2020版藥典微生物變更細(xì)則

1、-1-,新版藥典變更解讀 微生物相關(guān),分析質(zhì)檢中心微生物組2020年05月,涉及內(nèi)容,藥典三部： 生物制品通則：生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程 總論：微生態(tài)活菌制品總論（變更）,通則,1101 無菌檢查法（變更） 1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法 1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法 1107 非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn) 3605 細(xì)菌生化反應(yīng)培養(yǎng)基 1421 滅菌法 ,9202 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導(dǎo)原則 9203 藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則 9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則（變更） 9205 藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則（變更）,通則,新增,滅

2、菌用生物指示劑指導(dǎo)原則（新增） 生物指示劑耐受性檢查法指導(dǎo)原則（新增） 細(xì)菌 DNA 特征序列鑒定法（新增）,一、生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程,菌毒種，系指直接用于制造和檢定生物制品的細(xì)菌、支原體、立克次體或病毒等 生產(chǎn)和檢定用菌毒種，來源途徑應(yīng)合法，并經(jīng)國務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。,微生物檢測用菌來源： CMCC:中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心 CICC:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 ATCC:美國微生物菌株保藏中心,生物制品生產(chǎn)用菌毒種應(yīng)采用種子批系統(tǒng)。每批主種子批和工作種子批均應(yīng)按各論要求保管、檢定和使用。 菌毒種的傳代及檢定實驗室應(yīng)符合國家生物安全的相關(guān)規(guī)定。 各生產(chǎn)單位質(zhì)量管理部門對

3、本單位的菌毒種施行統(tǒng)一管理。,保管菌毒種應(yīng)有嚴(yán)格的登記制度，建立詳細(xì)的總賬及分類賬。收到菌毒種后應(yīng)立即進(jìn)行編號登記，詳細(xì)記錄菌毒種的學(xué)名、株名、歷史、來源、特性、用途、批號、傳代凍干日期和數(shù)量。在保管過程中，凡傳代、凍干及分發(fā)，記錄均應(yīng)清晰，可追溯，并定期核對庫存數(shù)量。 收到菌毒種后一般應(yīng)及時進(jìn)行檢定。用培養(yǎng)基保存的菌種應(yīng)立即檢定,生產(chǎn)用菌毒種應(yīng)按各論要求進(jìn)行檢定,銷毀四類菌毒種須經(jīng)單位領(lǐng)導(dǎo)批準(zhǔn)。銷毀后應(yīng)在賬上注銷，作出專項記錄，寫明銷毀原因、方式和日期。,二、微生態(tài)活菌制品總論,微生態(tài)活菌制品必須由非致病的活細(xì)菌組成，無論在生產(chǎn)過程、制品貯存和使用期間均應(yīng)保持穩(wěn)定的活菌狀態(tài)。它可由一株、多株

4、或幾種細(xì)菌制成單價或多價聯(lián)合制劑。根據(jù)其不同的使用途徑和方法可制備成片劑、膠囊顆粒劑或散劑等多種劑型。,基本要求： 微生態(tài)活菌制品的制備方法、工藝應(yīng)能保證成品含有足夠的活菌數(shù)量，保持其穩(wěn)定性，同時應(yīng)防止外源因子的污染。生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原材料及輔料、水、器具、動物等應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。,生產(chǎn)用菌種,生產(chǎn)用菌種應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定,名稱及來源； 種子批的建立：三級種子批應(yīng)分別凍干，置適宜溫度保存；種子批傳代應(yīng)限定傳代次數(shù)，原始種子批和主種子批啟開后傳代次數(shù)不得超過10代，工作種子批啟開后至發(fā)酵培養(yǎng)傳代次數(shù)不得超過5代。,生產(chǎn)用菌種,種子批的檢定：應(yīng)依據(jù)最新版

5、伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊和伯杰氏細(xì)菌命名手冊的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行，形態(tài)、生長代謝特性檢查。原始種子或主種子還應(yīng)做遺傳特性和抗生素敏感性等檢查。,三級種子批常規(guī)檢查包括以下3 項： （1） 培養(yǎng)特性及染色鏡檢； （2） 生化反應(yīng)； （3） 毒性試驗,原始種子或主種子批還需進(jìn)行以下檢查 （1） 細(xì)菌代謝產(chǎn)物脂肪酸測定 （2） 遺傳特性分析 （3） 抗生素敏感性試驗 （4） 穩(wěn)定性試驗,生產(chǎn)用菌種,原始種子和主種子應(yīng)凍干保存于8以下，工作種子應(yīng)置于適宜溫度保存,檢定,微生態(tài)活菌制品質(zhì)量檢定應(yīng)包括菌粉檢定、半成品檢定和成品檢定,菌粉檢定,1. 外觀 2. 目的菌檢查 取少量菌粉加入適量滅菌生理氯化鈉溶液或其他

6、適宜稀釋液后，涂布在適宜瓊脂平皿上，在適宜條件下培養(yǎng)，其培養(yǎng)物的生長特性和染色鏡檢的特征應(yīng)符合生產(chǎn)用菌種特征 。 3. 雜菌檢查 方法和結(jié)果判斷見本總論附錄3。如不符合規(guī)定應(yīng)廢棄。 4. 干燥失重 5. 活菌數(shù)測定 測定每克菌粉中含有的活菌數(shù)量。方法見本總論附錄2。,半成品的檢定,半成品須做雜菌檢查，根據(jù)用藥途徑確定雜菌檢查的質(zhì)控指標(biāo)。方法和結(jié)果判斷見本總論附錄3。,成品檢定,1. 鑒別試驗 檢查成品中所含的目的菌是否符合生產(chǎn)用菌種的特性。即按上述“種子批的檢定”方法進(jìn)行生長特性、染色鏡檢和生化反應(yīng)檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 2. 理化檢查 3. 活菌數(shù)測定 按本總論附錄2方法測定每克制品中的活菌數(shù)，

7、應(yīng)符合規(guī)定。多價制品應(yīng)分別測定各單價活菌數(shù)。 4. 雜菌檢查 方法和結(jié)果判斷與半成品的“雜菌檢查”項相同。 5. 安全試驗（新版已刪除）,附錄2 微生態(tài)活菌制品活菌數(shù)測定法,無菌稱取3.0g制品或菌粉（膠囊取內(nèi)容物），加入27.0ml稀釋液中，充分搖勻，做10倍系列稀釋（最終稀釋度根據(jù)不同的指標(biāo)要求而定）。取最終稀釋度的菌液100l，滴入選擇性瓊脂培養(yǎng)基平皿上，共做3個平皿，并以玻棒涂布均勻，置適宜條件下培養(yǎng)，到期觀察每個平皿菌落生長情況，并計數(shù)。當(dāng)平皿菌落數(shù)小于10或大于300時，應(yīng)調(diào)整最終稀釋度，重新測定。 活菌數(shù)（CFU/g）=3個平皿菌落數(shù)之和/3*10*最終稀釋度,附錄3 微生態(tài)活菌

8、制品雜菌檢查法,微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法系檢查微生態(tài)活菌制品的菌粉、半成品及成品受外源微生物污染程度的方法。檢查項目包括控制菌檢查，非致病性雜菌、真菌計數(shù)。,變更：,附錄3 微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法,新增：,由于供試品本身含有大量活菌，可能在雜菌檢查所用的培養(yǎng)基上生長，干擾雜菌回收或結(jié)果判斷，在建立或修訂方法時應(yīng)考慮其適用性，充分了解供試品活菌在雜菌檢查培養(yǎng)基上的生長特性。除本附錄收載的雜菌檢查用培養(yǎng)基之外，亦可采用其他經(jīng)驗證的培養(yǎng)基。,附錄3 微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法,新增：,如果供試品本身對某些試驗菌具有較強的抑菌性能，影響試驗菌的回收。在此情況下，應(yīng)根據(jù)原輔料的雜菌負(fù)載、生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特

9、性進(jìn)行風(fēng)險評估，保證檢驗方法的可靠性；在藥品生產(chǎn)、貯藏各個環(huán)節(jié)中，應(yīng)嚴(yán)格遵循GMP的指導(dǎo)原則，以降低產(chǎn)品受雜菌污染的風(fēng)險。,附錄3 微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法,新增：,控制菌檢查法檢出意思致病菌時，可參考“微生物鑒定指導(dǎo)原則（通則9204）”的提示進(jìn)行后續(xù)確證，確證的方法應(yīng)選擇已被認(rèn)可的菌種鑒定方法。,檢驗量及供試品的準(zhǔn)備,檢驗量，即一次試驗所用的供試品量（g）。檢驗時，應(yīng)從2個以上最小包裝單位中隨機抽取不少于3倍檢驗用量的供試品。 菌粉、半成品以及成品為散劑和顆粒劑的可直接稱取備用；成品為片劑、膠囊劑的需研碎后備用。,供試品檢查 陽性對照試驗 供試品進(jìn)行控制菌檢查時，應(yīng)做陽性對照試驗。取陽性對

10、照菌于相應(yīng)選擇性培養(yǎng)基平皿上劃線接種，按供試品的控制菌檢查方法培養(yǎng)，觀察菌落生長情況。陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陰性對照試驗 取增菌液0.1ml，照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長。,控制菌檢查,100l,大腸埃希氏菌； 志賀菌、沙門菌； 銅綠假單胞菌； 金黃色葡萄球菌； 梭菌； 白色念珠菌；,變更：,大腸埃希氏菌,志賀菌、沙門菌,銅綠假單胞菌,增加：,若平皿上未見菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為非控制菌，判供試品未檢出銅綠假單胞菌,銅綠假單胞菌,刪除：綠膿菌素試驗,金黃色葡萄球菌,刪除：血漿凝固酶試驗,控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查,變更:,非致病性雜菌、真

11、菌計數(shù),陽性對照 除另有規(guī)定外，真菌以白色念珠菌為對照菌，其他以金黃色葡萄球菌為對照菌 變更為：當(dāng)采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行檢查時，真菌計數(shù)以白色念珠菌為對照菌，非致病雜菌計數(shù)以金黃色葡萄球菌為對照菌,因供試品為活菌制品，應(yīng)選用能抑制目的菌生長的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行檢查。除另有規(guī)定外，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于非致病性雜菌的計數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于真菌計數(shù)。,排除目的菌干擾的,也可采用其它經(jīng)驗證的培養(yǎng)基,真菌計數(shù),稱取供試品1g，加到9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液或其他適宜稀釋液中，混勻，做10倍系列稀釋，取適宜稀釋度供試品溶液0.1ml加到已備好的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，以玻棒涂勻，一

12、式3份，倒置，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時，每天觀察結(jié)果，記錄平皿上生長的真菌菌落數(shù).,結(jié)果計算：以3個平皿上生長的菌落平均數(shù)計算。真菌數(shù)（CFU/g）=3個平皿菌落數(shù)之和/3*10*稀釋倍數(shù),計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查,變更:,增加：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）、沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）,三、9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則（變更）,本指導(dǎo)原則為非無菌產(chǎn)品微生物限度控制菌檢查中疑似菌的鑒定，以及藥物原料、輔料、制藥用水、中間體中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品和環(huán)境等中檢出微生物的鑒定提供指導(dǎo)。當(dāng)微生物的鑒定結(jié)果有爭議時，以伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊現(xiàn)行版的鑒

13、定結(jié)果為準(zhǔn)。,微生物鑒定需達(dá)到的水平視情況而定，包括種、屬鑒定和菌株分型。大多數(shù)非無菌藥品生產(chǎn)過程和部分無菌生產(chǎn)環(huán)境的風(fēng)險評估中，對所檢出微生物的常規(guī)特征包括菌落形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)（桿狀、球狀、細(xì)胞群、孢子形成模式等）、革蘭染色或其它染色法、及某些能夠給出鑒定結(jié)論的關(guān)鍵生化反應(yīng)（如氧化酶、過氧化氫酶和凝固酶反應(yīng)）進(jìn)行分析，一般即可滿足需要；非無菌產(chǎn)品的控制菌檢查一般應(yīng)達(dá)到種屬藥典規(guī)定的水平；無菌試驗結(jié)果陽性和、無菌生產(chǎn)模擬工藝（如培養(yǎng)基灌裝）失敗、環(huán)境嚴(yán)重異常事件時，對檢出的微生物鑒定至少達(dá)到種屬水平，必要時需達(dá)到菌株水平,微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定，鑒定時，一般先將待檢菌進(jìn)行初步

14、的分類。鑒定的方法有表型微生物鑒定和基因型微生物鑒定，根據(jù)所需達(dá)到的鑒定水平選擇鑒定方法。 未知菌鑒定時通過與微生物鑒定系統(tǒng)中的標(biāo)準(zhǔn)參考微生物（模式菌株、標(biāo)準(zhǔn)菌株或經(jīng)確認(rèn)的菌株等）的特征（基因型和/或表型）相匹配來完成 在日常的微生物鑒定試驗中，用戶應(yīng)明確所采用鑒定系統(tǒng)的局限性及所要達(dá)到的鑒定水平（屬、種、菌株），選用最適合要求的鑒定技術(shù)，必要時采用多種鑒定方法確定。,待檢菌的分離純化,最常用的分離純化方法是挑取待檢菌在適宜的固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離純化，以獲取待檢菌的純培養(yǎng)物（單個菌落）,必要時可進(jìn)一步進(jìn)行純培養(yǎng)，為表型鑒定和隨后的鑒定程序提供足夠量菌體。,初篩試驗,常見的初篩試驗包括形態(tài)觀

15、察、革蘭染色、芽孢染色、鏡檢（或氫氧化鉀拉絲試驗）、觀察染色結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)、重要的生化反應(yīng)等。,氧化酶試驗 用于區(qū)分不發(fā)酵的革蘭陰性桿菌（氧化酶陽性）和腸道菌（氧化酶陰性）。 過氧化氫酶試驗 用于區(qū)分葡萄球菌（過氧化氫酶陽性）和鏈球菌（過氧化氫酶陰性）。 凝固酶試驗 用于區(qū)分凝固酶陰性葡萄球菌（可推測為非致病性）和凝固酶陽性葡萄球菌（很可能為致病性）。,表型微生物鑒定,表型微生物鑒定,除受其遺傳基因的控制外，還與微生物的分離環(huán)境、培養(yǎng)基和生長條件等因素有關(guān) 在表型鑒定時應(yīng)注意采用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)對鑒定結(jié)果的影響,四、3605 細(xì)菌生化反應(yīng)培養(yǎng)基,測定細(xì)菌的糖類代謝試驗、氨基酸和蛋白

16、質(zhì)代謝試驗、碳源和氮源利用試驗等生化反應(yīng),糖、醇發(fā)酵培養(yǎng)基 七葉苷培養(yǎng)基 磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基（MR-VP反應(yīng)） 蛋白胨水培養(yǎng)基（靛基質(zhì)試驗） 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 克氏雙糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 脲（尿素）培養(yǎng)基 苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基 氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基 明膠培養(yǎng)基 丙二酸鈉培養(yǎng)基 枸櫞酸鹽培養(yǎng)基 硝酸鹽胨水培養(yǎng)基 石蕊牛奶培養(yǎng)基 半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,五、細(xì)菌 DNA 特征序列鑒定法（新增）,細(xì)菌 DNA 特征序列鑒定法系以特征核酸序列作為目標(biāo)檢測物，用于藥用原料、輔料、制藥用水、中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品、包裝材料和環(huán)境等藥品全生命周期質(zhì)量控制中細(xì)菌的鑒定。 開展細(xì)菌鑒定試驗的環(huán)境應(yīng)具備分子生物學(xué)實驗室的基

17、本條件，并符合相應(yīng)級別的生物安全要求。,六、1101 無菌檢查法（變更）,培養(yǎng)基的變更：,制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在 225、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在 3 周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。,在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/53，否則，須經(jīng)100水浴加熱至粉紅色消失（不超過 20 分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。,培養(yǎng)基的適用性檢查,無菌性檢查 每批培養(yǎng)基隨機取不少于 5 支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng) 14 天，應(yīng)無菌生長。 靈敏度檢查 菌液制備： 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培

18、養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng) 1824 小時； 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng) 23 天 2448 小時， 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng) 57 天，加入 35ml 含 0.05（ml/ml）聚山梨酯 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。,培養(yǎng)接種 取每管裝量為 12ml 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 7 支，分別接種小于不大于 100cfu 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各 2 支，

19、另 1 支不接種作為空白對照，培養(yǎng)不超過 3 天； 取每管裝量為 9ml 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 7 支,分別接種小于不大于 100cfu 的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各 2 支，另 1 支不接種作為空白對照，培養(yǎng)不超過 5 天。逐日觀察結(jié)果。 結(jié)果判定 空白對照管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定,薄膜過濾法,薄膜過濾法一般應(yīng)采用封閉式薄膜過濾器，根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。無菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45m。濾膜直徑約為 50mm，若使用其他尺寸的濾膜，應(yīng)對稀釋液和沖洗液體積進(jìn)行調(diào)整,并重新驗證。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性

20、。,水溶性液體供試品,水溶性供試液過濾前應(yīng)先將少量的沖洗液過濾，以潤濕濾膜。 取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含不少于 100ml 適宜稀釋液的無菌容器中，混勻，立即過濾。,七、9202 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導(dǎo)原則,為更好應(yīng)用非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（通則1105）、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106）及非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（通則1107），特制定本指導(dǎo)原則,供試液制備方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法應(yīng)盡量選擇微生物計數(shù)方法中操作簡便、快速的方法，同時，所選用的方法應(yīng)避免損傷供試品中污染的微生物。 對照培養(yǎng)基由中國食品藥品檢定

21、研究院研制及分發(fā)。 控制菌檢查法沒有規(guī)定進(jìn)一步確證疑似致病菌的方法。若供試品檢出疑似致病菌，確證的方法應(yīng)選擇已被認(rèn)可的菌種鑒定方法，如細(xì)菌鑒定一般依據(jù)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊。 藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中，藥用原料、輔料及中藥提取物僅規(guī)定檢查需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)。因此，在制定其微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)根據(jù)原輔料的微生物污染特性、用途、相應(yīng)制劑的生產(chǎn)工藝及特性等因素，還需控制具有潛在危害的致病菌。,八、1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法,微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計數(shù)。 當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗

22、，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。 微生物計數(shù)試驗環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測。 如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對微生物無毒性。 供試液制備時如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。,計數(shù)方法,計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-Number Method，簡稱MPN法。MPN法用

23、于微生物計數(shù)時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。,供試品微生物計數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。 供試品微生物計數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計數(shù)。 若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗。,供試品檢查,檢驗量： 一般應(yīng)隨機抽取不少于2個最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗。 一般供試品的檢驗量為10g或10ml；膜劑為100cm2,按計數(shù)方法適用性試驗確認(rèn)的計數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測定需氧

24、菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)。 陰性對照試驗 以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。,結(jié)果判斷,需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）； 霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）。 若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測定。,九、1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法,控制菌

25、檢查法系用于在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。 當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)按下列規(guī)定進(jìn)行檢驗，包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等。 供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。,供試品檢查,供試品的控制菌檢查應(yīng)按經(jīng)方法適用性試驗確認(rèn)的方法進(jìn)行。 陽性對照試驗 陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加量應(yīng)不大于100cfu。陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陰性對照試驗 以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)査。,檢驗項目,耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-

26、Tblerant Gram-Negative Bacteria） 大腸埃希菌（Escherichia coli） 沙門菌（Salmonella） 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 梭菌（Clostridia） 白色念珠菌（Candida albicans）,十、1107 非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn),十一、1421 滅菌法,滅菌法系指用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)手段將物品中活的微生物殺滅或除去，從而使物品殘存活微生物的概率下降至預(yù)期的無菌保證水平的方法。本法適用于制劑、原料、輔料及醫(yī)療器械等物品的滅菌。 對于任何一批滅

27、菌物品而言，絕對無菌既無法保證也無法用試驗來證實。一批物品的無菌特性只能相對地通過物品中活微生物的概率低至某個可接受的水平來表述，即無菌保證水平（sterility assurance level，簡稱 SAL）。實際生產(chǎn)過程中，滅菌是指將物品中污染微生物的概率下降至預(yù)期的無菌保證水平。最終滅菌的物品微生物存活概率，即無菌保證水平不得高于10-6。 滅菌物品的無菌保證不能依賴于最終產(chǎn)品的無菌檢驗，而是取決于生產(chǎn)過程中采用合格的滅菌工藝、嚴(yán)格的GMP管理和良好的無菌保證體系,濕熱滅菌法,該法滅菌能力強，為熱力滅菌中最有效、應(yīng)用最廣泛的滅菌方法。 濕熱滅菌條件的選擇應(yīng)考慮被滅菌物品的熱穩(wěn)定性、熱穿

28、透力、微生物污染程度等因素。濕熱滅菌條件通常采用12115min、12130min或11640min的程序，也可采用其他溫度和時間參數(shù)，但無論采用何種滅菌溫度和時間參數(shù)，都必須證明所采用的滅菌工藝和監(jiān)控措施在日常運行過程中能確保物品滅菌后的SAL10-6。,對熱穩(wěn)定的物品，滅菌工藝可首選過度殺滅法，以保證被滅菌物品獲得足夠的無菌保證值。 采用濕熱滅菌時，被滅菌物品應(yīng)有適當(dāng)?shù)难b載方式，不能排列過密，以保證滅菌的有效性和均一性。 濕熱滅菌法應(yīng)確認(rèn)滅菌柜在不同裝載時可能存在的冷點。當(dāng)用生物指示劑進(jìn)一步確認(rèn)滅菌效果時，應(yīng)將其置于冷點處。本法常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子,濕熱滅菌法,干熱滅菌法

29、,干熱滅菌條件一般為（160170）120min以上、（170180）60min以上或25045min以上，也可采用其他溫度和時間參數(shù)。無論采用何種滅菌條件，均應(yīng)保證滅菌后的物品的SAL10-6。采用干熱過度殺滅后的物品一般無需進(jìn)行滅菌前污染微生物的測定。25045min的干熱滅菌也可除去無菌產(chǎn)品包裝容器及有關(guān)生產(chǎn)灌裝用具中的熱原物質(zhì)。 常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子,十二、滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則（新增）,生物指示劑是一種對特定滅菌程序有確定及穩(wěn)定的耐受性的特殊微生物制成品，可用于滅菌設(shè)備的性能確認(rèn)、特定物品的滅菌工藝研發(fā)及建立、產(chǎn)品滅菌程序的驗證、生產(chǎn)過程滅菌效果的監(jiān)控、滅菌程序的定期

30、再驗證、隔離器和無菌潔凈室滅菌效果的驗證評估等。,生物指示劑的分類 生物指示劑用微生物的基本要求 不同滅菌工藝使用不同的生物指示劑，制備生物指示劑所選用的微生物應(yīng)具備以下特征： （1） 菌種的耐受性應(yīng)大于需滅菌物品中所有可能污染菌的耐受性。 （2） 菌種應(yīng)無致病性。 （3） 菌株應(yīng)穩(wěn)定，存活期長，易于保存。 （4） 易于培養(yǎng)。生物指示劑的芽胞含量要在 90%以上 生物指示劑的制備,生物指示劑的應(yīng)用,生物指示劑的性能評估 接收商品化生物指示劑時，應(yīng)進(jìn)行微生物純度和形態(tài)的鑒定及測定微生物數(shù)量。生物指示劑應(yīng)在有效期內(nèi)使用，必要時應(yīng)重新進(jìn)行耐受性檢查。, 芽胞數(shù)范圍在 1.0 106至 5.0 106

31、。 芽胞數(shù)范圍在 1.0 106至 5.0 107。 芽胞數(shù)范圍在 1.0 105至 5.0 106,用戶應(yīng)科學(xué)的選擇和使用生物指示劑.在滅菌程序的建立、確定、驗證和日常監(jiān)控中,需對滅菌產(chǎn)品（包括其材料和包裝）進(jìn)行全面了解,確保滅菌參數(shù)能達(dá)到所需的 SAL 水平。生物指示劑的初始微生物的數(shù)量、耐受性（菌體耐受性）和放置的位置、方式等情況都會影響其滅活效果。需通過實驗室研究確定產(chǎn)品各組成部分是否比產(chǎn)品內(nèi)的溶液或藥品更難滅菌。根據(jù)產(chǎn)品中最難滅菌的部位，制定不同的工藝參數(shù)以確保無菌保證水平小于 106。,十三、生物指示劑耐受性檢查法指導(dǎo)原則（新增）,本指導(dǎo)原則用于指導(dǎo)生物指示劑的耐受性以及相關(guān)質(zhì)量參

32、數(shù)的測定，也可用于生產(chǎn)過程污染微生物的耐受性測定。,總芽胞計數(shù): 培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（芽孢懸液制備）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（芽孢計數(shù)） 熱激活 培養(yǎng)和計數(shù),生物指示劑的總芽胞數(shù)一般為標(biāo)示值的 50%300%。,十四、9203 藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則,藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則用于指導(dǎo)藥品微生物檢驗實驗室的質(zhì)量控制 藥品微生物的檢驗結(jié)果受很多因素的影響，如樣品中微生物可能分布不均勻、微生物檢驗方法的誤差較大等。因此，在藥品微生物檢驗中，為保證檢驗結(jié)果的可靠性，必須使用經(jīng)驗證的檢測方法并嚴(yán)格按照藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則要求進(jìn)行檢驗。,藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原

33、則包括以下幾個方面：人員、培養(yǎng)基、試劑、菌種、環(huán)境、設(shè)備、樣品、檢驗方法、污染廢棄物處理、檢測結(jié)果質(zhì)量保證和檢測過程質(zhì)量控制、實驗記錄、結(jié)果的判斷和檢測報告、文件等。,1、人員 從事藥品微生物試驗工作的人員應(yīng)具備微生物學(xué)或相近專業(yè)知識的教育背景,2、培養(yǎng)基,微生物實驗室使用的培養(yǎng)基可按處方配制，也可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。 結(jié)塊或顏色發(fā)生改變的脫水培養(yǎng)基不得使用。 脫水培養(yǎng)基應(yīng)完全溶解于水中，再行分裝與滅菌。 應(yīng)確定每批培養(yǎng)基滅菌后的pH值（冷卻至室溫25測定）。若培養(yǎng)基處方中未列出pH值的范圍，除非經(jīng)驗證表明培養(yǎng)基的pH值允許的變化范圍很寬，否則，pH值的范圍不能超過規(guī)定值0.

34、2。 自配的培養(yǎng)基應(yīng)標(biāo)記名稱、批號、配制日期、制備人等信息，并在已驗證的條件下貯藏。商品化的成品培養(yǎng)基標(biāo)簽上應(yīng)標(biāo)有名稱、批號、生產(chǎn)日期、失效期及培養(yǎng)基的有關(guān)特性。 培養(yǎng)基滅菌后不得貯藏在高壓滅菌器中，瓊脂培養(yǎng)基不得在0或0以下存放。,2、培養(yǎng)基,使用過的培養(yǎng)基（包括失效的培養(yǎng)基）應(yīng)按照國家污染廢物處理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行 實驗室配制或商品化的成品培養(yǎng)基的質(zhì)量依賴于其制備過程，常規(guī)監(jiān)控項目是pH值、適用性檢查試驗，定期的穩(wěn)定性檢查以確定有效期 除藥典附錄另有規(guī)定外，在實驗室中，若采用已驗證的配制和滅菌程序制備培養(yǎng)基且過程受控，那么同一批脫水培養(yǎng)基的適用性檢查試驗可只進(jìn)行1次。如果培養(yǎng)基的制備過程未經(jīng)驗證

35、，那么每一滅菌批培養(yǎng)基均要進(jìn)行適用性檢查試驗。 用于環(huán)境監(jiān)控的培養(yǎng)基須特別防護(hù)，最好要雙層包裝和終端滅菌，如果不能采用終端滅菌的培養(yǎng)基，那么在使用前應(yīng)進(jìn)行100%的預(yù)培養(yǎng)以防止外來的污染物帶到環(huán)境中及避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。,3、試劑,微生物實驗室應(yīng)有試劑接收、檢查和貯藏的程序。 實驗室應(yīng)標(biāo)明所有試劑、試液及溶液的名稱、制備依據(jù)、適用性、濃度、效價、貯藏條件、制備日期、有效期及制備人。,4、菌種,藥品微生物檢驗用的試驗菌應(yīng)來自認(rèn)可的國內(nèi)或國外菌種保藏機構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株,5、環(huán)境,微生物限度檢查應(yīng)在不低于D級背景下的B級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行 環(huán)境

36、監(jiān)測按藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則（通則9205）進(jìn)行 所用的消毒劑種類應(yīng)滿足潔凈實驗室相關(guān)要求并定期更換。,6、設(shè)備,儀器設(shè)備應(yīng)有合格證書，實驗室在儀器設(shè)備完成相應(yīng)的檢定、校準(zhǔn)、驗證、確認(rèn)其性能，并形成相應(yīng)的操作、維護(hù)和保養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程后方可正式使用，儀器設(shè)備使用和日常監(jiān)控要有記錄。,7、樣品,試驗樣品的采集，應(yīng)遵循隨機抽樣的原則，并在受控條件下進(jìn)行抽樣，須采用無菌操作技術(shù)進(jìn)行取樣，防止樣品受到微生物污染而導(dǎo)致假陽性的結(jié)果 抽樣容器應(yīng)貼有唯一性的標(biāo)識，注明樣品名稱、批號、抽樣日期、采樣容器、抽樣人等 如果樣品存在數(shù)量不足、包裝破損、標(biāo)簽缺失、溫度不適等，實驗室應(yīng)在決定是否檢測或拒

37、絕接受樣品之前與相關(guān)人員溝通。,8、檢驗方法,藥典方法或標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法是經(jīng)過驗證的，當(dāng)進(jìn)行樣品檢驗時，應(yīng)進(jìn)行方法適用性確認(rèn)。 如果檢驗方法不是藥典或標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法，使用前應(yīng)進(jìn)行替代方法的驗證，確認(rèn)其應(yīng)用效果優(yōu)于或等同于藥典方法。替代方法的驗證按藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則（通則9201）進(jìn)行。,9、結(jié)果的判斷和檢測報告,引起微生物污染結(jié)果不符合標(biāo)準(zhǔn)的原因主要有兩個：試驗操作錯誤或產(chǎn)生無效結(jié)果的試驗環(huán)境條件；產(chǎn)品本身的微生物污染總數(shù)超過規(guī)定的限度或檢出控制菌。 異常結(jié)果出現(xiàn)時，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。偏差調(diào)查時應(yīng)考慮實驗室環(huán)境、抽樣區(qū)的防護(hù)條件、樣品在該檢驗條件下以往檢驗的情況、樣品本身具有使

38、微生物存活或繁殖的特性等情況。 如果試驗操作被確認(rèn)是引起實驗結(jié)果不符合的原因，那么應(yīng)制定糾正和預(yù)防措施，按照正確的操作方案進(jìn)行實驗,十五、9205 藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則（變更）,本指導(dǎo)原則是用于指導(dǎo)藥品微生物檢驗用的潔凈室等受控環(huán)境微生物污染情況的監(jiān)測和控制。 本指導(dǎo)原則包括人員要求、初次使用的潔凈實驗室參數(shù)確認(rèn)、微生物監(jiān)測方法、監(jiān)測頻次及監(jiān)測項目、監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)、警戒限和糾偏限、數(shù)據(jù)分析及偏差處理、微生物鑒定和微生物控制。,確認(rèn),初次使用的潔凈實驗室應(yīng)進(jìn)行參數(shù)確認(rèn)，確認(rèn)參數(shù)包括物理參數(shù)、空氣懸浮粒子和微生物。 藥品潔凈實驗室物理參數(shù)的測試應(yīng)當(dāng)在微生物監(jiān)測方案實施之前進(jìn)行。 主要的物理參數(shù)包括高效空氣過濾器完整性、氣流組織、空氣流速（平均風(fēng)速），換氣次數(shù)、壓差、溫度和相對濕度等。一般首先在靜態(tài)下測試，符合要求后再在模擬正常檢測條件下進(jìn)行測試