質(zhì)粒種類與應(yīng)用.ppt

1、克隆載體,基因載體是一類能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復(fù)制，可用以置換或插入外源(目的) DNA而將目的DNA帶入宿主細(xì)胞。 常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、病毒等,基因工程載體的構(gòu)建必需應(yīng)用表達(dá)調(diào)控的基本理論知識(shí)，應(yīng)用已知的調(diào)控序列進(jìn)行重組、改造。,基因載體應(yīng)具備的條件： （1）有多種限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，但每種切口最好只有1個(gè)； （2）有選擇標(biāo)記，例如抗藥性標(biāo)記，藍(lán)白斑試驗(yàn)； （3）有一定容量； （4）有相當(dāng)?shù)某緮?shù)，即每個(gè)宿主菌可能容納的最多數(shù)。,多克隆位點(diǎn),ori,復(fù)制起始點(diǎn),遺傳標(biāo)記,Amp,polylinker,基因載體,載體的功能及特征,載體的功能,運(yùn)送外源基因高

2、效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞,為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力,為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件,載體的功能及特征,載體應(yīng)具備的條件,具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）,具有合適的篩選標(biāo)記,具有較高的外源DNA的載裝能力,具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn),具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn),質(zhì)粒(plasmid ),Plasmid 獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。 Plasmid chromosome,質(zhì)粒,質(zhì)粒的基本特征,質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并,被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子,質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中,絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的,絕大多數(shù)的天

3、然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，,即cccDNA,質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1 - 300 kb,質(zhì)粒,質(zhì)粒的基本特征,質(zhì)粒的自主復(fù)制性,質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制,質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系,根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃?兩大復(fù)制類型：,嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒 1 - 3 拷貝 stringent plasmid,松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒 10 - 60 拷貝 stringent plasmid,質(zhì)粒,質(zhì)粒的基本特征,質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制 質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制,控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合,ori,E.coli

4、 ColE1 plasmid,復(fù)制方向,rop,（+）,Rop,RNA II,RNA I,3,5,5,3,質(zhì)粒,質(zhì)粒的基本特征,質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制 質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制,控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）的結(jié)合,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Cop,Rep,質(zhì)粒,質(zhì)粒的基本特征,質(zhì)粒的不相容性,任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于,一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì),以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：,ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容,pSC101、F、RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容,p15A及其衍

5、生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容,粒組成不相容性群,質(zhì)粒,質(zhì)粒的基本特征,質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制,兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種,拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，,兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的,拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，,因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一,細(xì)胞內(nèi),其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì),質(zhì)粒,質(zhì)粒的基本特征,質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性,革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒可分成兩大類：,接合型質(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到,另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒

6、等,如Col、R的其它成員,非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用,值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒,的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由 bom 和,mob 基因決定,20060421,質(zhì)粒,質(zhì)粒的基本特征,攜帶特殊的遺傳標(biāo)記,野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這,使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：,物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物,物質(zhì)合成 抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿,這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義,質(zhì)粒,質(zhì)粒的構(gòu)建,天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記

7、不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。,目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：,pSC101 8.8 kb 拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 Tcr,ColE1 6.5 kb 拷貝數(shù) 20 - 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因 E1,RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Apr,質(zhì)粒,質(zhì)粒的分類,人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：,高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù)1000-3000 擴(kuò)增基因,低拷貝質(zhì)粒 來自pSC101 拷貝數(shù)小于10 表達(dá)某些毒性基因,溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)

8、、整合等不同性質(zhì),測(cè)序質(zhì)粒 含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker,整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn) 便于外源基因的整合,穿梭質(zhì)粒 裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子 便于基因克隆,表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件,探針質(zhì)粒 裝有報(bào)告基因 便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選,第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二階段：增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。 第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T

9、3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。,發(fā)展概況,pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，換上合用的表達(dá)組件，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。 許多實(shí)用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成?？梢娖湓唾|(zhì)粒在使用上有優(yōu)點(diǎn)。,pBR322,有過百個(gè)限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，一種限制性內(nèi)切酶只有單一切口的位點(diǎn)也多達(dá)數(shù)十個(gè)，幾乎具備了所有常用限制酶都能切開并插入目的基因的優(yōu)越條件。 此外，pBR322DNA，被限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段大小均已知道，可以作為核酸電泳的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。,重

10、要的大腸桿菌質(zhì)粒載體,松弛型復(fù)制,pBR322：,氯霉素可擴(kuò)增,拷貝數(shù) 50 - 100 / cell,用于基因克隆,抗藥性標(biāo)志的選擇,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,pUC質(zhì)粒系列,pUC質(zhì)粒系列也是在pBR322基礎(chǔ)上改建成的。 它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)。去除了pBR322的tetr區(qū)段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ 基因及其啟動(dòng)子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker.,476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表達(dá)半乳糖苷酶的片段。 LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟動(dòng)子P

11、lac和操縱基因O。 lacZ之內(nèi)是M13的多功能連接器。,三個(gè)顯著特點(diǎn)： （1）分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞含500-700個(gè)拷貝）。 （2）含易于檢測(cè)是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZ，可利用-互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。 （3）多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。 其MCS區(qū)與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到M13mp載體，進(jìn)行DNA測(cè)序和體外突變等研究。,重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體,pUC18 / 19：,拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell,用于基因克隆和測(cè)序,裝有多克隆位點(diǎn)（MCS

12、）,正選擇顏色標(biāo)記 lacZ,質(zhì)粒,重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體,pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,pKO系列,組成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR322的EcoRI-PvuII位點(diǎn)包括terr，. 表達(dá)產(chǎn)物催化 Gal + ATP Gal-1-P+ADP 以14C標(biāo)記的半乳糖作底物,檢測(cè)生成的*Gal-1-P的放射性。,在Galk基因上游插入目的基因，根據(jù)基因表達(dá)產(chǎn)物半乳糖激酶活性，即14C-Gal-l-P的放射性，可定量估算啟動(dòng)子

13、功能的強(qiáng)弱。 如在Galk基因前插入目的基因，與無插入的空載pKO比較，并無放射活性的增強(qiáng)，則說明插入片段不存在有啟動(dòng)子。,重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體,pGEM-3Z：,多拷貝,裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子,裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）,正選擇顏色標(biāo)記 lacZ,用于外源基因的高效表達(dá),注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3E,PSP6,酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：,E.coli BL21（DE3）等,乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物是乳糖 乳糖類似物異丙基-D -硫代半乳糖苷（IPTG）

14、有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。 IPTG配合使用在基因工程可作藍(lán)白斑篩選。 LacZ基因編碼的乳糖苷酶 X-gal 藍(lán)色吲哚產(chǎn)物,藍(lán)白斑試驗(yàn)（IPTG-Xgal 試驗(yàn)）,Z Y X,P,O,Z Y X,P,O,乳糖,標(biāo)志補(bǔ)救（-半乳糖苷酶法）,lacZ,（LacZ基因 N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因 C端序列,LacZ酶,基因克隆時(shí)的定向插入,插入序列兩邊的酶切口不同,插入的組件不會(huì)倒裝，保證了在其下游目的基因插入后，沿53方向正確轉(zhuǎn)錄，這種構(gòu)建方式稱為定向插入。,EcoRI,HindIII,Ori復(fù)制起點(diǎn),LacZ,APR,pUC19,質(zhì)粒,質(zhì)粒DNA的分離純化,實(shí)驗(yàn)室一般使用

15、下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：,氯化銫密度梯度離心法,質(zhì)粒DNA純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染,堿溶法,質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡(jiǎn)便,沸水浴法,質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間,質(zhì)粒,質(zhì)粒DNA的分離純化,氯化銫密度梯度離心法：,用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體,加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁,加CsCl和溴乙錠,超速離心過夜,在紫外燈下吸取cccDNA,稀釋沉淀cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,質(zhì)粒,質(zhì)粒DNA的分離純化,堿溶法：,用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體,加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁,加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

16、,加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染,色體DNA及大部分蛋白質(zhì),離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì),乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA,用無DNase的RNase去除殘余的RNA,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,質(zhì)粒,質(zhì)粒DNA的分離純化,沸水浴法：,用含有EDTA和Triton X-100的緩沖液懸浮菌體,加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁,沸水浴40秒鐘,離心，用無菌牙簽挑去沉淀物,乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA,噬菌體或病毒DNA,噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染,宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏,起來，而且在一定

17、的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。,噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工,程的有用載體，因?yàn)椋?高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞,自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增,噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l 噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu),l 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體,l 噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成,l-DN

18、A全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸,l-DNA上至少有61個(gè)基因,l 噬菌體生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu),5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,頭部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重組基因,刪除與整合基因,l - DNA,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l 噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期,E.coli,吸附,LamB受體,注入,復(fù)制,包裝,裂解,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l 噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期,體內(nèi)包裝,100個(gè)左右的拷貝,包裝范圍

19、為原DNA的75 - 105%,即 36 - 51 kb,D,A,包裝范圍為原DNA的75 - 105%,即 36 - 51 kb,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l 噬菌體生物學(xué)特性： 溶原狀態(tài),l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶原狀態(tài)，或處于裂解狀態(tài) DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶原狀態(tài),噬菌體線

20、性雙鏈DNA病毒，具有末端互補(bǔ)的12nt，感染細(xì)菌后粘端互補(bǔ)成雙鏈環(huán)狀。全長(zhǎng)48 531bp，含50多個(gè)基因。,噬菌體整個(gè)基因組如圖所示，可分為三個(gè)部分,左臂：從A到J長(zhǎng)約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。 中段：長(zhǎng)約20kb，是DNA整合和切出，溶原生長(zhǎng)所需的序列。 右臂：長(zhǎng)約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長(zhǎng)最重要的調(diào)控基因和序列、以及DNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含DNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長(zhǎng)所需全部序列；對(duì)溶菌生長(zhǎng)來說，中段是非必需的。,噬菌體基因大致分為4個(gè)區(qū)： 結(jié)構(gòu)區(qū)A J19個(gè)基因，編碼頭、 尾部蛋白

21、質(zhì)為結(jié)構(gòu)區(qū),重組區(qū) att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子、終止子和N、CI基因， O-R 為裂解區(qū).,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度,野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：,插入型載體,取代型載體,噬菌體及其組件的應(yīng)

22、用,噬菌體可以容納較大的目的基因。例如用置換法可去掉長(zhǎng)達(dá)20kb的DNA，換入相應(yīng)長(zhǎng)度的目的基因。 基因文庫(kù)構(gòu)建常使用載體； 不少先進(jìn)的質(zhì)粒應(yīng)用組件進(jìn)行構(gòu)建。,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度 插入型載體,體外包裝,插入位點(diǎn),體外包裝,插入片段,載體長(zhǎng)度 37 kb,插入片段大小：,0 - 14 kb,（51 37）,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度 取代型載體（置換型載體）,體外包裝,體外包裝,插入片段,最小裝載長(zhǎng)度 10 kb,（51 26）,載體長(zhǎng)度 26 kb,插入片段,最大裝載長(zhǎng)度 25

23、kb,（36 26）,允許外源 DNA 片段替換非必須 DNA 片段的載體，稱為置換型載體（replacement vectors）。一般情況下，置換型載體克隆外源片段的大小范圍是 9-23kb ，故而該載體主要用來構(gòu)建基因組文庫(kù)。,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn),野生型的l-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不,利于重組操作，必須刪除至1 - 2個(gè),同時(shí)，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一,些單一的酶切位點(diǎn),除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶,位點(diǎn),噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的

24、 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記,與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此,加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容,l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：,免疫功能類標(biāo)記,顏色反應(yīng)類標(biāo)記,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記 imm434,imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體,進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記,基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶,原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；,當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅,活， l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成,透明斑,噬菌體或病毒DNA,大腸

25、桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記 lacZ,lacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化,無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基,因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能,合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn),生藍(lán)色透明斑,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構(gòu)建：構(gòu)建琥珀密碼子的突變體,琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。 將野生型l-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入

26、一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的主要類型：,插入滅活型載體,Charon2、Charon6、lgt11,取代型載體,lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40,正選擇型載體,lEMBL1、lL47、l1059,野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（Spi+），,這種生長(zhǎng)抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個(gè)基因控制。若將外,源DNA取代red和gam，重

27、組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌,體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA重組分子的體外包裝：,l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞 用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的,DNA的體外包裝

28、 是提高噬菌體轉(zhuǎn)染效率的有效方法 在A蛋白（有終止復(fù)制功能），E蛋白（是包裝蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重組體DNA轉(zhuǎn)入頭部。,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA及其重組分子的分離純化：,將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37培養(yǎng)1小時(shí),用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4 -12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒,密度已達(dá)1013 -1014 / L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解,超速離心，沉淀噬菌體,苯酚抽提，釋放l-DNA,乙醇或異丙醇沉淀l-DNA,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：

29、,l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌,l-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量,重組l-DNA分子的篩選較為方便,重組l-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便,l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá),外源基因,表達(dá)載體 pET-5a 是典型的 pET 載體，其組成是在載體的基本結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上加入了 T7 噬菌體啟動(dòng)子序列及其下游的幾個(gè)酶切位點(diǎn)。當(dāng)外源基因插入到這些酶切位點(diǎn)后，就可在特定的宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNA,M13噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu),M13噬菌體的外型呈絲狀,M13 噬菌體由外殼包裝蛋白

30、和正鏈DNA組成,M13 DNA全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸,M13 DNA上至少有10個(gè)基因,2700個(gè)外殼蛋白分子,M13 噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng),M13 噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂。,M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA ，由 6407 的堿基組成 （GenBank 注冊(cè)號(hào)為 V00604） 。基因組 90% 以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有 11 個(gè)編碼基因，基因之間的間隔區(qū)多為幾個(gè)堿基。較大的間隔位于基因 和基因 以及基因 和基因 之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和 DNA 合成的元件。 M

31、13 噬菌體基因組可編碼 3 類蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白（基因 ， 和 ），形態(tài)發(fā)生蛋白（基因， 和 ），結(jié)構(gòu)蛋白（基因 、 和 ）。基因組 DNA 為正鏈，按基因 至基因 方向合成，與噬菌體的 mRNA 序列同義。,M13 噬菌體顆粒為絲狀長(zhǎng)管狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng) 880nm ，直徑 6-7nm 。噬菌體顆粒的核心由 2700 個(gè)基因 編碼的結(jié)構(gòu)蛋白呈管狀排列而成，成熟的基因 的產(chǎn)物為由 50 個(gè)氨基酸殘基組成的 螺旋蛋白。頂端由 5 個(gè)基因 和 5 個(gè)基因 產(chǎn)物組成，作用于間隔區(qū)中的包裝信號(hào)。 5 個(gè)基因 蛋白和 5 個(gè)基因 蛋白位于絲桿的末端，參與對(duì)性纖毛的吸咐。右圖是 M13 噬菌體結(jié)構(gòu)模型。,噬菌

32、體或病毒DNA,大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNA,M13噬菌體的生物學(xué)特性： 感染周期,（+）DNA,RFDNA,RFDNA,RFDNA,- DNA,II,V,在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删w DNA （正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈 DNA ，用于 DNA 的復(fù)制，因此這種雙鏈 DNA 稱為復(fù)制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA 。通過 復(fù)制方式， RF DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，基因的轉(zhuǎn)錄也隨即開始。基因組中的任意一個(gè)啟動(dòng)子都可以啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，單方向地終止于下游的終止子。啟動(dòng)子和終止子的位置關(guān)系使得靠近終止子的基因轉(zhuǎn)錄更頻繁。,單鏈 DNA 的酶切

33、和連接是比較困難的，因此 M13 噬菌體在用作載體時(shí)是利用其雙鏈狀態(tài)的 RF DNA。RF DNA 很容易從感染細(xì)胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNA,M13 DNA載體的構(gòu)建：,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型M13RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13mp系列載體,lacZ,polylinker,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNA,M13 DNA載體的特點(diǎn)：,使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外,

34、這在DNA定向突變中非常有用,M13重組分子篩選簡(jiǎn)便,被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混,濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁,斑的混濁度亦越大,但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5 kb,噬菌體或病毒DNA,與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病,毒基因組DNA。,動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病,毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類：,單鏈DNA病毒,雙鏈DNA病毒,單鏈RNA病毒,雙鏈RNA病毒,RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，,這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組。,考斯質(zhì)粒與噬菌粒,l-

35、DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25 kb和,1.5 kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，,考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA,的裝載量。,在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長(zhǎng)度，,就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序,列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度，同時(shí),又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這,便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒,和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi),不能形成噬菌體顆粒。,粘粒（cosmid）實(shí)際是質(zhì)粒的衍生物

36、，是帶有 cos 序列的質(zhì)粒。 cos 序列是 噬菌體 DNA 中將 DNA 包裝到噬菌體顆粒中所需的 DNA 序列。 粘粒的組成包括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（colE1），抗性標(biāo)記（ampr）， cos 位點(diǎn)，因而能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用來克隆大片段 DNA ，克隆的最大 DNA 片段可達(dá) 45kb 。有的粘粒載體含有兩個(gè) cos 位點(diǎn)，在某種程度上可提高使用效率。,考斯質(zhì)粒與噬菌粒,考斯質(zhì)粒（cosmid）,考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：,考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有,1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,

37、ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的,特殊類型的載體,cos site - carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段,裝載范圍為31 - 45 kb,考斯質(zhì)粒與噬菌粒,考斯質(zhì)粒（cosmid）,考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：,能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞,裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍,能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制,重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易,不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞,考斯質(zhì)粒與噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,噬菌粒載體的特點(diǎn)：,噬菌粒是一類

38、人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子,以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體,能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞,裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10 kb）,能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制,重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易,通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長(zhǎng)度的單一單鏈DNA,考斯質(zhì)粒與噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,重要的噬菌粒載體：pUC118 / 119,pUC118 pUC18 + M13間隔區(qū) IG,pUC119 pUC19 + M13間隔區(qū) IG,500 個(gè)拷貝,3200 bp,MCS,lacZ,lacI,ori,Apr,M13

39、-MG,pUC118 / 119,表示M13輔助噬菌體DNA,考斯質(zhì)粒與噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,重要的噬菌粒載體：pBluescript 體外轉(zhuǎn)錄載體,pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7,2958 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,f1-ori,pBluescript,PT3,噬菌體啟動(dòng)子PT3和PT7強(qiáng)化外,源基因的轉(zhuǎn)錄,提取出來的單鏈DNA重組分子,在噬菌體RNA聚合酶的存,在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因,的體外轉(zhuǎn)錄,人們?cè)O(shè)計(jì)出一些多功能的質(zhì)粒載體，這類質(zhì)粒載體有多克隆位點(diǎn)、 -互補(bǔ)、噬菌體啟動(dòng)子和單鏈?zhǔn)删w

40、的復(fù)制與包裝信號(hào)。 典型的這類質(zhì)粒有 pBluescriptKS（），這類質(zhì)粒一般由 4 個(gè)質(zhì)粒組成一套系統(tǒng)，其差別在于多克隆位點(diǎn)方向相反（根據(jù)多克隆位點(diǎn)兩端 Kpn 和 Sac 的順序，用 KS 或 SK 表示），或單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制啟始方向相反（或者說，引導(dǎo) DNA 雙鏈中不同鏈合成單鏈 DNA ，用 + 或 - 表示）。 pBluescriptKS（） 的多克隆位點(diǎn)與 pUC18/19 的不同，且使用 f1 噬菌體的復(fù)制與包裝信號(hào)序列 。,人造染色體載體,人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百,甚至上千 kb 的DNA片段， 此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載,量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要

41、。,將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn),定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外,源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，,它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。,目前常用的人造染色體載體包括：,細(xì)菌人造染色體（BAC）,酵母人造染色體（YAC）,人造染色體載體,細(xì)菌人造染色體（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,構(gòu)建的，其裝載量范圍在50 - 300 kb之間,各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝,pBACs主要適用于：,克隆

42、大型基因簇（gene cluster）結(jié)構(gòu),構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù),F 質(zhì)粒,大腸桿菌的 F 因子是一個(gè)約 100kb 的質(zhì)粒。它編碼60多種參與復(fù)制、分配和接合過程的蛋白質(zhì)（Willetts and Skurray，1987）。 雖然F因子通常以雙鏈閉環(huán)DNA（1-2個(gè)拷貝/細(xì)胞）的形式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少30個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)行隨機(jī)整合（Low，1987）。 攜帶F因子的細(xì)胞，或以游離狀態(tài)或以整合狀態(tài)表達(dá)三根發(fā)樣狀的F菌毛。F菌毛為供體與受體細(xì)胞之間產(chǎn)生性接觸所必需。,細(xì)菌人工染色體是基于大腸桿菌的 F 質(zhì)粒構(gòu)建的，高通量低拷貝的質(zhì)粒載體。 每個(gè)環(huán)狀 DNA 分子中攜帶一個(gè)抗生素抗性標(biāo)

43、記，一個(gè)來源于大腸桿菌 F 因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一個(gè)易于 DNA 復(fù)制的由 ATP 驅(qū)動(dòng)的解旋酶（ （RepE） 以及三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ） 。 BAC 載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產(chǎn)生，減小外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用。,20060424,真核生物載體,電穿孔技術(shù)是利用脈沖電場(chǎng)改變細(xì)胞膜的狀態(tài)和通透性，達(dá)到將DNA導(dǎo)入細(xì)胞以及促使細(xì)胞發(fā)生融合的目的。 該技術(shù)目前一方面應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，另一方面應(yīng)用于

44、細(xì)胞融合制備雜交細(xì)胞和動(dòng)物克隆等。,顯微注射技術(shù)將外源DNA注入細(xì)胞,基因槍技術(shù),是一種將核酸直接發(fā)送至細(xì)胞內(nèi)的物理學(xué)方法。 PDS-1000/H臺(tái)式基因槍可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的原位轉(zhuǎn)導(dǎo)；應(yīng)用于包括培養(yǎng)細(xì)胞、組織、器官、植物、動(dòng)物、細(xì)菌和細(xì)胞器官等各種不同的目標(biāo)。,穿梭載體（Shuttle vector）,是能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體。如有些載體既能在原核細(xì)胞中復(fù)制又能在真核細(xì)胞中復(fù)制，或能在 E.coli 中復(fù)制又能在革蘭氏陽性細(xì)菌中復(fù)制。這類載體主要是質(zhì)粒載體。,酵母附加型質(zhì)粒,2um質(zhì)粒是非常好的克隆載體，它有6kb大小，在酵母細(xì)胞中的拷貝數(shù)在70-200之間，利用質(zhì)粒的復(fù)制起

45、始位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制，許多酶由寄主細(xì)胞提供，質(zhì)粒中含有編碼蛋白質(zhì)的基因REP1, REP2。 2um質(zhì)粒的問題：選擇標(biāo)記的問題。在實(shí)踐中，利用酵母的正常的基因，一般是編碼氨基酸合成的酶，如LEU2基因編碼-異丙基蘋果酸脫氫酶，參與丙酮酸向亮氨酸的轉(zhuǎn)化。為了利用LEU氨酸作為選擇標(biāo)記，需要用到一種特殊的寄主，寄主必須是LEU-2營(yíng)養(yǎng)缺陷體這樣的寄主只有在添加亮氨酸的條件下才能生長(zhǎng)。質(zhì)粒中含有LEU-2合成基因，可以在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。,以2um質(zhì)粒為基礎(chǔ)的載體酵母附加質(zhì)粒,來自于2um質(zhì)粒的載體稱為酵母附加載體或者YEps。YEps可以含有完整的2um質(zhì)粒，也可以只含有2um質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，如YEp1

46、3以后的類型。 YEp13是一個(gè)穿梭質(zhì)粒，含有2um質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和選擇基因LEU2, YEp13還包含pBR322的完整序列，因此可以在大腸桿菌也可以在酵母中進(jìn)行選擇。,YEp的結(jié)構(gòu),YEp整合到酵母染色體上,根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒,幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農(nóng)桿菌感染，而產(chǎn)生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌（A. tumefaciens）。 其致瘤特性是由Ti（tumorinducing）質(zhì)粒介導(dǎo)的。,農(nóng)桿根瘤菌之所以會(huì)感染植物根部是因?yàn)橹参锔繐p傷部位分泌出酚類物質(zhì)乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質(zhì)可以誘導(dǎo)Vir（Virulence region)基因的啟動(dòng)表達(dá)，Vir基因的產(chǎn)物

47、將Ti質(zhì)粒上的一段TDNA單鏈切下，而位于根瘤染色體上的操縱子基因產(chǎn)物則與單鏈TDNA結(jié)合，形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。 TDNA上有三套基因，其中兩套基因分別控制合成植物生長(zhǎng)素與分裂素，促使植物創(chuàng)傷組織無限制地生長(zhǎng)與分裂，形成冠癭瘤。第三套基因合成冠癭堿，冠癭堿有四種類型：章魚堿（octopine）、胭脂堿（nopaline）、農(nóng)桿堿（agropine）、琥珀堿（succinamopine），使農(nóng)桿菌生長(zhǎng)必需的物質(zhì)。,Ti質(zhì)粒大約在160240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區(qū)在36kb左右。除此之外，Ti質(zhì)粒上還存在Con區(qū)（region encoding c

48、onjugation)和Ori區(qū)（origin of replication)。 T-DNA上共有三套基因和左右兩個(gè)邊界，LB和RB是長(zhǎng)為25bp的末端反復(fù)重復(fù)順序，在切除及整合過程具有重要意義。,T-DNA切除由Vir區(qū)編碼的特異性內(nèi)切酶完成，分別在LB和RB的第三個(gè)堿基和第四個(gè)堿基之間產(chǎn)生缺口，并形成單鏈T-DNA。 T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不對(duì)稱的，RB順序與整合有關(guān)，而LB無關(guān)。 T-DNA的整合可以是單拷貝的，也可以是多拷貝的，成串聯(lián)形式排列，但整合位點(diǎn)的特異性尚未確定。,植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的共整合系統(tǒng),T-DNA克隆在大腸桿菌質(zhì)粒上，含有E.coli的選擇標(biāo)記和植物選擇標(biāo)記

49、Kmr。 首先在E.coli中篩選重組分子，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質(zhì)粒上，用于侵染植物細(xì)胞。T-DNA重組分子整合到植物細(xì)胞染色體DNA上，Kmr篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。,植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的雙元系統(tǒng),目前T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法是雙元系統(tǒng)，即穿梭質(zhì)粒。插入外源基因的重組穿梭質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化含有Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后直接感染植物細(xì)胞。與共整合系統(tǒng)所不同的是，含外源基因的質(zhì)粒可在農(nóng)桿菌內(nèi)自主復(fù)制并保留下來。農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，植物的創(chuàng)傷信號(hào)啟動(dòng)Ti質(zhì)粒上的Vir基因，隨后將穿梭質(zhì)粒的T-DNA切割下來，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。,典型的桿

50、狀病毒表達(dá)系統(tǒng),典型的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是利用大腸桿菌中位點(diǎn)特異的轉(zhuǎn)座或昆蟲細(xì)胞中的同源重組來產(chǎn)生重組桿狀病毒。這些過程要求大量的操作時(shí)間，周期長(zhǎng)達(dá)幾周。BaculoDirect 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)化了這些過程，節(jié)省了大量時(shí)間，使你可以比以往任何時(shí)候更快地獲得桿狀病毒表達(dá)結(jié)果。,BaculoDirect系統(tǒng)利用快速、簡(jiǎn)便的Gateway技術(shù)。BaculoDirect線性DNA包含了attR位點(diǎn)，允許與包含有目的基因的Gateway入門克隆進(jìn)行有效的重組。將entry克隆、BaculoDirect線性DNA和Gateway LR Clonase酶混合物稍加混勻，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)即可。最終的反應(yīng)混

51、和物中包含有攜帶目的基因的桿狀病毒，可以直接用于轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞（sf9或sf21）。,SV40病毒作為載體,反轉(zhuǎn)錄病毒,反轉(zhuǎn)錄病毒載體是常用的病毒載體之一。 反轉(zhuǎn)錄病毒的DNA基因組的兩端各有一個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列(5LTR和3LTR)，有一個(gè)包裝病毒顆粒時(shí)必需的非編碼序列+，同時(shí)有三個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因gag、pol和env。 反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以容納外源DNA的長(zhǎng)度在10 kb左右，以很高的轉(zhuǎn)染率感染宿主細(xì)胞，特別是分裂中的細(xì)胞。轉(zhuǎn)入宿主的細(xì)胞后，反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨即整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，這種整合的位點(diǎn)是隨機(jī)的。,反轉(zhuǎn)錄病毒載體在構(gòu)建時(shí)，刪去了poi、env基因和gag基因的3端，但保留了病毒顆粒所

52、需的+序列。其目的是在于提高載體的安全性，防止反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后進(jìn)行增殖并包裝成病毒顆粒對(duì)宿主細(xì)胞造成可能的傷害。這樣，在制備反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，就必須有一個(gè)輔助細(xì)胞系，這種細(xì)胞內(nèi)有缺陷型病毒可以提供包裝用的外殼蛋白，但自身沒有包裝信號(hào)。這樣，反轉(zhuǎn)錄病毒載體就可利用這些外殼蛋白包裝成病毒顆粒在輔助細(xì)胞系內(nèi)大量擴(kuò)增。 反轉(zhuǎn)錄病載體多半用于基因治療，由于病毒載體在宿主細(xì)胞基因組上隨機(jī)插入，人們擔(dān)心會(huì)引起不安全的后果，這種載體還在不斷改進(jìn)之中。,YAC 人工染色體載體,是利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中。 釀

53、酒酵母的形態(tài)為扁圓形和卵形，生長(zhǎng)的代時(shí)為 90 分鐘；含 16 條染色體，其大小為 225-1900kb ，總計(jì)有14106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。,人造染色體載體,酵母人造染色體（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,YAC載體應(yīng)含有下列元件：,酵母染色體的端粒序列,酵母人造染色體的構(gòu)建：,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色體的復(fù)制子,酵母染色體的中心粒序列,酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記,大腸桿菌的復(fù)制子,大腸桿菌的選擇標(biāo)記,YAC載體的裝載量為350 - 400 kb,人造染色體載體,酵母人造染色體（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,酵母人造染色體的使用：,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,連接,轉(zhuǎn)化酵母菌,重組酵母染色體,pYAC4 ：當(dāng)用 BamH 切割成線狀后，就形成了一個(gè)微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元件，如自主復(fù)制