《方藥設(shè)計毒理研究》PPT課件.ppt

1、藥物毒理研究,周玖瑤 2010,12,近半個世紀(jì)國外發(fā)生的重大要害事件 年代 藥物 毒性表現(xiàn) 受害人數(shù) 53 非那西丁 腎損害、溶血 2000人，死亡500人 56 三苯乙醇 白內(nèi)障、陽痿、 1000人，死亡占% 56 反應(yīng)停 海豹樣畸胎 1萬人，死亡5千人 67 氨苯唑啉 肺動脈高壓 70%用藥者 60 異丙腎氣霧劑 心律失常、心衰 死亡3500人 63 氯碘喹啉 脊髓變性、失明 7856人，死5% 33 已烯雌酚 下代陰道腺癌 300人 68 心得寧 角膜、心包、腹膜損害 2257人,藥物不良反應(yīng)的發(fā)展史,國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心發(fā)布藥品不良反應(yīng)信息通報,乙雙嗎啉白血病 壯骨關(guān)節(jié)炎肝損害

2、清開靈注射液過敏反應(yīng) 雙黃連注射液過敏反應(yīng) 苯甲醇兒童臂攣縮癥,近期從美國市場上撤出的處方藥（1）,近期從美國市場上撤出的處方藥（2）,中藥需進行系統(tǒng)毒理學(xué)研究, 長期用藥安全性了解較少 長期用藥之安全性了解較少 “無毒”中藥長期給藥可致器質(zhì)性損害 新生兒溶血癥/禁用黃連事件；小 柴胡湯/間質(zhì)性肺炎,“替代”用中藥 木通/關(guān)木通；粉防己/廣防己；馬兜鈴酸、馬兜鈴酰胺所致急性腎衰. 德國聯(lián)邦藥品和醫(yī)療用品局96年6月限制使用番瀉、鼠李皮、大黃、蘆薈等含蒽醌類中藥. 一、二類中藥/有效成份、部位、活性成分濃縮/藥效、毒性增強.,1. 臨床前毒理學(xué)研究 藥品臨床前毒理學(xué)研究的重要性 通過受試藥的毒理

3、學(xué)試驗，確定受試藥的劑量與毒性作用的相關(guān)性以及藥物的安全劑量范圍；,安全性研究的重要性和局限性, 認識藥物毒性作用的靶器官和靶組織，以確定藥物毒性作用的選擇性； 觀察藥物毒性作用的發(fā)生、臨床特征及發(fā)展過程是否可逆，以判斷藥物毒性的性質(zhì)。 這些研究結(jié)果是預(yù)測藥品臨床應(yīng)用安全性的重要依據(jù)。,例: 50年代中期，法國上市外用藥二碘二乙基錫，因動物毒性研究不充分，缺乏初期臨床安全性評價，藥品倉促上市應(yīng)用造成207例中毒，110人死亡，再次提醒人們認識新藥研究中臨床前毒理學(xué)研究的重要性。,藥品臨床前毒理學(xué)研究的局限性 人體臨床用藥的不良反應(yīng)和藥品動物毒性研究的相關(guān)率不及25%。,實施GLP是提高藥品毒理

4、學(xué)研究質(zhì)量的重要保證。, 實驗動物缺乏人所具有的對藥物毒性作用的主覺反應(yīng)； 毒理試驗動物數(shù)量有限，發(fā)生率低的毒性反應(yīng)，難以經(jīng)小樣本實驗得以發(fā)現(xiàn)； 所用動物均系實驗室培養(yǎng)品系，且多為健康動物，對藥物的反應(yīng)性多較單一。 人體的疾病因素，可能影響人體對藥物的反應(yīng)性，以致產(chǎn)生在臨床前毒性試驗中難以觀察到的毒性現(xiàn)象。 人與實驗動物在藥物代謝動力學(xué)方面的差異，亦會造成人與實驗動物對藥物毒性反應(yīng)的差異。,藥品臨床前毒理學(xué)研究局限性的原因：,2.上市前藥品臨床安全性評價存在局限性的原因,2) 上市前臨床試驗療程一般較短，觀察期亦較短。一些需經(jīng)較長時間應(yīng)用才能發(fā)生的反應(yīng)，或停藥后的滯后不良反應(yīng)，難以在臨床試驗期

5、間被觀察到；,1) 上市前藥品臨床試驗病例數(shù)相對較少，一些低頻度不良反應(yīng)，很難在此期間被發(fā)現(xiàn)；,3) II期和III期臨床試驗，受入選條件的限制（入選病例年齡、合并癥均有限制） ，不可能觀察到受試藥品對特殊人群的毒性作用；,4) 對照性臨床試驗的觀測指標(biāo)只限于實驗設(shè)計規(guī)定的內(nèi)容，觀察臨床反應(yīng)，可能被疏漏，導(dǎo)致臨床評價的片面性。,5) 不可能認識偶見不良反應(yīng)（0.1-1%） 和罕見不良反應(yīng)（0.01%）,我國1979年頒布“藥政管理法” 1985年頒布“新藥審批法” 1999年SDA頒布GLP及GCP 2001.12 頒布“藥品管理法”,加強藥政管理,藥物急性毒性研究,概述,急性毒性是指動物一次

6、或24小時內(nèi)多次接受一定劑量的受試物，動物在短期內(nèi)出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。 急性毒性目的:為新藥的研發(fā)提供參考信息。,二、急性毒性試驗的基本原則：,（一）試驗管理 急性毒性試驗必須執(zhí)行“藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（GLP）”。 （二）試驗設(shè)計 試驗設(shè)計應(yīng)符合隨機、對照、重復(fù)的基本原則。,三、急性毒性試驗的基本內(nèi)容,（一）受試物 急性毒性研究的受試物應(yīng)能充分代表臨床試驗受試物和上市藥品，因此建議受試物采用制備工藝穩(wěn)定、符合臨床試用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的中試樣品，并注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等。如不采用中試樣品，應(yīng)有充分的理由。如果由于給藥容積或給藥方法限制，可采用原料藥（提

7、取物）進行試驗。 溶媒或賦形劑：選擇合適的溶媒或賦形劑。,（二）實驗動物 一般應(yīng)采用哺乳動物，雌雄各半。如臨床為單性別用藥，則可采用相對應(yīng)的單一性別的動物。大、小鼠為常用的實驗動物，其他動物也可使用，當(dāng)采用非嚙齒類動物更適合進行研究時，盡可能采用非嚙齒類動物。嚙齒類動物應(yīng)符合國家實驗動物標(biāo)準(zhǔn)級及其以上等級要求，非嚙齒類動物應(yīng)符合國家實驗動物標(biāo)準(zhǔn)級及其以上等級要求。 通常采用健康成年動物進行試驗。如果受試物擬用于兒童，建議考慮采用幼年動物。動物初始劑量不應(yīng)超過或低于平均體重的20,（三）試驗分組 除設(shè)受試物合適的劑量組外，還應(yīng)設(shè)空白（和或陰性）對照組。 （四）給藥途徑 給藥途徑不同，受試物的吸收

8、率、吸收速度和暴露量會有所不同，為了盡可能觀察到動物的急性毒性反應(yīng)，可采用多種給藥途徑進行急性毒性試驗研究。給藥途徑一般采用兩種給藥途徑，其中一種應(yīng)與擬臨床給藥途徑一致，如不采用擬臨床途徑給藥，必須充分說明理由。灌胃給藥時應(yīng)空腹。,（五）給藥容量： 灌胃給藥，大鼠給藥容積每次一般不超過20ml/kg，小鼠每次一般不超過40ml/kg；其他動物及給藥途徑的給藥容量可參考相關(guān)文獻及根據(jù)實際情況決定。 （六）觀察期限： 一般為714天，如果毒性反應(yīng)出現(xiàn)較慢應(yīng)適當(dāng)延長觀察時間，如觀察時間不足7天，應(yīng)充分說明理由。 一般應(yīng)詳細觀察給藥后4小時內(nèi)動物的反應(yīng)情況，然后每天上、下午各觀察一次。,（七）觀察指標(biāo)

9、： 包括動物體重變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物等。 記錄所有動物的死亡情況、中毒癥狀及中毒反應(yīng)的起始時間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時間、是否可逆等。 對瀕死及死亡動物應(yīng)及時進行大體解剖，其他動物在觀察期結(jié)束后進行大體解剖，當(dāng)發(fā)現(xiàn)器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時，則對改變的器官進行組織病理學(xué)檢查。,（八）結(jié)果處理和分析 1、根據(jù)所觀察到的各種反應(yīng)出現(xiàn)的時間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時間等，分析各種反應(yīng)在不同劑量時的發(fā)生率、嚴(yán)重程度。根據(jù)觀察結(jié)果歸納分析，判斷每種反應(yīng)的量效關(guān)系及隨時間的變化。 2、判斷出現(xiàn)的各種反應(yīng)可能涉及的器官、組織或系統(tǒng)等。 3、根據(jù)大體解剖中肉眼可見的病變和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果，初步判

10、斷可能的毒性靶器官。組織病理學(xué)檢查應(yīng)附有病理學(xué)檢查負責(zé)人簽字的報告及有病變組織的病理照片。,4、根據(jù)不同劑量組各種反應(yīng)的發(fā)生率、動物死亡情況等，判斷動物對受試物的耐受性、最大無反應(yīng)劑量、最小毒性反應(yīng)劑量、最大耐受劑量、最小致死劑量等，初步判斷藥物的安全范圍。 5、說明所使用的計算方法和統(tǒng)計學(xué)方法，提供所選用方法合理性的依據(jù)。 6、應(yīng)根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，提示在其他安全性試驗、臨床試驗、質(zhì)量控制方面應(yīng)注意的問題，同時，結(jié)合其他安全性試驗、有效性試驗及質(zhì)量可控性試驗結(jié)果，權(quán)衡利弊，分析受試物的開發(fā)前景。,急毒試驗的一般研究方法,致死量法： 藥物毒性的大小，可用動物的致死量（Lethal dose）

11、來表示，因為動物生與死的生理指標(biāo)較其他指標(biāo)明顯、客觀、容易掌握。在測定致死量的同時，還應(yīng)仔細觀察動物死亡前的中毒反應(yīng)情況。 致死量的測定主要包括最小致死量（LD5）、半數(shù)致死量（LD50）和最大致死量（LD95）。由于LD50的測定較簡便，故致死量的測定一般采用LD50。,最大耐受量試驗： 最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）是指動物能夠耐受的而不引起動物死亡的最高劑量。從獲取安全性信息的角度考慮，有時對實驗動物的異常反應(yīng)和病理過程的觀察、分析，較以死亡為觀察指標(biāo)更有毒理學(xué)意義。,最大給藥量試驗： 最大給藥量指單次或24小時內(nèi)多次（2-3次）給藥所采用的最大給藥

12、劑量。最大給藥量試驗是在合理的給藥濃度及合理的給藥容量的條件下，以允許的最大劑量給予實驗動物，觀察動物出現(xiàn)的反應(yīng)。有許多中藥、天然藥物毒性較低，如單次給藥量遠遠大于藥效學(xué)試驗等效劑量時，可不必進行更大劑量的觀察。,其他方法 固定劑量法（Fixed-dose procedure） 劑量累積試驗法 近似致死劑量法 (Approximate Lethal Dose ALD) 擴展試驗法 劑量探測試驗法,固定劑量法（Fixed-dose procedure）：1984年由英國毒理學(xué)會提出，不以死亡而是以明顯的毒性體征作為觀察終點進行評價。 試驗選擇5、50、500和2000mg/kg四個固定劑量進行實

13、驗，特殊情況下可增加5000 mg/kg劑量。實驗動物首選大鼠，給藥前禁食6-12小時，給受試物后再禁食3-4小時。采用一次給藥的方式進行。如無資料證明雄性動物對受藥試物更敏感，首先用雌性動物進行預(yù)試。,固定劑量法（Fixed-dose procedure）,1) 首先用雌性動物進行預(yù)試。,（有毒性）,（有毒性）,每個劑量給一只動物，預(yù)試一般不超過5只動物。每個劑量試驗之間至少應(yīng)間隔24小時。給受試物后的觀察期至少7天，如動物的毒性反應(yīng)到第7天仍然存在，尚應(yīng)繼續(xù)觀察7天。,2）正式試驗 動物：每個劑量至少用10只動物，雌雄各半。 劑量：根據(jù)預(yù)試的結(jié)果，選擇一個可能產(chǎn)生明顯毒性但又不引起死亡的劑

14、量進行試驗。 周期：給藥后至少應(yīng)觀察2周，根據(jù)具體特點可適當(dāng)延長。 觀察指標(biāo)：觀察記錄內(nèi)容包括：體重、皮膚、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循環(huán)、自主活動及中樞神經(jīng)系統(tǒng)行為表現(xiàn)等。毒性反應(yīng)出現(xiàn)和消失的時間，準(zhǔn)確的動物死亡時間。所有動物（死亡或處死的動物）均應(yīng)進行尸檢，尸檢異常的器官應(yīng)作病理組織學(xué)檢查。仔細觀察和詳細記錄。 給藥當(dāng)天至少應(yīng)觀察記錄兩次，以后可每天一次。試驗結(jié)果參考下表標(biāo)準(zhǔn)進行評價。,固定劑量法試驗結(jié)果的評價,劑量累積法（金字塔法，Pyramiding dosage design） 動物：8只非嚙齒類動物，對照和給藥組各4只，雌雄各2。 劑量：劑量的設(shè)計通常是1、3、10、30、100、3

15、00、1000、3000 mg/kg，或10、20、40、80、160、320、640、1280 mg/kg，通常隔日給予下一個高劑量，劑量逐漸加大，直到出現(xiàn)動物死亡時或達到劑量上限時止。 判斷標(biāo)準(zhǔn)：沒有動物死亡時，最高劑量或限制劑量小于MLD和LD50；某一劑量所有動物均出現(xiàn)死亡時，MLD和LD50應(yīng)在最后兩個劑量之間；當(dāng)二個劑量均出現(xiàn)部分動物死亡，MLD位于首次出現(xiàn)死亡的劑量和前一低劑量之間，LD50則應(yīng)在首次出現(xiàn)動物死亡的劑量和所有動物均死亡的劑量之間；假如沒有動物死亡發(fā)生，常常以最高劑量給予動物5-7天，以確定后續(xù)的重復(fù)給藥實驗中高劑量的選擇。,近似致死劑量法 (Approximate

16、 Lethal Dose ALD),1）實驗動物：6只健康Beagle犬（4-6月齡）或猴（2-3歲），選用其他物種的動物時應(yīng)說明理由。,2）試驗過程： 估計毒性范圍：根據(jù)小動物的毒性試驗結(jié)果和有關(guān)資料，估計可能引起毒性和死亡的劑量范圍。 設(shè)計劑量序列表：按50%遞增法，設(shè)計出數(shù)個序列劑量。估計出可能致死劑量范圍。 近似致死劑量范圍：每間隔一個劑量給一只動物，測出最低致死劑量和最高非致死劑量；然后用二者之間的劑量給一只動物，如果該劑量下動物未發(fā)生死亡，則該劑量與最低致死劑量之間的范圍為近似致死劑量范圍。如果該劑量下動物死亡，則該劑量與最高非致死劑量間的范圍為近似致死劑量范圍。,50mg/kg

17、75mg/kg 113mg/kg 169mg/kg 253mg/kg 380mg/kg,最高非致死量,最低致死量,近似致死 量范圍,死亡,存活,死亡,存活,近似致死 量范圍,113169mg/kg,169253mg/kg,近似致死劑量范圍測定過程,劑量序列,上下法（階梯法，序貫法，Up and Down Method）,Dixon和Mood首次提出，1985年Bruce改進， OECD和EPA推薦方法之一。特點：節(jié)省動物；可觀察毒性表現(xiàn)和估算LD50及其可信限；適合動物快速死亡藥物。,1）限度實驗 用于受試物可能沒有毒性的情況。試驗劑量為2000 mg/kg，特殊情況下也可使用5000 mg/

18、kg。,2000mg/kg （1只）,存活,主試驗,死亡,2000mg/kg （4只）,3或3只以 上死亡,LD50 2000mg/kg,3或3只以 上存活,LD50 2000mg/kg,主試驗,觀察 14天,結(jié)束試驗,5000mg/kg （1只）,存活,主試驗,死亡,3或3只以 上死亡,LD50 5000mg/kg,3或3只以 上存活,LD50 5000mg/kg,主試驗,5000mg/kg （2只）,存活,LD50 5000mg/kg,有死亡,5000mg/kg （1只）,5000mg/kg （1只）,結(jié)束試驗,結(jié)束試驗,觀察 14天,觀察 14天,2）主試驗:,每次給藥1只動物，間隔至少

19、48小時。劑量序列選擇： 1.75、5.5、17.5、55.3、175、553、1750 mg/kg（R3.16) 在得到致死量范圍后，以R=1.2劑量序列進行試驗，如： 52.5175 則 50、60、72、86.4、104、124、149、179,低于LD50估 計值（1只）,存活,死亡,高1級劑量,低1級劑量,死亡,存活,低1級劑量,死亡,結(jié)束試驗,存活,高1級劑量,結(jié)束試驗,序貫法軟件下載：/oppfead1/harmonization /,不同注冊類別新藥急性毒性試驗的一般要求,1中藥、天然藥物 1）中藥1-5類：其物質(zhì)基礎(chǔ)較傳統(tǒng)中藥發(fā)生了明顯改變或

20、較少應(yīng)用經(jīng)驗，一般采用兩種途徑和兩種動物（嚙齒類和非嚙齒類）給藥。 2）臨床為非靜脈給藥：則增加用靜脈給藥方式，以便全面暴露受試物的毒性反應(yīng)。如果因為制劑（口服）等原因不能采用靜脈給藥，應(yīng)充分說明理由，此時可采用另一種給藥途徑或僅采用一種擬臨床給藥途徑進行毒性反應(yīng)的觀察。 3）中藥6類（復(fù)方制劑）：如處方組成符合中醫(yī)藥理論，有一定的臨床應(yīng)用經(jīng)驗，可僅采用一種動物，按擬臨床給藥途徑進行；如復(fù)方制劑為天然藥物復(fù)方制劑，應(yīng)采用兩種實驗動物（嚙齒類和非嚙類），按擬臨床給藥途徑進行給藥；如處方中含有天然藥物、有效成份或化學(xué)藥品，則應(yīng)對上述藥用物質(zhì)進行急性毒性的相互作用研究。 4）中藥7類（改變上市藥品給

21、藥途徑，不包括非注射劑改為注射劑）：可用一種動物，比較改變前后兩種不同給藥途徑的毒性反應(yīng)。 5）中藥8類（改變上市藥品劑型或工藝但不改變給藥途徑）：如制備工藝有質(zhì)的改變，建議采用一種動物，按擬臨床給藥途徑進行急性毒性的觀察。 6）中藥9類（增加新適應(yīng)癥或功能主治的品種）： 一般不需進行急性毒性研究。,2化學(xué)藥品 1）西藥1-2類（國內(nèi)外未上市的藥品和新給藥途徑制劑）：一般采用兩種途徑和兩種動物（嚙齒類和非嚙齒類）給藥。如只有靜脈注射制劑，只需一種靜脈給藥途徑。復(fù)方藥物需進行急性毒性拆方分析。 2）西藥3類（尚未在國內(nèi)上市藥品）：提供資料。 3）西藥4類（改變酸根、堿基，不改變其藥理作用的原料藥

22、及其制劑）：如已在國外內(nèi)上市，只需提供資料。,藥物長期毒性研究,概述,長期毒性研究（重復(fù)給藥毒性研究） 是反復(fù)多次給藥的毒性試驗的總稱，描述動物重復(fù)給予受試物后的毒性特征，它是非臨床安全性評價的重要內(nèi)容。,長期毒性研究的主要目的,發(fā)現(xiàn)受試物可能引起的臨床不良反應(yīng)，包括不良反應(yīng)的性質(zhì)、程度、量效和時效關(guān)系、可逆性等； 推測受試物重復(fù)給藥的臨床毒性靶器官或靶組織； 預(yù)測臨床試驗的起始劑量和重復(fù)用藥的安全范圍； 提示臨床試驗中需重點監(jiān)測的安全性指標(biāo)； 對毒性作用強、毒性癥狀發(fā)生迅速、安全范圍小的受試物，長期毒性研究還可以為臨床試驗中的解毒或解救措施提供參考信息。,中藥在我國已有幾千年的應(yīng)用歷史，有豐

23、富的臨床應(yīng)用經(jīng)驗，相對化學(xué)藥而言多數(shù)中藥具有毒性低的特點。 但是，中藥的低毒和無毒是相對的。當(dāng)前，各種新技術(shù)、新工藝不斷應(yīng)用于中藥新藥的開發(fā)，而且從中藥、天然藥物中提取的有效成分、有效部位及其制劑日益增多，實際上很多中藥、天然藥物新藥已不同于傳統(tǒng)意義上的中藥，因此對其臨床前安全性評價應(yīng)給予足夠的重視。,長期毒性研究試驗周期長，耗資高，工作量大，若因試驗設(shè)計不合理，或所進行的試驗未充分揭示中藥的毒性特征，則會造成人力、物力、財力的浪費，也會影響新藥的研究速度。 充分認識長期毒性研究的重要性，合理、科學(xué)地進行長期毒性研究試驗設(shè)計，對試驗結(jié)果進行科學(xué)的分析，是新藥非臨床安全性評價的基本要求。,指導(dǎo)原

24、則是根據(jù)中藥、天然藥物的特點，結(jié)合國際上藥物安全性評價的要求和我國藥物安全性評價研究現(xiàn)狀而制訂的。 技術(shù)指導(dǎo)原則適用于中藥、天然藥物新藥長期毒性研究。 指導(dǎo)原則為長期毒性研究的一般性原則，僅代表目前對長期毒性研究的基本認識。,中藥、天然藥物的新藥研究情況復(fù)雜，本指導(dǎo)原則尚不能涵蓋中藥、天然藥物長期毒性研究的全部內(nèi)容，在進行長期毒性研究時，應(yīng)遵循“具體問題具體分析”的原則。,二、長期毒性研究的一般原則,(1)長性毒性研究應(yīng)遵循“具體問題具體分析”的原則。 (2)長期毒性研究的試驗設(shè)計應(yīng)符合隨機、對照、重復(fù)的原則。 藥物的開發(fā)是一個連續(xù)的、漸進的系統(tǒng)工程，長期毒性研究是藥物開發(fā)的一個有機組成部分。

25、長期毒性研究不能與其它藥理學(xué)、藥代動力學(xué)和其它毒理學(xué)研究割裂，試驗設(shè)計應(yīng)充分考慮其它藥理毒理研究的試驗設(shè)計和研究結(jié)果。 長期毒性研究的結(jié)果應(yīng)該力求與其它藥理毒理研究結(jié)果互為印證、說明和補充。,三、長期毒性研究的基本內(nèi)容,（一）試驗管理 長期毒性研究必須執(zhí)行藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（GLP）。,（二）受試物 長期毒性研究的受試物應(yīng)能充分代表臨床試驗受試物和上市藥品 因此受試物應(yīng)采用制備工藝穩(wěn)定、符合臨床試用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的樣品，一般用中試樣品，并注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等。如不采用中試樣品，應(yīng)有充分的理由。 如果由于給藥容積或給藥方法限制，可采用原料藥（提

26、取物）進行試驗。試驗中所用溶媒或賦形劑應(yīng)標(biāo)明批號、規(guī)格及生產(chǎn)廠家。,（三）試驗動物 長期毒性研究一般需采用兩種動物進行 一種為嚙齒類，常用大鼠:大鼠應(yīng)符合國家實驗動物標(biāo)準(zhǔn)II級及其以上等級要求 一種為非嚙齒類，常用Beagle犬或猴: 非嚙齒類動物應(yīng)符合國家實驗動物標(biāo)準(zhǔn)I級及其以上等級要求。,長期毒性研究一般選擇健康、體重均一的動物，雌性應(yīng)未孕。 所選用的動物種屬應(yīng)盡可能與藥效學(xué)研究所用的動物相一致。必要時，也可選用疾病模型動物進行試驗。 原則上，動物應(yīng)雌雄各半。當(dāng)臨床擬用于單性別時，可采用相應(yīng)性別的動物。,應(yīng)根據(jù)研究期限的長短和受試物的使用人群范圍確定動物的年齡。一般情況下，大鼠為4-9周齡

27、；Beagle犬為6-9月齡，不宜超過12月齡。 每組動物的數(shù)量應(yīng)能夠滿足試驗結(jié)果的分析和評價的需要。 一般大鼠可為雌、雄各10-30只 犬或者猴可為雌、雄各3-6只。若試驗中期要處死動物，應(yīng)相應(yīng)地增加動物數(shù)。,（四）給藥途徑 原則上應(yīng)與臨床擬用藥途徑相同。 口服給藥者一般采用灌胃給藥 臨床用藥為靜脈注射時，若由于給藥周期長，大鼠靜脈注射有困難時，可用其它適宜的注射途徑代替。 如選擇其它的給藥途徑，應(yīng)說明理由。,（五）給藥頻率 原則上應(yīng)每天給藥，每天給藥時間應(yīng)相同。 試驗周期長（3個月或以上）者，也可采取每周給藥6天。 特殊類型的受試物由于其毒性特點和臨床給藥方案等原因，應(yīng)根據(jù)具體藥物的特點設(shè)

28、計給藥頻率。,（六）給藥期限 長期毒性研究給藥期限的長短，通常與擬定的臨床療程長短、臨床適應(yīng)癥、用藥人群相關(guān)，應(yīng)充分考慮預(yù)期臨床的實際療程。 給藥期限為1個月的長期毒性研究通?？芍С峙R床療程不超過2周的藥物進行臨床試驗。,臨床療程超過2周的藥物，可以在臨床前一次性進行支持藥物進行III期臨床試驗（生產(chǎn)）的長期毒性研究。 在這種情況下，如長期毒性研究擬定給藥期限在三個月以上，可先對三個月完整的階段性研究資料進行評價。但在進行III期臨床試驗前，必須完成全程長期毒性試驗研究資料。,臨床療程超過2周的藥物，也可以根據(jù)具體情況，以不同給藥期限的長期毒性研究來分別支持藥物進入I期、II期或III期臨床試

29、驗（生產(chǎn)）。 通過給藥期限較短的毒性研究獲得的信息，可以為給藥期限較長的毒性研究設(shè)計提供給藥劑量、給藥頻率、檢測指標(biāo)等方面的參考； 臨床試驗中獲得的信息有助于給藥期限較長的動物毒性研究方案的設(shè)計，有利于降低藥物開發(fā)的風(fēng)險。,一般藥物的長期毒性研究給藥期限參考,注：表中長期毒性研究給藥期限不包括恢復(fù)期。應(yīng)根據(jù)具體情況設(shè)計不同的恢復(fù)期。*此處是指臨床療程超過2周的藥物，可用一個月的長期毒性試驗來支持藥物進行I期臨床試驗。,以不同給藥期限的長期毒性研究來分別支持藥物進入I期、II期或III期臨床試驗（生產(chǎn)）時，不同給藥期限的長期毒性研究的內(nèi)容不應(yīng)簡化。 無論采用何種模式，長期毒性研究的內(nèi)容應(yīng)完整、規(guī)

30、范，對結(jié)果的分析評價應(yīng)科學(xué)、合理。 當(dāng)某一藥物預(yù)期長期使用，或用于復(fù)發(fā)性疾病而需經(jīng)常反復(fù)給藥時，應(yīng)進行最長試驗期限的長期毒性研究。 當(dāng)功能主治有若干項的，應(yīng)按照臨床最長療程的功能主治來確定長期毒性研究的給藥期限。,如臨床給藥需采用多個療程，療程之間間隔時間不足以使受試物可能對機體組織器官造成的損害恢復(fù)，則需按多個療程的時間之和作為參照的臨床療程； 如療程間隔時間基本可判斷足以使受試物可能對機體組織器官造成的損害恢復(fù)，則可按單個療程的時間作為參照的臨床療程。,（七）給藥劑量-設(shè)計的一般原則 一般情況下，至少應(yīng)設(shè)3個劑量組和對照組（賦形劑或和空白對照組）。 低劑量組原則上應(yīng)高于同種動物藥效學(xué)試驗的

31、有效劑量或預(yù)期的臨床治療劑量的等效劑量。 高劑量組原則上應(yīng)使動物產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)，甚至可引起少量動物死亡（對于毒性較小的中藥，可盡量采用最大給藥量）。 在高、低劑量之間至少應(yīng)再設(shè)一個中劑量組。,應(yīng)根據(jù)實際情況進行合理的劑量設(shè)計，如出現(xiàn)未預(yù)期的毒性反應(yīng)或不出現(xiàn)毒性反應(yīng)時，可在設(shè)計更長時間的長期毒性研究時適當(dāng)調(diào)整劑量。 若受試物在飲食或飲水中給予時，應(yīng)能充分保證受試物的均一性、穩(wěn)定性和定量攝入，提供相關(guān)的檢測報告，并應(yīng)根據(jù)動物生長和體重的變化情況而調(diào)整在飲食或水中的劑量。 局部給藥時，應(yīng)盡可能保證給藥劑量的準(zhǔn)確性及與局部充分接觸的時間。,（八）觀察指標(biāo) 原則上，除常規(guī)觀察指標(biāo)外，還應(yīng)根據(jù)受試物的

32、特點、在其他試驗中已觀察到的某些改變，或其他的相關(guān)信息（如方中組成成分有關(guān)毒性的文獻），增加相應(yīng)的觀測指標(biāo)。,常規(guī)需觀察的指標(biāo) 1、一般狀況觀察 在試驗期間，應(yīng)觀察動物外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、糞便、攝食量、體重、給藥局部反應(yīng)。,2、血液學(xué)指標(biāo) 一般血液學(xué)檢測指標(biāo)。至少應(yīng)觀察紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、白細胞計數(shù)及其分類、血小板、凝血時間等。當(dāng)發(fā)現(xiàn)對造血系統(tǒng)有影響時，應(yīng)進一步進行網(wǎng)織紅細胞計數(shù)、骨髓的檢查。,3、血液生化學(xué)指標(biāo) 一般血液生化學(xué)檢測指標(biāo) 4、體溫、眼科檢查、尿液檢查、心電圖檢查 非嚙齒類動物還應(yīng)進行體溫、眼科檢查、尿液檢查、心電圖檢查等。尿液檢查指標(biāo),5、系統(tǒng)尸解和組織病理學(xué)

33、檢查 51 系統(tǒng)尸解 應(yīng)對所有動物進行尸解，尸解應(yīng)全面細致，為組織病理學(xué)檢查提供參考。 52 臟器系數(shù) 應(yīng)對臟器進行稱重，并計算臟器系數(shù)。,53組織病理學(xué)檢查 當(dāng)所用動物為非嚙齒類動物時，因動物數(shù)較少，應(yīng)對所有劑量組、所有動物的器官和組織進行病理組織學(xué)檢查。 當(dāng)所用動物為嚙齒類動物時，應(yīng)對高劑量組和對照組的器官和組織進行病理學(xué)檢查，如果高劑量組出現(xiàn)組織病理學(xué)變化時，更低劑量組也應(yīng)進行病理組織學(xué)檢查以確定劑量-毒性關(guān)系。 若在尸檢時發(fā)現(xiàn)器官和組織有肉眼可見的病理變化時，應(yīng)對此臟器或組織進行詳細的病理組織學(xué)檢查。 有效成分或有效部位制成的制劑所需檢查的臟器和組織參考。,若為一般的中藥復(fù)方制劑，所檢

34、查的臟器和組織可減少為： 心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、腦垂體、脊髓、胸骨（骨和骨髓）、淋巴結(jié)、膀胱、視神經(jīng)、睪丸（含附睪）、子宮、卵巢、胸腺、腎上腺、甲狀腺、前列腺及給藥局部組織等。,應(yīng)注意臟器和組織的取材保存，如在高劑量組發(fā)現(xiàn)有異常病變時，則可對取材保存的更低劑量組的臟器、組織時進行檢查。 必要時還應(yīng)增加其他器官組織的檢查。 另外，根據(jù)所含中藥的性、味、功效、主治等不同情況，可能需增加相應(yīng)的病理組織學(xué)檢查； 根據(jù)受試物特性和初步試驗結(jié)果，可能需要進行更進一步的組織病理學(xué)檢查，這均遵循具體情況具體分析的原則。,（九）觀察指標(biāo)的時間和次數(shù) 應(yīng)根據(jù)試驗期限的長短和受試物的特點

35、而確定試驗期間觀察指標(biāo)的時間和次數(shù)，原則上應(yīng)盡早、及時發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。,試驗前，嚙齒類動物至少應(yīng)進行適應(yīng)性觀察3-5天，非嚙齒類至少應(yīng)馴養(yǎng)觀察1-2周，應(yīng)對試驗動物進行外觀體征、行為活動、攝食量和體重檢查，非嚙齒類動物還至少應(yīng)進行2次體溫、心電圖、有關(guān)血液學(xué)和血液生化學(xué)指標(biāo)的檢測。 試驗動物相關(guān)指標(biāo)的歷史數(shù)據(jù)在長期毒性研究中也具有非常重要的意義。,試驗期間，一般狀況和癥狀的觀察，應(yīng)每天觀察一次，飼料消耗和體重應(yīng)每周記錄一次。 大鼠體重應(yīng)雌雄分開進行計算。 試驗結(jié)束時應(yīng)進行一次全面的檢測。 當(dāng)給藥期限較長時，應(yīng)根據(jù)受試物的特點選擇合適的時間進行中期階段性的檢測。,長期毒性研究應(yīng)在給藥結(jié)束留存

36、部分動物進行恢復(fù)期觀察，以了解毒性反應(yīng)的可逆程度和可能出現(xiàn)的延遲性毒性反應(yīng)。 應(yīng)根據(jù)受試物的代謝動力學(xué)特點、靶器官或靶組織的毒性反應(yīng)和恢復(fù)期確定恢復(fù)期的長短。 恢復(fù)期觀察期間除不給受試物外，其他觀察內(nèi)容與給藥期間相同。 在試驗期間，對瀕死或死亡動物應(yīng)及時檢查并分析原因。,（十）結(jié)果及分析 試驗報告應(yīng)全面客觀反映整個試驗過程收集的原始資料和信息，應(yīng)詳細描述毒性的主要表現(xiàn)、大體解剖檢查和/或病理組織學(xué)檢查結(jié)果等，并說明數(shù)據(jù)處理的統(tǒng)計學(xué)方法，如用計算機處理數(shù)據(jù)，應(yīng)指出所用程序名稱。結(jié)果應(yīng)以清楚、準(zhǔn)確的方式來表示。,長期毒性研究的最終目的在于預(yù)測人體可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。 只有通過對研究結(jié)果的科學(xué)分析和

37、評價才能夠清楚描述動物的毒性反應(yīng)，并推測其與人體的相關(guān)性，因此長期毒性研究結(jié)果的分析和評價是長期毒性研究的必要組成部分。 分析長期毒性研究結(jié)果的目的是判斷動物是否發(fā)生毒性反應(yīng)，描述毒性反應(yīng)的性質(zhì)和程度（包括毒性發(fā)作時間、程度、持續(xù)時間以及可逆性等）和靶器官，確定安全范圍，并探討可能的毒性作用機制。,應(yīng)重視對動物中毒或死亡原因的分析，注意觀察毒性反應(yīng)出現(xiàn)的時間和恢復(fù)的時間及動物的死亡時間。 應(yīng)對所獲取的數(shù)據(jù)進行全面和科學(xué)的分析，對在正常范圍以外的各實測值應(yīng)在試驗結(jié)果中詳細列出，對異常數(shù)據(jù)予以合理的分析。 在分析長期毒性研究結(jié)果時，應(yīng)正確理解均值數(shù)據(jù)和單個數(shù)據(jù)的意義，綜合考慮數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)意義和生物

38、學(xué)意義。,正確利用統(tǒng)計學(xué)假設(shè)檢驗的結(jié)果有助于確定試驗結(jié)果的生物學(xué)意義，但具有統(tǒng)計學(xué)意義并不一定代表具有生物學(xué)意義。 在判斷生物學(xué)意義時應(yīng)考慮與該實驗室的歷史數(shù)據(jù)相比較。 根據(jù)長期毒性研究結(jié)果，分析討論需在臨床、質(zhì)量可控性研究中注意的問題。 長期毒性研究結(jié)果還應(yīng)結(jié)合其他相關(guān)安全性試驗及藥/毒代動力學(xué)的結(jié)果進行分析。,（十一）綜合評價 1應(yīng)結(jié)合其他安全性試驗的毒性反應(yīng)情況，判斷毒性反應(yīng)是否存在種屬差異，是否需進行進一步的研究。 2應(yīng)結(jié)合臨床前藥效學(xué)試驗結(jié)果和擬臨床適應(yīng)癥，判斷有效性與毒性反應(yīng)的關(guān)系，判斷藥物對正常動物和模型動物的生理生化指標(biāo)的改變是否相同或相似，并注意提示臨床研究應(yīng)注意的問題。 對

39、受試物引起的嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，應(yīng)盡可能查找產(chǎn)生毒性的原因，根據(jù)相關(guān)文獻資料或試驗資料，推測可能的毒性成分，提出是否對處方工藝及處方中的某些藥材或某些成分需進行特別的控制等。 3結(jié)合臨床主治（適應(yīng)癥），權(quán)衡利弊，考慮其開發(fā)前景。,（十二）其它考慮 某些其他安全性試驗項目，如一般藥理學(xué)研究中的心血管系統(tǒng)等指標(biāo)的觀察、注射給藥的局部刺激性的觀察、免疫毒理研究、有依賴傾向的受試物的依賴性觀察、毒代動力學(xué)研究等均可結(jié)合長期毒性研究同時進行。,在所進行的試驗中，盡量獲取更多的和所需要的信息。 鼓勵創(chuàng)新藥進行毒代動力學(xué)研究。 因有些中藥已有一定的臨床應(yīng)用經(jīng)驗，對受試物的長期毒性研究可結(jié)合以往的臨床應(yīng)用和文獻情

40、況及其它試驗結(jié)果進行綜合評價。,四、不同情況的中藥、天然藥物長期毒性研究的一般要求,考慮到中藥、天然藥物各類藥物處方來源、立題依據(jù)等的不同，在具體進行試驗時可參照以下要求進行。 但這些要求僅是一般要求，研制者應(yīng)遵循新藥開發(fā)的客觀規(guī)律，具體試驗時應(yīng)根據(jù)受試物自身特點、具體情況來進行設(shè)計，考慮需進行哪些研究。,1未在國內(nèi)上市銷售的從中藥、天然藥物中提取的有效成分及其制劑，未在國內(nèi)上市銷售的來源于植物、動物、礦物等藥用物質(zhì)制成的制劑，未在國內(nèi)上市銷售的中藥材新的藥用部位制成的制劑，未在國內(nèi)上市銷售的從中藥、天然藥物中提取的有效部位制成的制劑，未在國內(nèi)上市銷售的由中藥、天然藥物制成的注射劑 以上情況，

41、由于其物質(zhì)基礎(chǔ)較傳統(tǒng)中藥發(fā)生了明顯改變，或應(yīng)用經(jīng)驗較少，為全面考察受試物的長期毒性反應(yīng)情況，應(yīng)采用兩種動物進行長期毒性研究（建議為嚙齒類和非嚙齒類），并仔細分析產(chǎn)生毒性反應(yīng)的原因。,2未在國內(nèi)上市銷售的由中藥、天然藥物組成的非注射給藥的復(fù)方制劑 若處方中各味藥材均符合法定標(biāo)準(zhǔn)，無毒性藥材，無十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經(jīng)化學(xué)處理（水、乙醇粗提除外），急性毒性試驗（采用最大給藥容量、最大給藥濃度）未見明顯毒性反應(yīng)，臨床實際用藥期為1周以內(nèi)者，可免做長期毒性試驗。,臨床用藥超過一周，未在國內(nèi)上市銷售的由中藥、天然藥物組成的非注射給藥的復(fù)方制劑，可先進行一種動物（嚙齒類）的長期毒性試驗，當(dāng)發(fā)現(xiàn)明顯

42、毒性時，為進一步研究毒性情況，再采用第二種動物（非嚙齒類）進行研究。 若該類處方中含有毒性藥材（見附錄IV）、無法定標(biāo)準(zhǔn)藥材或有十八反、十九畏等配伍禁忌時，則應(yīng)進行兩種動物（嚙齒類和非嚙齒類）的長期毒性試驗。,毒性藥材,指導(dǎo)原則中所稱毒性藥材，系指入國務(wù)院 醫(yī)療用毒性藥品管理辦法 的中藥品種。即：砒石、砒霜、水銀、生馬錢子、生川烏、生草烏、生白附子、生附子、生半夏、生南星、生巴豆、斑蝥、青娘蟲、紅娘蟲、生甘遂、生狼毒、生藤黃、生千金子、生天仙子、鬧羊花、雪上一枝蒿、紅升丹、白降丹、蟾酥、洋金花、紅粉、輕粉、雄黃。另外，凡在近年來發(fā)現(xiàn)的有毒性作用藥材（原料）或在復(fù)方中含有明顯有毒組份的均按毒性藥

43、材處理。,3改變國內(nèi)已上市銷售藥品給藥途徑（不包括由非注射劑改為注射劑）的制劑、不改變給藥途徑的非注射給藥改劑型制劑和改工藝制劑 若處方中各味藥材均符合法定標(biāo)準(zhǔn)，無毒性藥材，無十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經(jīng)化學(xué)處理（水、乙醇粗提除外），急毒試驗（采用最大給藥容量、最大給藥濃度）未見明顯毒性反應(yīng)，臨床實際用藥期為1周以內(nèi)者，可免做長期毒性試驗。,臨床用藥超過一周，建議采用高劑量增設(shè)一個原給藥途徑、原劑型或原工藝對照組，先進行一種動物（嚙齒類）的長期毒性試驗。如發(fā)現(xiàn)與原給藥途徑、原劑型或原工藝制劑不同的明顯毒性反應(yīng)或更嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，應(yīng)進行另一種動物（非嚙齒類）的長期毒性試驗研究,4增加新的適應(yīng)

44、癥或者功能主治的品種 如需延長用藥周期或增加劑量者，應(yīng)結(jié)合原品種的申報資料及處方組成的情況確定是否需進行長期毒性試驗研究及長期毒性試驗研究的內(nèi)容。,新藥特殊毒性研究,（突變、生殖、致癌、藥物依賴試驗）,新藥臨床前特殊毒理學(xué)評價包括致突變試驗、生殖毒性試驗（致畸試驗）、致癌試驗和藥物依賴性試驗。,1. 突變試驗 基本試驗方法有三種： 1）微生物回復(fù)突變試驗 即Ames試驗，試驗用菌株為組胺酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（S. Typhimurium），以TA97、TA98、TA100和TA102作為標(biāo)準(zhǔn)測試菌株。受試藥物至少要設(shè)5個劑量組，應(yīng)設(shè)空白、溶媒、陽性對照和代謝活化（S9）對照，實驗至少重復(fù)一次

45、。結(jié)果依據(jù)加入被測新藥平皿中回變生長的菌落數(shù)并與空白對照平皿中的菌落數(shù)據(jù)相比較得出受試藥物有無誘變性來判斷。,2）哺乳動物培養(yǎng)細胞染色體畸變試驗 用中國倉鼠肺細胞（CHL）在體外培養(yǎng)進行。觀察染色體斷裂后導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)和數(shù)目的異常稱為染色體畸變。結(jié)果要求受試藥物誘發(fā)的染色體畸變率與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義并與劑量有相關(guān)性。 3）體內(nèi)試驗 嚙齒動物微核（有絲分裂后期）試驗，我國新藥審批辦法中要求做小鼠骨髓微核試驗。 上述三項致突變試驗結(jié)果全部陰性時，則不必往下進行。,2生殖毒性試驗 1）一般生殖毒性試驗（）試驗在交配前給藥，目的是評價生殖細胞接觸藥物（化合物）后對受胎能力。實驗結(jié)果分析和評價包括：受孕

46、率、死胎數(shù)、活胎數(shù)、活胎重量、性別、外觀及內(nèi)部器官的形態(tài)學(xué)觀察和骨骼的檢查。 2）致畸敏感期毒性試驗（） 試驗在器官發(fā)生期給藥，旨在揭示藥物可能的胚胎毒性和致畸性。大、小鼠孕后615天，家兔618天連續(xù)給藥，。妊娠末期剖檢。 3）圍產(chǎn)期毒性試驗（） 試驗在圍產(chǎn)期和哺乳期給藥，于妊娠后期及整個泌乳期給藥，即：大、小鼠于妊娠第15天開始，至分娩后21天（小鼠）和28天（大鼠）；家兔于妊娠第22天開始，至分娩后31天。所有雌性動物自然分娩，觀察子代直至成年。,3. 致癌試驗 致癌試驗是一項復(fù)雜、細致的長期過程，應(yīng)設(shè)空白對照，陽性對照藥組（結(jié)構(gòu)相近的已知致癌物），受試藥物至少設(shè)3個劑量。,4、藥物依賴

47、性試驗 包括身體依賴性與精神依賴性試驗。 1）身體依賴性試驗 自然戒斷試驗 需用小鼠、大鼠和猴3種動物，連續(xù)給予動物一段時間的受試藥后突然停藥，觀察動物出現(xiàn)的戒斷癥狀。 替代試驗 給予動物代表藥（如嗎啡、巴比妥鈉或苯巴比妥鈉），使之產(chǎn)生身體依賴性后，停止給予代表藥，以同樣方式給予不同劑量受試藥，觀察替代期間動物的戒斷癥狀。 催促試驗 短時間內(nèi)給予動物大劑量受試藥，然后注射受體拮抗劑（鈉洛酮）以催癮，觀察是否出現(xiàn)戒斷癥狀及其程度。 誘導(dǎo)試驗 誘發(fā)驚厥，包括：聽源性發(fā)作（Audiogenic seizures）；戊四氮驚厥（Pentylenetetrazole）。對鎮(zhèn)靜催眠藥產(chǎn)生身體依賴性的動物，

48、在斷藥期間出現(xiàn)反跳性興奮，用閾下刺激強度誘發(fā)驚厥。,2）精神依賴性試驗 采用“自身給藥”（覓藥行為） 操作式條件行為試驗，測定靜脈注射藥物對動物的強化效應(yīng)，是當(dāng)前國際上通用的評價藥物精神依賴性潛力實驗方法。,新藥制劑安全性試驗,（過敏、刺激、溶血試驗）,制劑安全性（刺激性、過敏性和溶血性） 藥物制劑經(jīng)眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、關(guān)節(jié)腔、皮膚、直腸、陰道、靜脈、動脈、肌肉、皮下、靜脈旁和鞘內(nèi)等非口服途徑給藥，對用藥局部產(chǎn)生的毒性（如刺激性和過敏性等）和/或?qū)θ懋a(chǎn)生的毒性（如過敏性和溶血性等）。是臨床前安全性評價的組成部分。 毒性來源：藥物的活性成分及其代謝物、輔料、雜質(zhì)等及制劑理化性質(zhì)（如pH值

49、、滲透壓等）。, 刺激性試驗 1、定義 刺激性：非口服藥物制劑對給藥部位產(chǎn)生的可逆性炎癥改變，給藥部位不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。 2、刺激性試驗設(shè)計 1）實驗動物 一般每個試驗選擇一種動物進行評價。 2）給藥的頻率與期限 依據(jù)擬定臨床應(yīng)用情況決定。 重復(fù)給藥 每天給藥一次，給藥期限最長不超過4周； 偶爾給藥 單次給藥試驗。 3）可逆性 停藥后恢復(fù)期觀察（局部及相關(guān)部位）。 4）受試藥和對照物 受試物與用于人體制劑一致。以溶媒和/或賦形劑作為陰性對照。必要時采用陽性對照或已上市制劑。 5）劑量（濃度和總劑量） 設(shè)一個與臨床制劑相同濃度劑量組，通過給藥頻率進行劑量調(diào)整。,6）給藥方式 給藥方

50、案、途徑和部位 應(yīng)盡量與臨床用藥方案一致。 給藥容積、速率和頻率 根據(jù)劑量和動物給藥部位的解剖和生理特點。 可在同一動物身上進行不同給藥途徑的刺激性試驗，并可在對側(cè)進行對照試驗。條件：耐受性許可和無相互影響。 3、皮膚刺激性試驗 1）經(jīng)皮給藥及可能接觸皮膚的非口服給藥制劑（直腸、陰道給藥）應(yīng)考慮進行皮膚刺激性試驗。 2）在急性毒性驗、長期毒性或皮膚過敏性試驗中已經(jīng)評價過皮膚刺激性，可不必進行單獨的皮膚刺激性試驗。,3）試驗方法 動物 首選家兔48只，雌、雄各半，應(yīng)設(shè)賦形劑對照，采用同體左右側(cè)自身對比。試驗前24小時給藥區(qū)（背部）進行左、右各3cm3cm脫毛（剪、剃或脫毛劑）。損傷皮膚不宜進行試

51、驗。在用藥部位用砂紙磨或劃“井”字并以滲血為度考察破損皮膚的刺激性。 給藥 不宜通過增加涂敷厚度或加大涂布面積來提高給藥劑量。取受試物0.5 ml直接涂于一側(cè)去毛皮膚，用二層紗布（2.5 cm2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用膠布和繃帶固定；另一側(cè)涂賦型劑對照。貼敷時間至少4小時。貼敷結(jié)束后，除去受試物并用溫水清潔給藥部位。多次給藥應(yīng)連續(xù)同時辰，在同一部位給藥，貼敷期限一般不超過4周。 觀察 觀察皮膚反應(yīng)，按評分標(biāo)準(zhǔn)對皮膚紅斑和水腫進行評分。 單次給藥：去除藥物后30-60分鐘，24、48和72小時肉眼觀察記錄涂敷部位紅斑和水腫等情況。如存在持久性損傷，延長觀察期限，觀察恢復(fù)情況和時間

52、，但延長期不超過14天。出現(xiàn)皮膚刺激性中度以上的動物應(yīng)對給藥局部進行病理學(xué)檢查。 多次給藥：每次去除藥物后1小時以及再次貼敷前觀察及記錄紅斑、水腫、色素沉著、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄情況及其發(fā)生時間及消退時間，并對紅斑及水腫進行評分。末次貼敷后，在去除藥物后30-60分鐘，24、48和72小時肉眼觀察并記錄涂敷部位有無紅斑和水腫等情況。持久性和中度以上損傷的觀察同單次給藥。,結(jié)果評價：單次給藥計算每一觀察時間點各組受試物及賦形劑皮膚反應(yīng)積分平均分值。將受試側(cè)皮膚反應(yīng)平均分值減去賦形劑皮膚平均分值得到原發(fā)性刺激指數(shù)，按表進行刺激強度評價。多次給藥首先計算每一觀察時間點各組原發(fā)性刺激積分均值，然

53、后計算觀察期限內(nèi)每天每只動物刺激積分均值即累積刺激指數(shù)，進行刺激強度評價。,皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn),皮膚刺激強度評價標(biāo)準(zhǔn),4） 試驗報告 符合GLP實驗室管理規(guī)范，內(nèi)容包括：受試物名稱、理化性狀、配制方法和用量；實驗動物的種屬、品系、性別、體重和來源（注明動物合格證號和動物級別）；實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境（包括飼料來源、室溫、濕度、照明、實驗動物設(shè)施合格證號）；詳細的試驗操作；每只動物在每一觀察時間點的皮膚反應(yīng)積分；具體描述其它毒性反應(yīng)；試驗結(jié)論等。 5） 試驗結(jié)果的解釋 該試驗系統(tǒng)比人皮膚刺激反應(yīng)敏感，刺激反應(yīng)陰性大多可確定為無刺激性，陽性反應(yīng)要排除假陽性。除非受試物有大范圍或長時間的使用，否則輕度刺

54、激性可不予重視。,4. 注射給藥部位刺激性試驗 炎癥、組織變性和壞死等不良反應(yīng)。 1）試驗方法 試驗動物：家兔，每組（單次給藥、多次給藥）不少于3只。設(shè)生理鹽水對照，用同體左右側(cè)自身對比。 給藥方法：途徑與臨床使用情況一致，可選用耳緣靜脈，耳中心動脈、股和背部肌肉，側(cè)胸壁皮下組織等。給藥容積和速率應(yīng)根據(jù)動物情況進行相應(yīng)的調(diào)整。給藥期限應(yīng)根據(jù)藥物擬用于臨床的情況來決定，多次給藥一般不超過7天。 動物觀察：單次給藥，在給藥后48-96小時對動物和注射部位進行肉眼觀察；多次給藥，每天給藥前以及最后一次給藥后48-96小時對動物和注射部位進行肉眼觀察。觀察期結(jié)束時應(yīng)對部分動物進行病理學(xué)檢查。留下的動物

55、繼續(xù)觀察1421天再進行病理組織學(xué)檢查，以了解刺激性反應(yīng)的可逆程度。 2）結(jié)果評價：根據(jù)肉眼觀察和病理檢查結(jié)果，對受試物進行安全性評價。 3）試驗報告 試驗報告應(yīng)符合GLP實驗室管理規(guī)范，內(nèi)容包括：受試物名稱、理化性狀、配制方法和用量；實驗動物的種屬、品系、性別、體重和來源（注明動物合格證號和動物級別）；實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境（包括飼料來源、室溫、濕度、照明、實驗動物設(shè)施合格證號）；詳細的試驗操作；每只動物在每一觀察時間點的刺激反應(yīng)情況；具體描述其它毒性反應(yīng)；試驗結(jié)論等。, 眼刺激性試驗 眼前部表面可逆性組織改變（炎癥、變性和壞死等）。 1）試驗方法 試驗動物：首選家兔，動物數(shù)每組不少于3只。應(yīng)設(shè)置生理鹽水對照組，可采用同體左右側(cè)自身對比法。試驗前24小時內(nèi)對動物進行雙眼檢查（包括熒光素鈉檢查）。有眼睛刺激癥狀、角膜缺陷和結(jié)膜損傷動物棄用。 給藥方法：每只眼睛滴入0.1ml或涂敷0.1g受試物，然后合眼瞼約10s。不需沖洗眼睛。用藥周期根據(jù)擬臨床情況決定，多次給藥一般不超過4周。 眼部觀察：單次給藥，在給藥后1、24、48和72小時對眼部進行檢查；多次給藥，每天給藥前以及最后一次給藥后1、24、48和72小時對眼部進行檢查。如果在72小時未見任何刺激癥狀，試驗則可結(jié)束。如存在持