發(fā)酵工業(yè)制藥par1.ppt

1、四、新型生物藥物的篩選,由于必須從隨機的經(jīng)典式篩選轉(zhuǎn)向理性篩選， 應(yīng)依據(jù)抗生素的作用機制、細菌的耐藥機制等設(shè)計 篩選模型。,四、新型生物藥物的篩選,一、常規(guī)篩選技術(shù) 瓊脂擴散法（又稱杯碟法）：在接有試驗菌的瓊脂 平板上放上玻璃或不銹鋼的無底小杯（常稱牛津杯 ），向杯內(nèi)滴入待檢的接抗菌發(fā)酵液，保溫培養(yǎng)， 抗生素由小杯滲透到周圍的瓊脂中，抑制細菌生長 ，因此在小杯周圍形成一個透明圈。圈的直徑?jīng)Q定 于抗生素的濃度。,四、新型生物藥物的篩選,一、常規(guī)篩選技術(shù) 此法常用來測定抗生素的效價，即是用抗菌效力表 示的抗生素有效含量。,四、新型生物藥物的篩選,一、常規(guī)篩選技術(shù) 測定方法：將制備好的培養(yǎng)基傾注20

2、ml于雙碟中 （直徑90mm、高15mm），水平放置使其凝固，作 為底層。然后將冷卻至約50的培養(yǎng)基與適量質(zhì) 控菌株的菌懸液混合，迅速搖勻，傾注4ml覆蓋底 層培養(yǎng)基，使其分布均勻，作為菌層，放置水平 位置充分凝固后，在菌層培養(yǎng)基上等距離放置46 個牛津杯，加入制備好的抗生素溶液，培養(yǎng)后觀察 結(jié)果，移去牛津杯測量抑菌圈直徑。,四、新型生物藥物的篩選,一、常規(guī)篩選技術(shù) 效價計算：按照上述計算實驗方法測定得到的標準 品稀釋液和樣品溶液所致的抑菌圈直徑的平均值， 繪制標準曲線，再從標準曲線查得樣品稀釋液的效 價。,四、新型生物藥物的篩選,二、定靶篩選 從臨床有效的抗生素的作用機理和細菌的耐藥 機理來

3、設(shè)計篩選模型，有目的地篩選具有某種作用 機理的抗生素，試圖獲得抗菌作用強、對耐藥菌有 效、毒性小的新抗生素。,四、新型生物藥物的篩選,二、定靶篩選 1、以作用機理為依據(jù)的篩選方法（各類抗生素的受 體） 抑制細菌細胞壁的合成 蛋白質(zhì)合成抑制劑 細菌DNA回旋酶抑制劑 改變細胞膜通透性 作用于細胞外膜的藥物篩選 作用于細菌外排泵的藥物的篩選 氨基糖類抗生素的篩選,四、新型生物藥物的篩選,二、定靶篩選 1、以作用機理為依據(jù)的篩選方法（各類抗生素的受 體） 抑制細菌細胞壁合成的抗生素：青霉素、頭孢菌素 蛋白質(zhì)合成抑制劑：四環(huán)素 改變細胞膜功能：多烯類抗生素 抑制核酸合成的抗生素：絲裂霉素C 抑制生物能

4、作用的抗生素：抗霉素,四、新型生物藥物的篩選,二、定靶篩選 2、抗生素的耐藥機制 細菌的耐藥性又稱抗藥性，一般是指細菌與藥 物多次接觸后，對藥物的敏感性下降甚至消失，致 使藥物對耐藥菌的療效降低或無效。,四、新型生物藥物的篩選,二、定靶篩選 2、抗生素的耐藥機制 耐藥性產(chǎn)生的機理主要有以下幾種: 產(chǎn)生降解抗生素（如-內(nèi)酰胺類）的酶或鈍化 酶改變抗生素的結(jié)構(gòu)（如氨基糖苷類）。 抗生素作用靶點由于發(fā)生突變或被細菌的某些酶修飾而使抗菌藥物無法發(fā)揮作用，以及抗生素使用的靶酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變使之與抗生素的親和力下降。,四、新型生物藥物的篩選,二、定靶篩選 2、抗生素的耐藥機制 細菌具有一種信賴于能量的主動

5、轉(zhuǎn)運機制，即它能夠把進入胞內(nèi)的藥物泵入胞外。 降低細胞壁的通透性，使抗生素不能進入細菌。 從下列方式獲得耐藥基因：從祖先細菌獲得；自發(fā)獲得或使原存在的耐藥基因表達加強；從其他細菌經(jīng)接合轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因；從病毒的其它細菌的質(zhì)或染色體獲得；從環(huán)境中經(jīng)質(zhì)粒或染色體介紹獲得耐藥基因。,五、新型生物的生物合成,一、微生物的代謝 微生物在代謝過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的不同 作用，可將代謝分為初級代謝和次級代謝。,五、新型生物的生物合成,一、微生物的代謝 初級代謝是指能使營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成機體的結(jié)構(gòu)物質(zhì) 和對機體有生理活性作用的物質(zhì)，或是為機體生長 提供能量的一類代謝。初級代謝的產(chǎn)物稱為初級代 謝產(chǎn)物。這類物

6、質(zhì)包括供機體進行生物合成的各種 小分子前體、單體和多聚體物質(zhì)，以及在能量代謝 中起調(diào)節(jié)作用的各種物質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)、脂肪 和核酸等。,五、新型生物的生物合成,一、微生物的代謝 次級代謝是指微生物生長到一定階段才產(chǎn)生化學結(jié) 構(gòu)復雜、對該生物無明顯生理功能，或并非是微生 物生長和繁殖所必需的物質(zhì)，如抗生素、毒素、激 素、色素等。不同種類的微生物所產(chǎn)生的次級代謝 產(chǎn)物不相同，它們可能積累在細胞內(nèi)，也可能排到 外環(huán)境中。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 次級代謝產(chǎn)物中的構(gòu)建單位稱之為生源。一般次 級代謝產(chǎn)物的生源都是直接或間接地來自于微生 物代謝過程中產(chǎn)物的一些中間產(chǎn)物或是初級

7、代謝 產(chǎn)物，這些物質(zhì)有的直接作為次級代謝產(chǎn)物的前 提，有的經(jīng)過修飾后作為特殊前體用于合成次級 代謝產(chǎn)物。雖然次級代謝產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)類型繁 多，而且結(jié)構(gòu)也比較復雜，但是它們的構(gòu)建單位 只有幾種。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 1、生源 聚酮體 即含有多個羰基的聚合物，和次級代謝產(chǎn)物脂 肪酸合成的前提相似。許多次級代謝產(chǎn)物的前體是 由聚酮體構(gòu)成。 聚酮體的形成以起始單位為基礎(chǔ)，與鏈的延伸 單位不斷縮合和脫羧，最終形成-多酮次甲基鏈 ，合成的-多酮次甲基鏈經(jīng)過不完全的還原或者 在不同位點還原，可以形成種類極多的聚酮體。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 糖

8、類 次級代謝產(chǎn)物中的糖類主要有氨基酸、糖胺、 環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇以及其他糖類等。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 不常見的氨基酸 正常氨基酸是指微生物能夠利用并用于蛋白質(zhì) 合成的-L-氨基酸，而在次級代謝產(chǎn)物中存在200 多種非蛋白質(zhì)氨基酸，如D-氨基酸，N-甲基氨基酸 、-氨基酸以及稀有的二氨基酸等，稱為不常見的 氨基酸。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 非核酸的嘌呤堿和嘧啶堿 非核酸的嘌呤堿和嘧啶堿不同于正常核酸上的 堿基，而是以正常堿基經(jīng)過化學修飾形成的。與菌 體內(nèi)核苷酸的合成途徑不同，可以直接利用培養(yǎng)基 中的各種嘌呤堿基核苷酸,五、新型生物的

9、生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 吩惡嗪酮 吩惡嗪酮是一些次級代謝產(chǎn)物的一個基本結(jié) 構(gòu)，其生物合成前提是色氨酸和一些代謝物。它 們先形成4-甲基-3-羥基-鄰氨基苯酸在吩惡嗪酮 合成酶的催化下被氧化脫水形成吩惡嗪酮。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 莽草酸 莽草酸是許多芳香氨基酸化合物，包括芳香氨 基酸、肉桂酸和某些多酚類化合物的前提。莽草酸 源自葡萄糖，是合成許多抗生素的前提。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 甲羥戊酸 在許多次級代謝產(chǎn)物中，甲羥戊酸是其重要的 構(gòu)建單位。如甲羥戊酸被磷酸化后形成甲羥戊酸-5 -焦磷酸，繼續(xù)經(jīng)脫羧和脫水作用就可

10、以形成活化形 式的異戊二烯焦磷酸，這種活化的五碳單位幾乎可 以和任何數(shù)量的單元結(jié)合，形成各種各樣的異戊二 烯類或萜類次級代謝產(chǎn)物。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 2、次級代謝產(chǎn)物生物合成的基本途徑 前體聚合：次級代謝產(chǎn)物的生源合成后，可通過綜合反應(yīng)形成聚酮體、寡肽、聚乙烯等。 修飾：次級代謝產(chǎn)物和各種單體聚合在一起，建立起基本骨架后，其中的某些基團往往還必須通過酶促反應(yīng)進行修飾，才會形成具有生理活性的物質(zhì)、這些酶促反應(yīng)包括糖基化、?；?、羥基化和氨基化反應(yīng)以及氧化還原等。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 2、次級代謝產(chǎn)物生物合成的基本途徑 不同組分

11、的裝配：次級代謝產(chǎn)物的必需的幾個部分合成后，需要按照一定的順序在特異酶的催化下組裝在一起才會形成具有生理活性的次級代謝產(chǎn)物。例如，新生霉素是由新生酶糖部分、香豆素部分、異戊烯部分和對羥基苯甲酸部分組合而成。其中新生霉素部分來自于葡萄糖，香豆素部分是由酪氨酸衍生，異戊烯部分來自于甲羥戊酸，而對羥基苯甲酸部分是由莽甲酸衍生而來，幾個組分形成后裝配在一起得到具有生理活性的新生霉素。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 3、次級代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機制 A.初級代謝對次級代謝的調(diào)節(jié) 當初級代謝和次級代謝具有共同的合成途徑 時，初級代謝的終產(chǎn)物過量，往往會抑制次級代 謝的合成。這主要

12、是因為初級代謝終產(chǎn)物抑制了 在次級代謝產(chǎn)物合成中重要的分叉中間體的合成。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 3、次級代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機制 B.碳代謝物的調(diào)節(jié) 一般情況下，凡能被微生物快速利用、促進產(chǎn) 生菌生長速度的碳源，對次級代謝產(chǎn)物生物合成都 表現(xiàn)出抑制作用。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 3、次級代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機制 C.氮代謝物的調(diào)節(jié) 在不同氮源的研究中發(fā)現(xiàn)，以蛋白質(zhì)作氮源， 可以促進次級代謝產(chǎn)物的合成，而以無機氮或簡單 有機氮等容易利用的氮作為氮源（胺鹽、硝酸鹽、 某些氨基酸）能促進菌體的生長，但卻抑制次級代 謝產(chǎn)物的合成。,五、

13、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 3、次級代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機制 D.磷酸鹽的調(diào)節(jié) 過量的磷酸鹽也像葡萄糖一樣抑制次級代謝產(chǎn) 物的合成，這種抑制作用稱為磷酸鹽調(diào)節(jié)。磷酸鹽 對次級代謝產(chǎn)物合成的影響表現(xiàn)在以下幾個方面： （1）促進初級代謝，抑制次級代謝； （2）抑制次級代謝產(chǎn)物前體的形成； （3）阻遏次級代謝產(chǎn)物合成中某些關(guān)鍵酶的合成；,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 3、次級代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機制 D.磷酸鹽的調(diào)節(jié) （4）抑制次級代謝產(chǎn)物合成中某些關(guān)鍵酶的活性； （5）增加菌體能荷狀態(tài)以及促進初級代謝。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的

14、基本途徑 3、次級代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機制 E.ATP調(diào)節(jié),磷酸烯醇 式丙酮酸,磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶,羧基轉(zhuǎn)移酶,草酰乙酸,丙酮酸,乙酰CoA,乙酰CoA 羧化酶,丙二酰CoA,ATP,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 3、次級代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機制 F.誘導調(diào)節(jié)和產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié) 誘導調(diào)節(jié)：在次級代謝過程中，有些酶為誘導酶， 需要有誘導物才能形成。 產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)：在次級代謝誒產(chǎn)物合成中，產(chǎn)物 的過量積累，也存在著像初級代謝中相似的反饋調(diào) 節(jié)現(xiàn)象。,五、新型生物的生物合成,二、微生物藥物合成的基本途徑 3、次級代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機制 G.細胞膜透性調(diào)節(jié) 細胞膜透性影