瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)的原理和方法

1、實驗三瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)的原理和方法,主講教師和實驗員：張運峰,一 實驗目的,學習瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法 檢測堿裂解法提取質(zhì)粒的結(jié)果 檢測雙酶切法鑒定重組質(zhì)粒的結(jié)果（后續(xù)實驗） 檢測PCR法鑒定質(zhì)粒的結(jié)果（后續(xù)實驗）,二 實驗原理,（1）某物質(zhì)在電場作用下的遷移速度叫做電泳的速率，電泳的速率與核酸分子大小和構(gòu)型有關(guān)。 DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。分子質(zhì)量越小跑得越快，緊密構(gòu)型快于松散型開環(huán)分子或線性分子，從而可以分離大小不同的DNA或RNA分子。,（2）瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。濃度越高

2、，孔隙越小，其分辨能力就越強。,配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNA分子大小來確定。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。,（3）溴化乙錠為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。據(jù)此可判斷DNA分子量大小和粗略估計樣品DNA濃度。,表1 瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分子大小的關(guān)系,三 儀器、材料與試劑,1.質(zhì)粒樣品、酶切樣品和PCR樣品。 2.凝膠電泳系統(tǒng)和電泳圖像分析系統(tǒng)(凝膠成像系統(tǒng))等。 3.瓊脂糖、 1XTAE電泳緩沖液、Goldview、 6X載樣緩沖液 （ 6X loading

3、buffer）和DNA分子量標準（Marker ）等。,1.凝膠電泳系統(tǒng),DYY-6C型 雙穩(wěn)定時電泳儀電源（北京六一） 輸出范圍（顯示分辨率）：6-600V(1V) 4-400mA(1mA)240W,美國Bio-rad伯樂 小型水平電泳槽Mini-Sub Cell GT Cell,2.凝膠成像分析系統(tǒng),3.Marker,一個已知分子質(zhì)量的DNA樣品做最對照，用來確定待測樣品的相對分子質(zhì)量。,4.常用電泳緩沖液,電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。作用： 增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。 形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度和位置

4、。 使樣品呈色，使加樣操作更方便。,5.上樣緩沖液,4.常用核酸染料,溴化乙錠,溴化乙錠（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴鹽EB），EB染色（EB可很好地摻入到雙鏈DNA中），在紫外光下會發(fā)出橙紅色的熒光，用于對DNA進行染色和觀察。 用于觀察的紫外光有種波長，一般使用中波紫外光（302nm）。短波紫外光（254nm）觀察效果較好，但對DNA的破環(huán)很大。長波紫外光（366nm）：回收。,1.制備瓊脂糖凝膠（1%） 2.制備凝膠板 3.加樣 4.電泳 5.染色 6.結(jié)果觀察,四.實驗步驟,1.制備凝膠和膠板： 20ml(1TAE)+0.2g瓊脂糖（ 三角瓶 ），煮膠，溶解，冷卻至60(

5、不燙手)，倒板，室溫下充分凝固，豎直拔下梳子 。,膠板設計（27人）： 每11孔膠板（4人：2樣品+1marker）。,5l質(zhì)粒DNA+1l loading buffer 混勻； 15lPCR產(chǎn)物+3l loading buffer，混勻； 10l酶切產(chǎn)物+2l load- ingbuffer混勻； 5l DNA Marker(每板膠一孔）,2.加樣,3.電泳,電壓3-5V/cm，約80-90V，注意電極方向,4.觀察,紫外透射分析儀下觀察。,六 實驗結(jié)果,瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂糖鏈依分子內(nèi)和分子間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。,瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)形成過程,瓊脂糖單糖分子結(jié)構(gòu),瓊脂糖粉形成瓊脂糖凝膠的過程,DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開，此時電泳的遷移