染時(shí)，從該類樣本中提取相關(guān)病原體核酸。 比如：NG，CT，UU，HPV等 精液需進(jìn)行液化，一般37放置30min即可自行液化，如有病理情況，參照痰液樣本進(jìn)行液化。 前列腺同腦脊液等；宮頸分泌物多為拭子，同口腔拭子。 實(shí)驗(yàn)室多用加熱煮沸法進(jìn)行DNA分離純化。,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,結(jié)核桿菌提取方法：,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,結(jié)核桿菌提取方法：,細(xì)胞壁富含脂質(zhì)。一般的溶菌酶沒有破壁效果。,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,結(jié)核桿菌提取方法： 常用的破壁方法： 1、超聲破壁； 2、勻漿器破壁； 3、液氮研磨； 4、氯仿:乙醇（2:1）脫脂破壁； 5、堿裂解煮沸法等 6、市售專用TB裂解液，Qiagen、bioMrieux、Invitrogen等 結(jié)核桿菌可來源于各種樣本：痰、腦脊液、尿、胸腹水、組織切片等,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,瓊脂糖電泳回收DNA方法：,用途：獲得特異的PCR和/或提取的核酸片段,實(shí)驗(yàn)室常見樣本核酸提取方法,瓊脂糖電泳回收DNA方法： 1、切膠，TE或蒸餾水浸泡過夜； 2、切膠后采用前述核酸分離純化方法或市售試劑盒。,實(shí)驗(yàn)室核酸提取