蛋白質(zhì)樣品的制備

1、.,第二章 蛋白質(zhì)樣品的制備,.,蛋白質(zhì)樣品的制備是蛋白質(zhì)組分析的基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)樣品制備包含：蛋白質(zhì)分離、提取、純化 蛋白質(zhì)樣品的制備是蛋白質(zhì)組研究的第一步，無(wú)論后續(xù)采用怎樣的分離或鑒定手段，樣品制備都是關(guān)鍵步驟。從蛋白質(zhì)組大規(guī)模研究的角度而言，要求樣品制備盡可能獲得所有的蛋白質(zhì)，但是由于蛋白質(zhì)種類多、豐度不一和物化特性多樣等，要達(dá)到真正的全息制備是具有難度的。,.,第一節(jié) 樣品制備總則,一、為什么要進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的制備 1.要從某些組織樣品中尋找功能蛋白質(zhì)，就要排除非蛋白質(zhì)的影響。 2.目前實(shí)驗(yàn)條件下，雙向電泳能分辨到1000-5000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)（spot），而生物的蛋白種類多達(dá)10萬(wàn)種以上，

2、樣品中的蛋白質(zhì)種類也可達(dá)到1萬(wàn)種以上，但大部分蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)都很少，因此通過(guò)樣品制備也可以起到濃縮蛋白質(zhì)的作用。 3.消除各種細(xì)胞或組織混雜的影響,.,“在制備中丟失的蛋白是永遠(yuǎn)不可能在后面的 試驗(yàn)中彌補(bǔ)回來(lái)的”,.,二、樣品制備的原則,1.盡可能采用簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行樣品的處理 2.盡可能的提高樣品的溶解度，使所有待分析的蛋白質(zhì)樣品全部處于溶解狀態(tài)，且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。 3.細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑以防止蛋白的降解。 4.樣品制備過(guò)程中，防止發(fā)生人為的蛋白質(zhì)樣品化學(xué)修飾.（加入尿素后加溫不要超過(guò)37 ，防止氨甲?；揎椀鞍? 5.防止樣品在等電聚焦時(shí)

3、發(fā)生蛋白質(zhì)的聚集和沉淀 6.破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子之間的相互作用，以產(chǎn)生獨(dú)立的多肽鏈 7.有的研究中必須保持蛋白質(zhì)的活性。 8.通過(guò)超速冷凍離心等方法清除所有的非蛋白雜質(zhì)，對(duì)可能起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)也應(yīng)去除 9.樣品裂解液應(yīng)該新鮮配置，并且分裝凍存于-80 。勿反復(fù)凍融已制備好的樣品。,.,三、流程,1.細(xì)胞或者組織、菌體的破碎 2.沉淀溶液樣品中的蛋白質(zhì)及清除雜質(zhì) 3.蛋白質(zhì)的純化(重泡漲溶液稀釋樣品；三氯乙酸+冷丙酮）,.,第二節(jié) 樣品破碎與分離蛋白質(zhì),一、樣品的類型 1.整體樣品 是生物個(gè)體小的物種（如微生物），可以整體 取樣。 2.組織樣品 有一個(gè)采樣的過(guò)程，就是從整體部

4、分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3.細(xì)胞樣品 包括固體基質(zhì)中培養(yǎng)的細(xì)胞、體外懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng) 的細(xì)胞、周期性細(xì)胞樣品（如紅細(xì)胞、淋巴細(xì) 胞）和從組織中分離同類的細(xì)胞樣品。 4.可溶性樣品 是可溶性液體樣品，如血清、血漿、尿樣、腦 脊液以及細(xì)胞和組織的水溶性提取物。,.,二、組織與細(xì)胞破碎 為了完全分析所有的細(xì)胞內(nèi)蛋白，組織與細(xì)胞必須進(jìn) 行有效的破碎。破碎方法的選擇依賴于樣品來(lái)源（如細(xì) 胞、固體組織或者其它的生物材料），同時(shí)也依賴于這種 分析是獲得所有的蛋白質(zhì)還是特殊的亞細(xì)胞器組分。 蛋白酶在細(xì)胞破碎時(shí)很可能釋放出來(lái)，其會(huì)導(dǎo)致某些 蛋白質(zhì)降解而使雙向電泳圖譜的分析復(fù)雜化，因此蛋

5、白質(zhì) 樣品應(yīng)該利用蛋白酶抑制劑加以保護(hù)。,.,（一）溫和的裂解方法 通常應(yīng)用于組分比較簡(jiǎn)單的樣品，例如組織培養(yǎng)的細(xì)胞、血細(xì)胞和一些微生物，或者用于分析某一特定的細(xì)胞器，例如只需要裂解胞質(zhì)蛋白、完整的線粒體或其它的細(xì)胞器。,.,1. 滲透裂解 非常溫和的裂解方法，可進(jìn)一步進(jìn)行亞細(xì)胞分級(jí) 應(yīng)用對(duì)象： 血細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞。 操作步驟： 將細(xì)胞懸浮于滲透胞溶液中，細(xì)胞溶 脹而釋放出細(xì)胞內(nèi)容物。,.,2. 凍融裂解 許多類型的細(xì)胞可以通過(guò)快速反復(fù)凍融得到裂解 應(yīng)用對(duì)象：細(xì)菌細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞。 操作步驟：使用液氮，快速反復(fù)凍融至符合實(shí)驗(yàn)要 求為止。,.,3. 裂解液裂解 含有去污劑的裂解液處理細(xì)胞、組

6、織以裂解細(xì)胞 膜，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)。 應(yīng)用對(duì)象：組織培養(yǎng)細(xì)胞 操作步驟：將細(xì)胞直接置裂解液或樣品液中，進(jìn)行 懸浮處理。,.,4.酶裂解 有細(xì)胞壁的細(xì)胞可以通過(guò)酶解去除細(xì)胞壁得以溫 和裂解。 應(yīng)用對(duì)象：植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞。 操作步驟：將細(xì)胞懸浮于專一性酶的等滲溶液中。,.,（二）、劇烈的蛋白裂解 常用于難于破碎的細(xì)胞，如固體組織內(nèi)的細(xì)胞， 或具有堅(jiān)硬細(xì)胞壁的細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，這種方 法可以使細(xì)胞完全破碎裂解。,.,1. 超聲裂解法 超聲儀可以產(chǎn)生超聲波，通過(guò)切應(yīng)力來(lái)裂解細(xì) 胞。在劇烈攪拌的狀態(tài)下會(huì)產(chǎn)生剪切效果。 應(yīng)用對(duì)象：懸浮細(xì)胞 操作步驟：要進(jìn)行間歇處理，減輕產(chǎn)生熱和泡沫， 樣品

7、處理應(yīng)在冰浴中進(jìn)行。,.,2.壓力杯法 在高壓下迫使細(xì)胞穿過(guò)小孔徑而 產(chǎn)生剪切力，從而裂解細(xì)胞。 應(yīng)用對(duì)象：微生物細(xì)胞，如細(xì)菌、 霉菌、酵母細(xì)胞及含有 細(xì)胞壁的細(xì)胞。 操作步驟：將細(xì)胞懸浮液置于預(yù)冷 的壓力杯中，施加壓 力，然后收集擠出液。,.,3.研磨法 用研缽或研杵研磨細(xì)胞 應(yīng)用對(duì)象：固體組織細(xì)胞、微生物細(xì)胞。 操作步驟：組織或細(xì)胞通常凍存于液氮中，隨后研 磨成粉狀，加氧化鋁或砂有助于研磨。,.,4. 機(jī)械勻漿法 使用勻漿器破碎細(xì)胞或組織 應(yīng)用對(duì)象：固體組織，如心臟、肝 臟、腎臟組織和細(xì)胞懸 液。 操作步驟：先盡量將組織剪成塊， 然后加有蛋白酶抑制劑 的冷勻漿液進(jìn)行勻漿， 過(guò)濾或離心收集。

8、,.,5.玻璃珠勻漿法 劇烈震蕩的玻璃珠打破細(xì)胞壁，釋放細(xì)胞內(nèi)容物 應(yīng)用對(duì)象：細(xì)胞懸液或微生物 操作步驟：用等體積的預(yù)冷裂解液重懸細(xì)胞，置 于結(jié)實(shí)的管子里。每克細(xì)胞（濕重） 加入1-3克玻璃珠，劇烈震蕩1min， 冰浴1min。重復(fù)上述步驟。,.,三、用蛋白酶抑制劑防止蛋白裂解 當(dāng)進(jìn)行細(xì)胞裂解時(shí)，蛋白酶會(huì)釋放出來(lái)，這會(huì)嚴(yán)重影響電泳的結(jié)果，因此需要采取一些策略。如果可能的話，直接加入強(qiáng)變性劑。蛋白酶在低溫下無(wú)活性，因此盡可能在低溫下進(jìn)行樣品制備。另外，許多組織蛋白酶在PH超過(guò)9.0的時(shí)候會(huì)失活，因此在樣品裂解液中出現(xiàn)Tris、碳酸鈉和載體兩性電解質(zhì)時(shí)也可以抑制蛋白降解。雖然這些方法可防止蛋白降解

9、，但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持降解蛋白的活性。此時(shí)，需要應(yīng)用蛋白酶抑制劑。,., PMSF(苯甲基磺酰氟） 是一種不可逆抑制劑，通常濃度為1mmol/L,滅活絲氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，現(xiàn)用現(xiàn)加效果較好；另外，在二硫蘇糖醇（DTT）或者-巰基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能會(huì)減小，因此在含巰基的試劑中可在晚些時(shí)候加入。 AEBSF 為不可逆抑制劑，通常工作濃度為4mmol/L，作用與PMSF相似，但溶解性較好，且毒性低。但 是AEBSF可能會(huì)改變蛋白的等電點(diǎn)。,., 金屬蛋白酶抑制劑乙二胺四乙（EDTA） 乙二醇雙四乙酸（EGTA） 通常應(yīng)用

10、1mmol/L的工作濃度，通過(guò)螯合自由的金屬離子來(lái)抑制金屬蛋白酶活性。 肽蛋白酶抑制劑 亮抑酶肽（leupetin），它是可逆性蛋白酶抑制劑，在含DTT的溶液中以低濃度的形式保持活性，抑制一些絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制劑A（pepstatin A），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽（aprotinin），抑制許多絲氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是，這些蛋白酶抑制劑價(jià)格昂貴，而且它們是小肽片段，可能會(huì)出現(xiàn)在二維電泳圖譜中，其中胃蛋白酶抑制劑A在PH=9的時(shí)候不能抑制蛋白酶。,., 甲苯磺酰賴氨酸甲酮（TLCK），甲苯磺酰 苯丙氨酰氯甲酮（TPC

11、K） 通常濃度在0.1-0.15mmol/L，這些相同的成分不可逆抑制許多絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。 Benzamidine 通常濃度為1-2mmol/L，抑制絲氨酸蛋白酶。 變性劑 在低溫條件下處理。直接加入強(qiáng)變性劑8mol/L脲、 10TCA或2SDS。強(qiáng)堿下抑制酶活，許多組織蛋白酶在pH超過(guò)9.0的時(shí)候失活。,.,四、分離和提取蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)沉淀步驟） 這是一種可選擇的方法。通常用于選擇性清除雜質(zhì)，如鹽離子、核酸、脂類等會(huì)干擾二維電泳結(jié) 果。重懸之后的沉淀蛋白也可用來(lái)制備濃度稀釋的 樣品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后 并不容易重懸。因此在樣品的制備過(guò)程中，應(yīng)用沉 淀的步驟可

12、能會(huì)改變蛋白的二維電泳圖譜。,., 硫酸銨沉淀 （鹽析） 原理：在高鹽溶液中，蛋白傾向于聚合，并從溶液中沉淀下來(lái)。許多潛在的雜質(zhì)（如核酸）將保持在溶液中。 步驟：蛋白濃度大于lmg/ml，緩沖液濃度大于50mmol/L,并含有EDTA,緩慢加入硫酸銨至飽和，攪拌10-30min，通過(guò)離心沉淀蛋白。 然而許多蛋白在高鹽溶液中是可溶的，因此，這種方法只能被用來(lái)預(yù)分離或富集蛋白。并且，殘存的硫酸銨會(huì)干擾IEF,必須被清除。,., TCA沉淀（三氯醋酸沉淀） 這是一種有效的蛋白沉淀方法，將TCA加到提取液中，終濃度將高達(dá)10-20 。蛋白質(zhì)可于 冰上沉淀30min。另外，組織樣品可以直接用10 -20

13、 的TCA進(jìn)行勻漿。這種方法可限制蛋白降 解和其它的化學(xué)修飾。最后用丙酮或乙醇清洗沉 淀，以除去TCA。 然而，蛋白質(zhì)再溶解是很困難的，并且不能完全再溶。殘留的TCA必須通過(guò)乙醇或丙酮徹底清除，若過(guò)多暴露與低PH溶液中可能導(dǎo)致某些蛋白降解或修飾。,., 丙酮沉淀 這種有機(jī)溶劑通常用來(lái)沉淀蛋白，以清除許多雜質(zhì)，如去污劑、脂類。 于提取物中加入至少3倍體積的冰丙酮，使蛋白在-20沉淀至少2h，再離心沉淀蛋白。殘留的丙酮通過(guò)空氣干燥或凍干除去。,., 在丙酮中用TCA沉淀 兩者聯(lián)合應(yīng)用更加有效，通常用10TCA在丙酮中重懸裂解的樣品溶液（含有0.01 -巰基乙醇溶液或20mmol/L DTT）。至少

14、在-20沉淀45min，通過(guò)離心沉淀蛋白，并用含0.01-巰基乙醇溶液或20mmol/L DTT 的冰丙酮清洗沉淀。通過(guò)空氣干燥或凍干去除殘留的丙酮。此方法仍然存在難再溶的現(xiàn)象。,., 用苯酚提取，隨后在甲醇中用醋酸銨沉淀 這對(duì)于雜質(zhì)含量高的植物樣品很有效。 蛋白質(zhì)被提取到飽和酚中，然后在甲醇中用醋酸銨從酚相中沉淀蛋白。這些沉淀在甲醇中用醋酸銨洗滌幾次，然后用丙酮清洗，殘留的丙酮通過(guò)蒸發(fā)除去。但是這種方法比較復(fù)雜，并且耗時(shí)較多。,.,在蛋白質(zhì)樣品制備中，蛋白質(zhì)裂解是指對(duì)樣品蛋白質(zhì)進(jìn)行增溶性溶解的過(guò)程，其目的是破壞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子、蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)之間的共價(jià)與非共價(jià)相互作用；使蛋白質(zhì)變性及還原

15、；去除非蛋白質(zhì)組分，如核酸、脂類等。為了達(dá)到這一目的，在蛋白質(zhì)樣品制備過(guò)程中需使用表面活性劑、還原劑及離液劑。,第三節(jié) 蛋白質(zhì)裂解技術(shù),.,一、裂解液 在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，蛋白質(zhì)裂解是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。蛋白質(zhì)間的分開(kāi)與疏遠(yuǎn)程度關(guān)系到雙向電泳的分離效果。選擇適宜的裂解劑能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)間的良好分離，是提高雙向電泳分離效果的一個(gè)有力措施。, 離液劑 尿素是常用的離液劑，它的主要作用是改變或破壞氫鍵等次級(jí)鍵的結(jié)構(gòu)，使得蛋白變性并使蛋白酶失活。尿素作為一種中性的離液劑，通常在裂解液中的濃度為8mol/L。尿素可溶解和解折疊大多數(shù)的蛋白質(zhì)，形成完全隨機(jī)的構(gòu)象，使所有的離子基團(tuán)暴露于溶液中。近來(lái)硫脲的加入可以

16、進(jìn)一步提高溶解度，特別是膜蛋白。在實(shí)際應(yīng)用中，需要高溶解強(qiáng)度時(shí)，一般用2mol/L硫脲和5-8mol/L的尿素聯(lián)合使用。,., 還原劑 還原劑主要是用來(lái)斷裂蛋白分子中Cys殘基之間形成的二硫鍵，增加蛋白的溶解性。通常用的還原劑有-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或二硫赤蘚糖醇（DTE)和三丁基膦（TBP）,目前常用的是DTT。,., 去污劑（表面活性劑） 去污劑主要是通過(guò)破壞蛋白之間的疏水相互作用，以確保蛋白完全溶解和防止通過(guò)疏水相互作用導(dǎo)致蛋白聚合。去污劑有離子型、非離子型和兼性離子型等幾類。經(jīng)常使用的有陰離子去污劑SDS，非離子去污劑NP-40和TritonX-100，兩性離子去污劑CHAP

17、S。原則上去污劑應(yīng)該是非離子型或者是兼性離子型，這樣才不會(huì)影響蛋白質(zhì)的遷移位置。最初，兩個(gè)相似的非離子去污劑NP-40和TritonX-100被廣泛應(yīng)用。隨后研究表明：兼性離子去污劑CHAPS的效果更好。,.,二、裂解技術(shù) 裂解液的組成 裂解液基本成分包括：脲、一種或幾種去污劑（還原劑、固相PH梯度緩沖液也可以增強(qiáng)樣品的溶解性） 脲：可溶解和折疊大多數(shù)的蛋白質(zhì)，形成完全隨機(jī)的構(gòu)象，使所有的離子基團(tuán)暴露于溶液中（硫脲的加入可以進(jìn)一步提高溶解度，特別是對(duì)膜蛋白） 去污劑：確保蛋白完全溶解和防止通過(guò)疏水相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚合 還原劑：可以斷裂二硫鍵，以保持蛋白處于一種還原狀態(tài)。 載體兩性電解質(zhì)和固相

18、PH梯度緩沖液也包含于裂解液中：通過(guò)電荷與電荷之間的相互作用減少蛋白質(zhì)聚合來(lái)增強(qiáng)其溶解性。,., 裂解策略 對(duì)每一種樣品而言，適宜的裂解步驟可由經(jīng)驗(yàn)而定，其目的均是盡可能地完全溶解、解離、變性和還原蛋白質(zhì)。,.,通常可以用細(xì)胞或組織中的全蛋白組分進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析，也可以進(jìn)行樣品的分級(jí)、即采用各種方法將細(xì)胞或組織中的全蛋白分成幾部分，分別進(jìn)行蛋白質(zhì)組的研究。樣品預(yù)分級(jí)的主要方法包括根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性和蛋白質(zhì)在細(xì)胞中不同的細(xì)胞器定位進(jìn)行分級(jí)，如專門分離出細(xì)胞核、核糖體、細(xì)菌細(xì)胞壁、葉綠體、線粒體等的蛋白質(zhì)成分。樣品預(yù)分級(jí)不僅可以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測(cè)，還可以針對(duì)某一細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析

19、。,第四節(jié) 樣品預(yù)分級(jí),.,一、亞細(xì)胞器的分離 主要是利用細(xì)胞內(nèi)各種顆粒大小、形狀和密度 不同，在不同離心力場(chǎng)下進(jìn)行差速離心或在不同密 度下進(jìn)行密度梯度離心，從而獲得不同亞細(xì)胞器組 分。 細(xì)胞勻漿 取待分析的組織細(xì)胞樣品以0.9 NaCl溶液反復(fù) 清洗，加入SE緩沖液（0.25mol/L蔗糖、1mmol/L EDTA)，在低溫下研磨成勻漿備用。,., 亞細(xì)胞器的差速離心及密度梯度離心分離 1.差速離心 指在密度均一的介質(zhì)中不同大小的顆粒通過(guò)在不同離心力場(chǎng)的作用下沉降而分離。 2.密度梯度離心 指用一定的介質(zhì)在離心管中形成連續(xù)或不連續(xù)的梯度，將細(xì)胞混懸液置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使

20、細(xì)胞分層分離。 速度沉降 分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器，其原理是生物顆粒在密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降。 等密度沉降平衡 適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大的離心力和足夠長(zhǎng)時(shí)間沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)中，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。,.,二、細(xì)胞的分離,臨床樣品都是各種細(xì)胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一。如腫瘤組織中，發(fā)生癌變的往往是上皮類細(xì)胞，而這類細(xì)胞在腫瘤中總是與血管、基質(zhì)細(xì)胞等混雜。所以常采用癌和癌旁組織或腫瘤與正常組織進(jìn)行差異比較，也就是多種細(xì)胞甚至是組織蛋白質(zhì)組混合物的比較。 常采用激光捕獲微切割

21、技術(shù)分離細(xì)胞,.,三、分步裂解提取,1.目的與原理 由于蛋白質(zhì)在細(xì)胞中存在部位不同，而不同蛋白質(zhì)的溶解性亦不相同，為了提高雙向電泳的分離效果，有時(shí)需要采取分步提取的方法來(lái)盡可能的提取更多的蛋白質(zhì)。 分步提取法現(xiàn)已被用于提取各種不同組織的蛋白質(zhì)，其中通常采用以水相、有機(jī)相和表面活性劑為基礎(chǔ)的提取溶液。但是，仍然很難提取到樣品的全部蛋白質(zhì)組和低豐度蛋白質(zhì)。此外，一些疏水蛋白質(zhì)，包括膜蛋白和膜相關(guān)蛋白，以及高度抗性組織（如頭發(fā)和皮膚組織）的蛋白質(zhì)幾乎很難進(jìn)行雙向電泳分離，特別是在應(yīng)用固相pH梯度的等電聚焦中有待進(jìn)一步的研究。,.,2.方法 Molley等(1998)首先提出了順序抽提法，其步驟是和高

22、效裂解緩沖液結(jié)合起來(lái)。具體步驟如下： 水溶液的提取 約5-15mg細(xì)胞中加入2ml裂解液（40mmol/L Tris）。反復(fù)凍融3-4個(gè)循環(huán)，加入適量的DNase 和RNaseA，震蕩混勻。離心收集上清液，冷凍干燥器中抽干后即為第一步提取物。 含Urea/CHAPS/DTT溶液的提取 向第一步的沉淀中加入500ul的裂解液（8mol/L的Urea，4CHAPS，100mmol/L DTT,40mmol/ LTris，0.5 Pharmalyte 3-10，20ug/ml DNase 和5ug/ml RNaseA）劇烈震蕩混勻，離心收集上清即為第二步提取物。,., 含硫脲/SB3-10/TBP溶

23、液的提取 將上一步所余的沉淀用40mmol/L Tris清洗后，加入200ul裂解液（5 mol/L Urea，2mol/Lthiourea，2CHAPS， 2SB3-10，2mmol/L TBP, 40mmol/L Tris,0.5 Pharmalyte 3-10, 20ug/ml DNase 和5ug/ml RNase A)劇烈震蕩混勻，離心后收集上清，保存于-70,.,分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐漸增加的。第一步裂解液只含有40mmol/L Tris，其余為去離子水，只溶解偏親水性的蛋白。第二步裂解液屬傳統(tǒng)的裂解方法，含有表面活性劑CHAPS、還原劑DTT、解聚劑Urea等成分

24、，由于具有良好的溶解能力，可以溶解親水性、中性和較疏水性的蛋白、第三步裂解液中添加了能夠促進(jìn)疏水蛋白質(zhì)溶解的成分，如表面活性劑SB3-10、還原劑DTT、解聚劑thiourea，主要溶解偏疏水性的蛋白。,.,細(xì)胞器蛋白質(zhì)的提取 進(jìn)行細(xì)胞預(yù)分級(jí)：根據(jù)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中不同的細(xì)胞器定位和蛋白質(zhì)溶解性進(jìn)行分級(jí)，分離出細(xì)胞核、線粒體、高爾基體等細(xì)胞器的蛋白成分 膜蛋白的提取與分離 因其嵌合在脂雙層中，抽提時(shí)要消弱它與膜脂的疏水相互作用。 膜蛋白很難出現(xiàn)在雙向電泳凝膠圖譜上，原因是：膜蛋白是低豐度的、多為偏堿性、難溶于等電聚焦的水相介質(zhì)中的蛋白質(zhì)，因此，為了能夠從雙向電泳凝膠圖譜中分離出膜蛋白，首先必須實(shí)現(xiàn)

25、3個(gè)條件：（1）必須保證膜的脂類環(huán)境，同時(shí)，應(yīng)避免多余的脂類對(duì)等電聚焦造成干擾。（2）必須以一種可溶的形式（通常是去污劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物）從膜中分離出來(lái)（3）所提取的膜蛋白必須在等電聚焦過(guò)程中維持可溶狀態(tài)，特別是在等電點(diǎn)的位置。 核蛋白的提取與分離,三、特殊蛋白質(zhì)的提取,.,一、紫外吸收測(cè)定法 原理：蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的特性。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正相關(guān)。此外，蛋白質(zhì)溶液在280nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用在一定波長(zhǎng)下蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正相關(guān)關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)

26、定。,第五節(jié) 樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定,.,特點(diǎn)：測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物較多。在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適用于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。,1.280nm光吸收法：測(cè)定時(shí) ，將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）做空白對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)280。 2.280nm和260nm的吸收差法：核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍，但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260nm附近。純蛋白質(zhì)的光吸收比值A(chǔ)28

27、0/A260=1.8;純核酸的光吸收比值：A280/A260=0.5,.,含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml)=1.45* A280-0.74* A260 3.肽鍵測(cè)定法 （1）238nm光吸收值法：蛋白質(zhì)溶液在238nm處光吸收的強(qiáng)弱，與肽鍵的多少成正相關(guān)。因此可以用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制一系列已知濃度的蛋白質(zhì)溶液，測(cè)定238nm的光吸收值A(chǔ)238，以A238為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。,.,（2）雙縮脲法（NH3CONHCONH3),雙縮脲是兩個(gè)

28、分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能通過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)的結(jié)果靠紫色絡(luò)合物的顏色來(lái)判斷。 紫色絡(luò)合物的顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正相關(guān)，而與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。,.,4.Folin-酚試劑法,Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白質(zhì)的量成正相關(guān)。 二、考馬斯亮藍(lán)法 考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。,.,三、試劑盒測(cè)定,試劑盒：配有進(jìn)行分析或測(cè)定所必需的全部試劑的成套用品。如醫(yī)學(xué)上特定疾病診斷試劑盒、分子生物學(xué)上的核酸提取回收試劑盒、微生物學(xué)上的細(xì)菌鑒定試劑盒等。 二奎琳甲酸（BCA）蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒,.,樣品中的非蛋白的不純物質(zhì)可能干擾蛋白的分離及二維電泳圖譜的質(zhì)量，因此，在樣品制備中需考慮清除這些雜質(zhì)。 鹽離子、