稀堿法提取RNAppt課件.ppt

1、實(shí)驗(yàn)十,酵母RNA的提取與組分鑒定,演講：劉長(zhǎng)偉 材料收集：劉亮亮 制作：李媛媛,1,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)稀堿法提取RNA的原理和操作方法 2. 掌握RNA組分的鑒定方法,2,原 理,酵母中含有豐富的RNA(可達(dá)酵母干重的2.67%10%），是工業(yè)上大規(guī)模制備核酸和核苷酸的原料。稀堿法是工業(yè)上常用的RNA提取方法之一，其原理是用稀堿溶液裂解細(xì)胞，使RNA釋放到堿液中，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH至2.5利用等電點(diǎn)沉淀RNA.,3,RNA用H2SO4水解時(shí)，可以生成磷酸戊糖和堿基，以下列反應(yīng)鑒定各種成分。磷酸：用強(qiáng)酸使RNA中的有機(jī)磷消化生成無(wú)機(jī)磷，后者與定磷

2、試劑中的鉬酸銨結(jié)合成磷鉬酸銨（黃色沉淀），當(dāng)有還原劑存在時(shí)磷鉬酸銨立即轉(zhuǎn)變成藍(lán)色的還原產(chǎn)物鉬藍(lán)；核糖：RNA與濃鹽酸共熱時(shí)，發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛，在 或 催化下后者與苔黑酚反應(yīng)，生成鮮綠色復(fù)合物；嘌呤堿：嘌呤堿與AgNO3能產(chǎn)生白色的嘌呤銀化物沉淀。,4,器材和試劑,1.器材：沸水浴，量筒，刻度移液管，吸管及滴管，布氏漏斗和抽濾裝置，試管，試管架和試管夾，離心機(jī)，濾紙，pH試紙，燒杯，天平，酵母粉。,5,2.試劑 0.2%（m/V）NaOH溶液 95%（V/V）乙醇 冰乙酸 無(wú)水乙醚 1.5mol/L H2SO4 溶液 濃氨水 5%（m/V）AgNO3 溶液 苔黑酚乙醇溶液 稱取

3、苔黑酚6g，溶解于95%乙醇100mL(冰箱中可保存一個(gè)月） 的濃鹽酸溶液 取10%（m/V） 溶液2mL，與濃鹽酸400mL混合。,6,定磷試劑 1）17%（m/V）H2SO4 溶液 2）2.5%（m/V）鉬酸銨溶液 3）10%（m/V）抗壞血酸溶液（貯藏于棕色瓶中，溶液在冰箱放置可用1個(gè)月。溶液呈淡黃色時(shí)可用，如呈深黃色或棕色則已失效。） 臨用時(shí)將上述3種溶液與水按如下比例混合（限當(dāng)天使用） 17% H2SO4：2.5%鉬酸銨：水：10%抗壞血酸=1:1:2:1(V/V),7,實(shí)驗(yàn)步驟,1.RNA的粗提取 取酵母粉1g，放入一大試管中，加入0.2%NaOH溶液10mL，搖勻成懸浮液。 將懸

4、浮液在沸水浴中加熱20分鐘，冷卻至室溫，傾入離心管中，3000r/min離心10分鐘。 將上清液緩緩傾入含3mL95%乙醇的試管中，注意要一邊攪拌一邊傾入，用冰乙酸調(diào)pH至2.5。靜置，待RNA完全沉淀后，3000r/min離心5分鐘。,8,棄去上清液，向離心管中加入95%乙醇5mL，振蕩搖勻以洗滌沉淀，3000r/min離心3分鐘，再棄去上清液，管底部的沉淀即為RNA粗制品。 2.水解RNA 向上述含有RNA沉淀的離心管中加入 1.5mol/LH2SO4 溶液10mL，振蕩搖勻后轉(zhuǎn)入到一大試管中，沸水浴中加熱10min，使RNA水解，過(guò)濾水解液，濾液用于RNA組分的定性鑒別。 3.RNA組分

5、鑒定 嘌呤堿 取一支試管，加入水解液1mL，濃氨水2mL，混勻后沿管壁慢慢加入5%的AgNO3 溶液1mL，勿振蕩，靜置5min，觀察是否產(chǎn)生白色絮狀嘌呤銀化物沉淀。,9,核糖 取試管一支，加入水解液1mL，再加入 的濃鹽酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液5滴，在通風(fēng)櫥中沸水浴加熱5分鐘，觀察試管中顏色變化。 磷酸 取試管一支，加入水解液1mL和定磷試劑1mL，在沸水浴中加熱，觀察試管中顏色變化。,10,要點(diǎn)提示,1.用苔黑酚（又名地衣酚 3,5-二羥基甲苯）鑒定戊糖時(shí)特異性較差，凡屬戊糖均有此反應(yīng)。甚至木某些戊糖持續(xù)加熱后生成的羥甲基糠醛也能與苔黑酚反應(yīng)，產(chǎn)生顯色復(fù)合物。微量DNA無(wú)影響，在試劑中加入適量 可減少DNA的干擾。 2.用乙醇沉淀RNA時(shí)，須用酸中和稀堿，可以加冰乙酸至pH2.5，也可以直接用酸性乙醇（濃鹽酸1mL加入乙醇100mL中）至溶液pH為2.5。 3.用AgNO