WB的轉(zhuǎn)膜和染色#優(yōu)質(zhì)參考

1、WB的轉(zhuǎn)膜和染色凝膠中蛋白的可視化在現(xiàn)階段染膠可用于確定蛋白的遷移是否均勻一致。如果您計劃將蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，則使用銅染色法，因為考馬斯染色不可逆?？捡R斯染色僅適用于以下情形：在轉(zhuǎn)膜后染膠檢查轉(zhuǎn)膜效率；不需要轉(zhuǎn)膜，只需觀察SDS-PAGE結(jié)果?？捡R斯染色切斷電源后，分離的蛋白條帶就會開始擴散（溶于水溶液）。為了防止蛋白的擴散，用40%蒸餾水、10%醋酸、50%甲醇的溶液處理凝膠，就會使大多蛋白沉淀（變得不可溶）。為了讓固定的蛋白可視化，在相同比例的水/醋酸/甲醇混合物中加入質(zhì)量比0.25%的考馬斯亮藍R-250，然后將凝膠放置溶液中，在振蕩器上室溫孵育4小時至過夜。接下來將凝膠（保存染料；可重復

2、多次使用）轉(zhuǎn)移到67.5%蒸餾水、7.5%醋酸、25%甲醇的混合溶液中，放置在振蕩器上，洗去多余的染料。染料不會結(jié)合丙烯酰胺，因此會被洗脫（留下干凈的凝膠）。但是，染料會與凝膠中的蛋白緊密結(jié)合，顯示為深藍色。銅染色法用蒸餾水簡單沖洗經(jīng)新鮮凝膠（最多30分鐘），然后轉(zhuǎn)移至0.3 M CuCl2溶液染色515分鐘。接下來用去離子水簡單清洗凝膠，在暗視野背景下觀察。蛋白在半透明藍色背景下形成清晰條帶。凝膠可以用0.10.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0重復沖洗至完全脫色。根據(jù)轉(zhuǎn)膜儀器制造商的說明，進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜流程的詳細說明可在轉(zhuǎn)膜儀器制造商的網(wǎng)站上找到，根據(jù)系統(tǒng)的不同而

3、有所區(qū)別。但是，每種方法的原理都一樣。帶電荷的蛋白（SDS提供）在電場中可以在凝膠中移動，從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，顯示蛋白的“印跡”。早期的方法依賴于擴散；現(xiàn)在在電場中進行印跡是標準方法了。轉(zhuǎn)膜可以濕轉(zhuǎn)或半干轉(zhuǎn)。濕轉(zhuǎn)由于膜的干燥而更不容易失敗，尤其推薦用于大蛋白轉(zhuǎn)膜。在兩種轉(zhuǎn)膜方法中，膜都放置在凝膠旁邊，兩者夾在濾紙中間，整個三明治結(jié)構(gòu)夾在固體載體之間，保持凝膠與膜之間的緊密接觸。在濕轉(zhuǎn)中，凝膠和膜緊緊地夾在海綿和濾紙之間（海綿濾紙凝膠膜濾紙海綿），確保凝膠與膜之間不形成氣泡。三明治結(jié)構(gòu)浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，對其施加電場。負電荷蛋白向正極移動，結(jié)合在膜上，并阻止其繼續(xù)移動。濕轉(zhuǎn)的標準緩沖液與跑膠緩沖液

4、所用的都是1xTris-甘氨酸緩沖液，但是沒有SDS，并加入了甲醇至終濃度20%。對于分子量大于100 kDa的蛋白，推薦在轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入終濃度為0.1%的SDS。在半干法轉(zhuǎn)膜中，三明治由濾紙凝膠膜濾紙組成，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸濕，直接放置在正負電極之間。在轉(zhuǎn)膜中，膜靠近正極、凝膠靠近負極，這很重要。半干轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)膜緩沖液中Tris和甘氨酸的比例不一定與濕轉(zhuǎn)一致，請參考儀器制造商的實驗方案。標準配方是48 mM Tris、39 mM甘氨酸、0.04% SDS、20%甲醇。有兩種類型的膜：硝酸纖維素膜（NC膜）和PVDF膜，實驗效果都很不錯。PVDF膜要求進行預處理：將膜裁剪為合適的大小，然后在甲醇中

5、浸泡12分鐘。之后轉(zhuǎn)移膜至冰冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中孵育5分鐘。未能在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡的膜會導致轉(zhuǎn)印時皺縮、條帶錯位。小分子和大分子蛋白的轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜緩沖液中SDS和甲醇的平衡、蛋白的大小、膠的濃度會影響轉(zhuǎn)膜效率。如下調(diào)整可以增加轉(zhuǎn)膜效率：大分子蛋白(100 kD)對于大分子蛋白，其在凝膠電泳時分離遷移較慢，從凝膠中轉(zhuǎn)膜也很慢。因此跑膠時應該使用低濃度的凝膠，8%或更低。由于低濃度的膠易碎，所以操作時需十分小心。 大分子蛋白易在凝膠里形成沉淀聚集，阻礙轉(zhuǎn)膜。在轉(zhuǎn)膜緩沖液加入終濃度0.1%的SDS，可以避免出現(xiàn)這種情況。由于甲醇易使SDS從蛋白上脫落，因此降低甲醇的濃度至10%或更低，可以防止蛋白沉淀。 降

6、低轉(zhuǎn)膜緩沖液中甲醇的比例也會促使凝膠的腫脹，讓大分子蛋白更容易轉(zhuǎn)膜。 只有使用NC膜時才必需使用甲醇。如果是 PVDF膜，在甲醇激活膜后，轉(zhuǎn)膜緩沖液中可以不加入甲醇。 選擇濕轉(zhuǎn) 4C 過夜，不建議選擇半干轉(zhuǎn)。小分子蛋白(100 kD)SDS 妨礙蛋白與膜的結(jié)合，對于小分子蛋白更是如此。因此小分子蛋白的轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜緩沖液中可以不加 SDS。保持甲醇的濃度20%。對于500 kD 的蛋白，請參考下列文獻的凝膠和緩沖液系統(tǒng)：Bolt MW and Mahoney PA (1997).High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes follow

7、ing sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.Anal Biochem, 247, 18592.更多轉(zhuǎn)膜提示： 使用鑷子，避免手指接觸膜。手指上的油和蛋白會阻礙轉(zhuǎn)膜，形成臟的印跡。 將凝膠和膜夾在濾紙中間后，兩者之間的氣泡可以通過滾筒、移液管或者 15 mL 管滾壓三明治結(jié)構(gòu)來去除，或者在裝有轉(zhuǎn)膜緩沖液的盤中組裝三明治結(jié)構(gòu)，防止氣泡形成。 確保將濾紙和膜的大小剪裁得與凝膠一致。在半干轉(zhuǎn)中，較大的突出會阻止電流通過膜。 雞來源的抗體會結(jié)合在 PVDF膜上，形成高背景。改用NC膜可以幫助降低背景染色。麗春紅染色使膜上蛋白

8、可視化要確定轉(zhuǎn)膜的成功，用TBST洗膜。將麗春紅母液按照1:100稀釋。母液是2%的麗春紅S加入30%的三氯乙酸和30%的磺基水楊酸制成。在麗春紅染色液中孵育5分鐘，然后用大量水沖洗直至水清澈、蛋白條帶顯現(xiàn)。該膜可以用TBST或水重復沖洗至完全脫色。對于PVDF膜，用甲醇重新激活后，再用TBST清洗。TBS 10x1 L溶液；24.23 g TrizmaHCl80.06 g NaCl在800mL蒸餾水中溶解用HCl將pH調(diào)至7.6將體積加至1 LTBST1 L溶液；100 mLTBS 10x900 mL蒸餾水1 mLTween 20Tween 20很粘稠，會粘在槍頭上。請確保在Tris緩沖液中

9、加入正確的劑量。使用10%的溶液比直接加入未稀釋的Tween 20更容易操作。膜的封閉封閉膜可以阻礙一抗和/或二抗非特異性的結(jié)合到膜上（膜對蛋白有很高的結(jié)合能力，因此對抗體也有很高的結(jié)合能力）。通常使用兩種封閉溶液：脫脂牛奶或BSA (Cohn fraction V)。牛奶相對便宜，但是不推薦用于磷酸化蛋白的研究；牛奶中包含的酪蛋白是一種磷酸化蛋白，可能會導致抗體的非特異性結(jié)合，形成高背景。有些抗體對BSA封閉的膜比牛奶封閉的膜信號更強，原因還不清楚。查看數(shù)據(jù)表中的應用說明，看其中是否有封閉的具體說明。配置5%的牛奶或BSA溶液，即在每100 mLTBS含Tween 20(TBST)的緩沖液中

10、加入5 g牛奶或BSA。充分混合并過濾。不過濾可能會導致斑點，在顯影時影響條帶。在搖床上4C孵育1小時。孵育后用TBST沖洗5秒。一抗孵育孵育緩沖液以建議稀釋度在TBST中稀釋抗體。如果數(shù)據(jù)表沒有標明建議稀釋度，設計稀釋梯度(1:1001:3000)，并根據(jù)結(jié)果進行優(yōu)化?？贵w過量會導致非特異性條帶。某些實驗室習慣使用封閉緩沖液，而另一些實驗室則使用不含封閉劑的TBST來孵育抗體。您可能會發(fā)現(xiàn)抗體緩沖液加或不加封閉劑，不同的抗體，結(jié)果也不盡相同，。如果沒有高背景問題，用低濃度(0.50.25%)甚至完全不加牛奶或BSA，有些抗體會產(chǎn)生更強的信號。孵育時間時間可能從幾小時到過夜不等（不超過18小時

11、），取決于抗體對蛋白的親和力和蛋白豐度。我們建議抗體更高的稀釋度、更長的孵育時間，確保特異性結(jié)合。孵育溫度最好低溫孵育。如果在封閉緩沖液中孵育過夜，必須在4C孵育，否則會出現(xiàn)污染從而破壞蛋白（尤其是磷酸化基團）。建議在搖床上孵育，充分均勻覆蓋膜，防止結(jié)合的不均勻。二抗孵育用TBST清洗膜數(shù)次，每次清洗5分鐘或更長，去除殘余一抗。孵育緩沖液與稀釋度以建議的稀釋度在TBST中稀釋抗體。如果數(shù)據(jù)表沒有推薦的稀釋度，設計稀釋梯度(1:1,0001:2,0000)，并根據(jù)結(jié)果進行優(yōu)化?？贵w過量會導致非特異條帶。您可以在封閉緩沖液中孵育二抗，但是在降低背景時可能會犧牲特異性信號的強度，這可能是因為封閉蛋白會阻礙抗體目標蛋白的結(jié)合。孵育時間和溫度搖床上室溫孵育12小時。選擇哪個偶聯(lián)物？我們推薦辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗，不推薦堿性磷酸酶(ALP)偶聯(lián)的二抗，因為其靈敏度較低。顯影方法檢測試劑盒對于HRP偶聯(lián)的抗體，通常使用加強的化學發(fā)光(ECL)試劑盒作為底物。我們提供不同檢測靈敏度的HRP底物。X射線膠片自動化X射線膠片儀，簡單易用，被廣泛使用。切記，過曝的膠片不適合進行分析，因為無法確定蛋白的相對量。且過曝的膠片會