免疫功能檢查課件

1、免疫功能檢查 Laboratory Diagnosis for Immune Function 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院全軍醫(yī)學(xué)免疫中心高春芳,臨床疾病與免疫的關(guān)系 免疫系統(tǒng)性疾病 免疫缺陷病、免疫增殖病 免疫相關(guān)性疾病 自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病 感染性疾病 應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)診斷、治療性疾病,臨床免疫 自身免疫病 內(nèi)分泌免疫學(xué) 變態(tài)反應(yīng)性疾病 皮膚病免疫學(xué) 免疫缺陷性疾病 免疫增殖性疾病 心血管病免疫學(xué) 呼吸免疫學(xué) 移植免疫學(xué) 生殖免疫學(xué) 腫瘤免疫學(xué) 神經(jīng)免疫學(xué) 傳染免疫學(xué) 消化免疫學(xué) 風(fēng)濕病學(xué) 血液免疫學(xué) 創(chuàng)傷免疫學(xué) 免疫治療學(xué) 腎病免疫學(xué) 免疫預(yù)防學(xué),免疫學(xué)診斷的定義： 用抗原、抗體結(jié)

2、合的技術(shù)對(duì)與免疫有關(guān)的疾病，如免疫增殖病、免疫缺陷病、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫、傳染病、惡性腫瘤等作出輔助診斷或特異性診斷。 應(yīng)用意義：1. 直接測(cè)定免疫功能 2. 檢查致病因子 3. 參考作用,免疫功能 (immune function) 體液免疫 (humoral immunity) 細(xì)胞免疫(cellular immunity) 免疫球蛋白(immunoglobulin) T細(xì)胞 (T-cell) 補(bǔ)體(complement) 細(xì)胞因子(cytokines),兩種T輔助細(xì)胞不同的細(xì)胞因子產(chǎn)生譜 及不同效應(yīng),體液免疫測(cè)定 免疫球蛋白定量 散射及濁度測(cè)定技術(shù) 原理是根據(jù)抗原和抗體形成的復(fù)合物粒子對(duì)

3、光的散射和吸收度來判斷待測(cè)抗原的量。測(cè)定散射光強(qiáng)度的方法稱為nephelometry，測(cè)定吸收光強(qiáng)度的方法稱turbidimetry。兩種方法均可采用速率法（rate assay）即反應(yīng)開始第1分鐘內(nèi)的光散射或吸收度或終點(diǎn)法（end-point assay），即反應(yīng)終止時(shí)（一般為30min）的光散射度或吸收總量。通過微電腦對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，即可知道被檢蛋白質(zhì)（Ig）的含量 參考值： IgG 815 g/L, IgA 0.93 g/L, IgM 0.52.5 g/L,免疫球蛋白測(cè)定的臨床意義 免疫球蛋白升高 非特異性多克隆升高 特異性單克隆升高 免疫球蛋白減低 細(xì)胞免疫缺陷、體液免疫缺陷、聯(lián)合免疫

4、缺陷 免疫球蛋白缺陷?。簾o球蛋白血癥、選擇性IgA 缺陷癥、選擇性IgM或IgE缺陷,Recombination -22;H-14) 輕鏈、重鏈的基因不連續(xù)，必須經(jīng)過基因重排分別連在一起。 同樣按照DNAmRNA蛋白質(zhì)這一生物合成的中心法則合成。 重鏈、輕鏈分別在不同的核糖體( polysomes)上合成。 合成后的輕鏈和重鏈在光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)裝配成完整的Ig分子(H2L2)。 裝配好的Ig分子進(jìn)入高爾基氏體進(jìn)行糖基化，通過分泌泡送至細(xì)胞膜表面, 在釋放前可在細(xì)胞膜表面停留幾個(gè)小時(shí)。,H鏈和L鏈的氨基酸數(shù)量差別很大,合成的速度也不同,一般合成一條重鏈約需18分鐘,而合成一條輕鏈只需10分鐘, 組成一

5、條完整的Ig(兩條重鏈和兩條輕鏈)則有一條以上輕鏈過剩。多余、過剩的輕鏈由細(xì)胞膜分泌到胞外, 再轉(zhuǎn)入腎臟, 約10在腎小管內(nèi)分解代謝, 80回吸收,由體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬降解，10從尿排出。因此, 正常人尿中始終有微量輕鏈排出。正常人尿約含510g/ml, 最大20g/ml, 每天約排25mg/d。因?yàn)槭钦：铣? /也是2:1。這個(gè)含量用一般方法是無法測(cè)出的。,非特異性免疫球蛋白增殖病 肝病 自身免疫病 慢性感染 惡性腫瘤 免疫母細(xì)胞淋巴結(jié)病 AIDS,免疫指標(biāo)不是肝功能的直接指標(biāo)，但由于肝臟承擔(dān)了體內(nèi)蛋白質(zhì)的及其它物質(zhì)的合成與代謝，因此能直接或間接地影響與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)，通過對(duì)血清Ig及補(bǔ)

6、體的檢測(cè)，可在一定程度上反映受檢者肝臟的疾病和損傷。,血清蛋白電泳,肝病是導(dǎo)致外周血免疫球蛋白非特異性升高的六大病種之一。 急性肝炎多以IgM升高（310天）。 慢性肝炎IgG、IgA皆升高，以IgG為主。 肝硬化則IgG、IgA、IgM皆升高，但以 IgA升高為顯著。 肝癌則IgM降低、IgA升高最明顯。 當(dāng)然以上這些變化是相對(duì)而言，并不是絕對(duì)的。,肝臟不是免疫球蛋白的合成場(chǎng)所，但對(duì)血清中免疫球蛋白含量起重要的調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在： 影響腸道內(nèi)抗原物質(zhì)的吸收及處理; 通過Kupffer細(xì)胞對(duì)抗原呈現(xiàn)特殊遞呈作用; 門體靜脈側(cè)枝循環(huán)可將腸道來源的抗原直接 暴露在全身免疫系統(tǒng)而誘導(dǎo)機(jī)體大

7、量抗體的產(chǎn) 生等。,特異性免疫球蛋白增殖癥 (單克隆增殖和惡性Ig增殖癥) 單克隆增殖是一個(gè)細(xì)胞在某一分裂階段發(fā)生突變, 然后急劇分化、增殖, 并大量表達(dá)某種單一的Ig, 這種惡性增殖具有如下特點(diǎn): 均一型 含量大(達(dá)到數(shù)克也可高達(dá)10余克) 正常成分減少(正常值以下) 比例失調(diào)(/或2:1) 出現(xiàn)相關(guān)臨床表現(xiàn)(骨骼、腎臟、血液等系統(tǒng)),當(dāng)Ig異常表達(dá)時(shí), 可出現(xiàn)以下三個(gè)現(xiàn)象: 被激活、突變的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為前B細(xì)胞或漿細(xì)胞活性極高,可快速合成Ig, 合成一條H鏈大約需要2.5分鐘, 合成一條L鏈則只需1分鐘。如此, 每合成一分子Ig則會(huì)剩余3條輕鏈,多余的輕鏈由尿中排出, 可達(dá)1mg/ml以上。

8、 由于突變和激活的細(xì)胞是單一克隆, 按一個(gè)細(xì)胞一種抗體的原則, 所表達(dá)的Ig均為單一產(chǎn)物, 亦即一個(gè)型、一個(gè)亞型、一個(gè)基因型。因此, 尿中出現(xiàn)的過剩輕鏈均屬一個(gè)型。同樣, 血中增殖的Ig, 多屬一個(gè)型。血和尿中/決不是2:1或大于此或小于此。 由于同種抑制和反饋抑制, 當(dāng)某一克隆細(xì)胞大量、快速增殖時(shí), 其他克隆細(xì)胞則會(huì)被抑制, 大量的均一產(chǎn)物(Ig)也會(huì)反饋地抑制正?？寺〉脑鲋澈捅磉_(dá)。因此, 除單一克隆產(chǎn)物大量增殖外, 正常Ig則會(huì)明顯減少。,多發(fā)性骨髓瘤: 發(fā)病機(jī)率和Ig含量一樣, IgG型最多, IgA型次之, IgM型少見(7S),IgD更少, IgE型罕見(至今發(fā)現(xiàn)不過20例)。 巨球

9、蛋白血癥: 屬于IgM型, 由于大量增殖, IgM可發(fā)生各種聚合, 正常為19S, 患者可出現(xiàn)24S, 32S等多鐘聚合體。 淋巴瘤: 有時(shí)慢性淋巴細(xì)胞惡性病變, 也可出現(xiàn)多克隆增殖。,輕鏈病 可分型和型, 亦有雙克隆型。由于尿中出現(xiàn)輕鏈可分多克隆型、單克隆型, 并隨型在診斷中要分析清楚。輕鏈病的診斷必須符合以下三條才能作出決定: 各種Ig正?；驕p少; 血中和尿中出現(xiàn)一條輕鏈帶(電泳后) 臨床上符合一個(gè)多發(fā)性骨髓瘤的診斷 重鏈病: Ig有5種重鏈則應(yīng)有5種重鏈病, 但目前只發(fā)現(xiàn)了4種, 最多的是重鏈病, 已發(fā)現(xiàn)200余例, 重鏈病已報(bào)告, 重鏈病只有19例, 重鏈病只有一例報(bào)告,重鏈病至今未見

10、報(bào)告。,7S IgM病: IgM是19S, 7S是小分子IgM報(bào)告不 多, 我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)。 半分子病: 按機(jī)率5種Ig皆可出現(xiàn)半分子病, 但至 今只發(fā)現(xiàn)IgG(3例)和IgA(5例)半分子病。除了免疫分析有特點(diǎn)之外, 其他基本上如MM 選擇性或鏈缺乏癥: 本病報(bào)告極少, BMG(良性M蛋白血癥)或MGUS(不明意義的M蛋白癥): 屬于一種良性異常增殖、性質(zhì)不良、/值輕度變化, M蛋白3g/dL, 骨髓漿細(xì)胞10等。,Four- M character Monoclonal Multiple Myeloma Malignant,Distribution of serum monoclonal p

11、roteins in 922 cases at the Mayo Clinic in 1992,Epidemiology of MM lAnnual incidence: 4 per 100,000, related to the availability of medical facilities; in the elderly and the improvement of diagnostic techniques. l 1% in all malignant diseases, slight more than 10% in hematologic malignancies. lRaci

12、al difference for incidence rate, lower in Asian. l In persons younger than 50yr: 18% l Median age at diagnosis: 63 yr,Multiple Myeloma ( MM) The annual incidence of MM is 4/100,000 per year Il-6 is a major growth factor in MM 99% of patients have a monoclonal protein in the serum or urine during th

13、e course of their disease The most important prognostic factors are plasma cell labeling index and 2 microglobulin level,Biologic Aspects lSurface markers of malignant plasma cells suggests its origin from a pluripotent stem cell. l CD4 T cells: decreased. l IL-1 and TNF devoted to the bone lesions

14、in myeloma. lIL-6: important myeloma cell growth factor for the progression. lOncogenes related: Ras mutation 47%/33 cases; P53 point mutation l Cytogeneic studies: chromosome abnormalities 50%,Clinical manifestations l Bone pain: 2/3 l Height reduce because of vertebral collapse l Weakness and fati

15、gue because of anemia l Fever because of infectious process l Pallor, most frequent physical finding l Liver palpable in 15% patients, spleen rarely enlarged lExtramedullary plasmacytomas: large, purplish, subcutaneous masses observed late in the course of the disease,Laboratory findings L Normocyti

16、c, normochromic anemia 2/3 L Hypercalcemia L Elevation of serum creatinine level L SPE: M-spike 80% L M-protein: 92% IgG 50%; IgA 20%; free monoclonal light chain 20% L Serum or Urine M protein: 99% L Plasma cells: 10% (5100%), more focal than diffuse, repeated bone marrow examination necessary,Help

17、ful laboratory items for differential diagnosis: The size of the serum M-protein; The amount of urine M-protein; The number of bone marrow plasma cells; The hemoglobin, calcium, and creatinin levels and levels of uninvolved serum Igs;,Prognostic factors l Duration of survival: few months many years,

18、 median 2.53 year. l Uncorrected 2 microglobulin level is one of the most powerful prognostic factors l CRP, which correlated with the serum IL-6 level maybe helpful for determining prognosis l LDH, if elevated indicates poor prognosis,單克隆性免疫球蛋白增殖癥的實(shí)驗(yàn)室診斷要點(diǎn),免疫球蛋白及輕鏈定量 血清蛋白電泳 免疫固定電泳 尿蛋白電泳及本周氏蛋白定性,補(bǔ)體檢查

19、和有關(guān)疾病 總補(bǔ)體活性測(cè)定 CH50 單個(gè)補(bǔ)體成分定量 C4經(jīng)典途徑 B因子旁路途徑 C3經(jīng)典和旁路途徑 臨床意義： 補(bǔ)體減少：腎病、自身免疫性疾病、腫瘤、 補(bǔ)體缺陷病。 補(bǔ)體增加：少見，如腫瘤。,Two Typical Pathway for Complement Activation,Common Pathway for complement activation,補(bǔ)體與肝臟的關(guān)系較免疫球蛋白更為密切，部分補(bǔ)體及其抑制因子由肝臟合成，肝臟的感染和炎癥反應(yīng)可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致血清總補(bǔ)體活性及其它補(bǔ)體成分的含量增加，這種現(xiàn)象可見于預(yù)后較好的急性病毒性肝炎早期。 當(dāng)肝實(shí)質(zhì)受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，補(bǔ)體

20、成分的合成相應(yīng)減少，這種減少往往在肝病的晚期，同時(shí)伴有顯著的肝功能受損。 此外任何造成肝實(shí)質(zhì)損傷與肝臟流動(dòng)力學(xué)變化均可導(dǎo)致循環(huán)免疫復(fù)合物在外周血中的積聚，其結(jié)果導(dǎo)致對(duì)補(bǔ)體的過量激活，使血清中補(bǔ)體含量消耗性降低，急性降低多見于急性重癥肝炎，慢性消耗性減低主要發(fā)生在多種補(bǔ)體成分自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎、肝硬化及其它原因?qū)е碌母尾⊥砥凇?細(xì)胞免疫功能測(cè)定,抗原特異T細(xì)胞檢測(cè),細(xì)胞毒性T細(xì)胞檢測(cè),流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是八十年代發(fā)展起來的一項(xiàng)利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析的新技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)集激光術(shù)、微電腦、單克隆抗體技術(shù)、細(xì)胞色素化學(xué)于一體，形成了快速、準(zhǔn)確的分析和細(xì)胞分

21、選技術(shù)方法。FCM在臨床和基礎(chǔ)研究中的價(jià)值主要體現(xiàn)于免疫表型分析、DNA含量分析和細(xì)胞分選三個(gè)方面。其中免疫表型分析在細(xì)胞免疫功能測(cè)定中起著重要作用。,FCM原理 用細(xì)胞表面特異性單克隆抗體與細(xì)胞作用，再利用熒光結(jié)合的第二抗體與之作用。通過抗原抗體反應(yīng)，使陽性細(xì)胞標(biāo)上熒光，此為間接標(biāo)記法或?qū)⑻禺愋詥慰瓜葮?biāo)記上熒光再直接與細(xì)胞結(jié)合發(fā)光，此為直接標(biāo)記法，當(dāng)細(xì)胞流經(jīng)流式細(xì)胞儀，激光束（488nm）對(duì)高速通過的細(xì)胞流照射，使熒光染料產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的散射光，光信號(hào)收集后經(jīng)由PMT（光電倍增管）放大并加以分析處理，在短時(shí)可獲取細(xì)胞大小、核質(zhì)比、熒光強(qiáng)度和陽性百分比等數(shù)據(jù)。,流式細(xì)胞術(shù)的幾個(gè)重要特點(diǎn) 標(biāo)本只要

22、是單細(xì)胞即可用于分析 極短時(shí)間內(nèi)可分析大量細(xì)胞 可同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的多種特征 定性或定量分析,FCM對(duì)細(xì)胞免疫功能的檢測(cè)主要用于 1、細(xì)胞分群和細(xì)胞亞群的分析 利用CD45/CD14可以分出外周血中的白細(xì)胞和單核細(xì)胞，在白細(xì)胞內(nèi)利用CD3、CD19、CD20、CD3/(CD16+56)+ 等標(biāo)記進(jìn)一步可分出T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等。在T細(xì)胞內(nèi)又有CD4/CD8標(biāo)志的T輔助/誘導(dǎo)和T抑制/殺傷亞群利用CD4/CD29、CD8/CD28標(biāo)志可以將T4、T8進(jìn)一步分出各亞群。 2、檢測(cè)淋巴細(xì)胞的活化 CD3/HLA-DR、CD3/CD25、CD69等都是活化T淋巴細(xì)胞的特異性標(biāo)記，另有C17單抗是

23、活化的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的標(biāo)志物。其比值的改變對(duì)病情監(jiān)測(cè)，療效判斷有重要的指導(dǎo)意義。 3、一些特殊的標(biāo)志如CD4/CD8比值是AIDS、自身免疫性疾病病程監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。,當(dāng)前流式細(xì)胞分析的發(fā)展趨勢(shì)(1) 從相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)到絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù) 淋巴細(xì)胞亞群、造血干細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、血小板等 從相對(duì)定量到絕對(duì)定量 定量抗體微球法 定量熒光素分子微球法 從單色到多色熒光分析 特別適用于淋巴細(xì)胞亞群分析、白血病免疫表型分析、 細(xì)胞功能評(píng)價(jià),當(dāng)前流式細(xì)胞分析的發(fā)展趨勢(shì)(2) 從細(xì)胞膜成分到細(xì)胞內(nèi)成分分析 胞漿酶、細(xì)胞因子等多種成分分析 液體中可溶性成分的流式細(xì)胞術(shù)分析 流式微球分析 流式分子表型分析 Molecular phenotyping 用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞中特異性核酸序列或 特異性基因異常。分析表型與免疫表型分析技術(shù)相結(jié)合，對(duì)于分析特定細(xì)胞群的功能和特性提供廣闊應(yīng)用前景。,常用外周血表型分析值* CD分類 意 義 正常值（）X2S CD3 總T淋巴細(xì)胞 65.869.60 CD2 花環(huán)形成細(xì)胞 77.469.27 CD4 T輔助/T誘導(dǎo)亞群 37.538.