代謝物識別與結(jié)構(gòu)鑒定.ppt

1、代謝物的識別與結(jié)構(gòu)鑒定,組員：周霞 周雯迪 鄭夢琳,代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定在新藥開發(fā)過程的重要地位,預(yù)防潛在的毒性,測定是否和原藥具有相同的治療作用,測定對其他治療有內(nèi)在的活性,測定是否有代謝物和已知藥物相關(guān),藥物代謝研究貫穿于創(chuàng)新藥物研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈的始終，并在藥物的發(fā)現(xiàn)及開發(fā)過程中起到越來越重要的作用。建立可靠的分析方法是研究藥物體內(nèi)代謝的前提。在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的許多階段，代謝物鑒定具有關(guān)鍵性作用。,極性代謝物的分離和保留,怎樣在復(fù)雜的數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確快速地找到代謝物,怎樣對代謝物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)，怎樣確定代謝位點(diǎn),A,C,B,一、.聯(lián)用技術(shù),聯(lián)用技術(shù),LC-MS聯(lián)用技術(shù),體內(nèi)代謝物研究過程中，因待測物濃度太

2、低，提取其純品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定是不太可能的。應(yīng)用LC-MS聯(lián)用技術(shù)可獲得復(fù)雜混合體中單一成分的質(zhì)譜圖，大大有利與藥物代謝物的分離與鑒定。,LC-MS聯(lián)用技術(shù),隨著現(xiàn)代色譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，體內(nèi)多種微量代謝產(chǎn)物的分離、鑒定已成為一個(gè)連續(xù)過程，尤其是LC-MS樣品前處理簡單，一般不要求水解或衍生化處理，可直接用于藥物及其I，相等極性較大代謝產(chǎn)物的同時(shí)分離、鑒定。運(yùn)用LC-MS技術(shù)不僅可避免復(fù)雜煩瑣的分離、純化代謝產(chǎn)物的工作，而且可分離鑒定難以辨識的體內(nèi)痕量代謝產(chǎn)物。,LC-MS聯(lián)用技術(shù),代謝物鑒定中， 常用的與LC 聯(lián)用的質(zhì)譜儀器,LC-MS特點(diǎn),樣品前處理簡單，無需衍生化，適用范圍廣,將色譜的高分離能

3、力與質(zhì)譜的高檢測靈敏度、定性專屬性集于一身,隨著接口裝置和離子化技術(shù)的發(fā)展成熟，該技術(shù)在體內(nèi)藥物分析中逐漸發(fā)展成為一種常規(guī)的分離檢測方法,實(shí)例,大鼠尿中人參皂苷 Rd及 其代謝物的 LC-MS研究,LC-MS實(shí)例,目的：探討人參皂苷 Rd在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物及轉(zhuǎn)化途徑。 方法：選擇 SD大鼠 6只 ,單劑量口服和靜脈給予人參皂苷 Rd,分段收集給藥前和給藥后 024 h尿樣 ,將尿樣分時(shí)段合并后采用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮 ,以固相萃取小柱純化處理 ,采用高效液相色譜 -串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行檢測。 結(jié)果：通過比較給藥前后的 TOF總離子流圖 ,對尿中推測的代謝物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰時(shí)間及相關(guān)化合物選擇離子

4、掃描二級質(zhì)譜圖進(jìn)行了比較分析 ,結(jié)果在尿中發(fā)現(xiàn)了 7種代謝產(chǎn)物 ,系統(tǒng)分析了這些代謝產(chǎn)物的代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律及可能結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：大鼠尿中人參皂苷 Rd的主要轉(zhuǎn)化途徑為氧化、水解、結(jié)合及異構(gòu)化代謝反應(yīng)。,離子源(ESI)電壓: - 4 kV, 去簇電勢(DP) :- 15 V, 聚焦電勢( FP) : - 80 V, 去簇電勢2 (DP2) :- 15 V, 霧化氣(NEB ) : 0135 L min- 1 簾氣(CUR) : 0120 Lmin-1 負(fù)離子方式檢測 采用TOF掃描一級質(zhì)譜 掃描質(zhì)量范圍: 4001 200 選擇離子掃描二級質(zhì)譜進(jìn)行測定,色譜柱,流動(dòng)相,其他,質(zhì)譜條件,色譜與質(zhì)譜條件

5、,為甲醇(A) -10 molL - 1乙酸銨(B) 40 min內(nèi)由體積比5050 線性梯度升至90 10, 40 55 min 維持AB = 9010,等度洗脫15 min 流速: 018 mLmin-1 分流比為1 60,柱溫為25 , 進(jìn)樣量為20L,Agilent Zorbax SBC18 (150 mm 416 mm, 5 m) Agilent Zorbax SB C18 (1215 mm 211 mm)預(yù)柱,LC-MS實(shí)例,LC-MS實(shí)例,Metabolization pathway of G-Rd,LC-MS實(shí)例,Fragment pathway of G-Rd,LC-MS/M

6、S聯(lián)用技術(shù),由于多數(shù)藥物的代謝物保留了原藥分子的骨架結(jié)構(gòu)，或一些亞結(jié)構(gòu)，因此，代謝物可能進(jìn)行與原藥相似的裂解，丟失一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征離子，用MS/MS分別進(jìn)行中性丟失掃描、母離子掃描以及子離子掃描，即可迅速找到可能的代謝物，并鑒定出結(jié)構(gòu)。,實(shí)例,LC-MS/MS 法快速高效檢測尿液中尼古丁及其 9 種代謝物,LC-MS/MS實(shí)例,以氘代尼古丁、氘代可的寧、3-OH-氘代可的寧、氘代尼古丁葡萄糖醛酸復(fù)合物、氘代可的寧葡萄糖醛酸復(fù)合物、3-OH-氘代可的寧葡萄糖醛酸復(fù)合物作內(nèi)標(biāo), 在 LC-MS/MS 的大氣壓化學(xué)電離(APCI)離子化模式下, 建立了快速檢測吸煙者尿液中尼古丁

7、及其 9 種代謝物的方法, 并對 19 個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行了測試和判別分析(DA). 實(shí)驗(yàn)前處理簡單, 色譜運(yùn)行時(shí)間僅為3.8 min. 結(jié)果表明, 尼古丁及其代謝物的精密度在 0.5%5.5%之間, 回收率在94%109%之間, 線性相關(guān)系數(shù)均大于 0.995. DA 分析充分區(qū)別開了不同量的吸煙者, 進(jìn)一步的相關(guān)性分析表明吸煙者 24 h 尿液中的尼古丁及其 9 種代謝物含量與卷煙抽吸量的分析因子之間均有較強(qiáng)正相關(guān)性.,質(zhì)譜檢測采用APCI 源 正離子化模式 氣簾氣壓力設(shè)置為0.17 MPa 霧化氣0.55 MPa 碰撞氣0.04 MPa 離子源溫度為550 離子化電流設(shè)為3 A 各代謝物的多

8、反應(yīng)監(jiān)測(MRM) 參數(shù)見表,色譜柱,流動(dòng)相,其他,質(zhì)譜條件,色譜與質(zhì)譜條件,流動(dòng)相A 為10mmol/L 醋酸銨水溶液(pH 6.8) 流動(dòng)相B 為10 mmol/L醋酸銨的甲醇溶液 流速0.5 mL/min 梯度洗脫條件: 起始A 為85%, 到0.02 min 為5% 保持至0.3 min, 0.32 min 變?yōu)?5% 保持至2 min 結(jié)束,柱溫為35 ,為Shisheido MG II 柱 (2.0 mm50 mm, 3m),LC-MS/MS實(shí)例,LC-MS/MS實(shí)例,GC-MS聯(lián)用技術(shù),氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是分析儀器中較早實(shí)現(xiàn)聯(lián)用技術(shù)的儀器。氣相色譜分離效率高、定量準(zhǔn)確，然而不足的是定性

9、較為困難，及時(shí)未知樣品純度較高，鑒定結(jié)構(gòu)也不容易。質(zhì)譜具有靈敏度高、鑒別能力強(qiáng)、響應(yīng)速度快的優(yōu)點(diǎn)，但欠缺的是對復(fù)雜得多組分樣品的分離能力。 雖然商品化的GC-MS聯(lián)用儀器出現(xiàn)較早，在藥物代謝研究中的應(yīng)用也較早，但GC法對樣品的極性和熱穩(wěn)定性有一定要求。因此，在GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析前，樣品的預(yù)處理極為重要。其代謝物的熱穩(wěn)定性、揮發(fā)性、極性可能差異較大，需要根據(jù)具體情況對樣品先進(jìn)行水解處理或衍生化處理。,實(shí)例,GC-MS/MS 法測定人頭發(fā)中的大麻酚類及其代謝物,GC-MS/MS實(shí)例,目的：建立同時(shí)檢測頭發(fā)中 9-四氫大麻酚（THC）、大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）和 9-四氫大麻酸（TH

10、C-COOH）的分析方法。 方法：頭發(fā)樣品加入氘代內(nèi)標(biāo) 9-四氫大麻酸（THC-COOH-d3），經(jīng)堿水解后，以混合溶劑V（正己烷）V（乙酸乙酯91進(jìn)行提取，吹干，殘留物經(jīng)雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，用 GC-MS/MS 方法進(jìn)行分析。 結(jié)果 ：頭發(fā)中 THC-COOH、THC、CBN 和 CBD 的最低檢出限分別為 4、4、10 和 20 pgmg-1， 各化合物在 0.045ngmg-1呈良好的線性關(guān)系（r0.999），方法精密度、準(zhǔn)確度均符合要求。 結(jié)論：本方法選擇性強(qiáng)、靈敏度高，適用于頭發(fā)中 CBD、CBN、THC 及其代謝物 THC-COOH 的分析，并成功應(yīng)用

11、于實(shí)際案例中。,質(zhì)譜檢測采用MRM 模式， 以一級質(zhì)譜分析結(jié)果為基礎(chǔ)， 選擇各目標(biāo)物的分子離子， 優(yōu)化碰撞能量CE）， 得到各目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)的二級質(zhì)譜圖。 CBD、CBN、THC、THC-COOH 和THC-COOH-d3的MS/MS見表,色譜柱,柱溫,其他,質(zhì)譜條件,色譜與質(zhì)譜條件,程序升溫：100保持1.5min， 以升溫速率25/min 升溫 至280保持5min,分流比21； 載氣：氦氣 進(jìn)樣口溫度：250 檢測器溫度：250 進(jìn)樣量：1L。,HP-1MS 石英毛細(xì)管柱 （30m0.25mm0.1m）,GC-MS/MS實(shí)例,GC-MS/MS實(shí)例,LC-NMR聯(lián)用技術(shù),近年來，LC-MS雖

12、然得到普及推廣，但MS本身不能提供足夠的分子結(jié)構(gòu)信息，因此在實(shí)際使用LC-MS鑒定藥物代謝物結(jié)構(gòu)時(shí)，往往需要借助核磁共振（NMR）的數(shù)據(jù)，才能順利完成工作。目前，在儀器分析領(lǐng)域中NMR能夠提供最大量的分子結(jié)構(gòu)信息，但該法要求樣品為純品，即在做NMR分析前必須做大量的分離、純化工作，這不利于樣品的快速分析。如果在核磁共振儀器前配置一套色譜分離設(shè)備，使樣品被LC分離后，直接進(jìn)入NMR中進(jìn)行掃描測定，就可以大大簡化分析程序，提高樣品分析速度。因此，將高分離能力的色譜與能提供最豐富結(jié)構(gòu)信息的NMR在線聯(lián)用是非常有意義的。,LC-NMR聯(lián)用技術(shù),但HPLC和NMR的聯(lián)用并不是兩種技術(shù)的簡單組合：NMR的

13、檢測靈敏度明顯低于常規(guī)的HPLC的檢測器，且作為HPLC流動(dòng)相的混合溶劑往往產(chǎn)生多重強(qiáng)溶劑峰而影響溶質(zhì)峰的正確而檢測。 由于技術(shù)上的原因，如NMR靈敏度低、液相色譜使用的氘代溶劑十分昂貴，溶劑信號對樣品的干擾等等使該聯(lián)用技術(shù)受到限制。 近年來LC/ NMR 聯(lián)用技術(shù)在研究藥物代謝產(chǎn)物,特別是相代謝產(chǎn)物方面表現(xiàn)出了非常誘人的前景,有關(guān)研究報(bào)告相繼發(fā)表。,LC-NMR實(shí)例,布洛芬在人體內(nèi)代謝物的研究便是一個(gè)很好的例子,健康男性注射400mg 布洛芬后, 收集0 4 小時(shí)的尿液, 經(jīng)HPLC/ NMR 聯(lián)用技術(shù)分析,圖譜中清晰地顯示出5個(gè)代謝產(chǎn)物:2-羥基布洛芬葡萄糖醛酸、2-羧基布洛芬葡萄糖醛酸、

14、2-羥基布洛芬、2-羧基布洛芬和布洛芬葡萄糖醛酸。采用停止流動(dòng)模式技術(shù)可以得到純的2-羥基布洛芬的1H-NMR 圖譜。,二、放射性示蹤,放射性同位素示蹤技術(shù)是利用放射性核素及其標(biāo)記物作為示蹤劑來研究生物體內(nèi)各種物質(zhì)吸收、分布、代謝、排泄( ADME) 規(guī)律的一門科學(xué)。,放射性示蹤原理,把用放射性核素標(biāo)記的物質(zhì)A引入動(dòng)物體，經(jīng)過一段時(shí)間，從排出物或組織中分離出另一化合物B，含有相當(dāng)數(shù)量的上述標(biāo)記核素，即可確定A在動(dòng)物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變?yōu)锽.,與被示蹤的物質(zhì)有同一性， 即放射性核素與其同種元素的非放射性核素在化學(xué)和生物學(xué)行為上具有高度一致性，不致擾亂和破壞體內(nèi)外生理過程的平衡狀態(tài),放射性示蹤,一,與被示

15、蹤的物質(zhì)有可區(qū)別性， 放射性核素的原子核不斷衰減，發(fā)出能被放射性探測儀所探測的射線，從而實(shí)現(xiàn)對標(biāo)記物的定量及定位。,二,放射性同位素得以廣泛應(yīng)用于活性物質(zhì)示蹤主要依賴于其最重要的兩個(gè)特點(diǎn),放射性示蹤,靈敏度高,專屬性強(qiáng),適用性廣,檢測方法簡便,在藥物ADME 研究中得到了廣泛的應(yīng)用。放射性同位素示蹤技術(shù)在藥物ADME 研究中發(fā)揮著十分重要的作用，美國FDA 已將放射性同位素標(biāo)記藥物給藥后的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)作為新藥安全性評價(jià)的重要依據(jù)，并制定了相關(guān)指南,放射性同位素示蹤劑的選擇,在藥物ADME 的研究中，常用的放射性同位素包括14C、3H、32P、33P、35 S、125 I、131 I 等。 如今隨

16、著小型正電子發(fā)射斷層掃描( positron emission tomography，PET) 儀器的發(fā)展，利用11C、13N、15O、18 F 等放射性核素進(jìn)行ADME 研究的實(shí)例也日漸增多。,放射性同位素示蹤劑的選擇,放射性同位素,Your Text Here,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?操作者安全,實(shí)驗(yàn)周期,有時(shí)可以采用雙標(biāo)記或多標(biāo)記的放射性物質(zhì),單一放射性同位素標(biāo)記的化合物,毒性,標(biāo)記位置,射線類型,半衰期,放射化學(xué)純度,比活度,放射性同位素示蹤劑的選擇,低能量的14C 和3H 是藥物ADME 研究中最常用的2 種放射性核素。這2 種核素的半衰期分別為5730 年和12. 35 年，由于其半衰期長，在實(shí)驗(yàn)周期中測得的數(shù)據(jù)一般不需要作物理半衰期的矯正，便于測量及結(jié)果計(jì)算。再者，14 C 和3H 兩種元素發(fā)射的 射線能量較低，易于防護(hù)，并可用液閃技術(shù)測得，實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果檢測十分方便。此外，14C 和3 H 還可通過放射自顯影技術(shù)進(jìn)行檢測，顯影清晰，這又進(jìn)一步擴(kuò)大了這兩種