食品微生物檢測技術(shù)的研究分析方案進(jìn)展

1、食品微生物檢測技術(shù)地研究進(jìn)展摘要：隨著食品工業(yè)地迅速發(fā)展，建立食品微生物快速檢測方法，對食品生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售過程中質(zhì)量地監(jiān)控具有十分重要地意義.本文從生化、免疫學(xué)、代謝學(xué)、分子生物學(xué)等幾個(gè)方面介紹了幾種食品安全檢測地方法與技術(shù)，并概述這 些檢測技術(shù)對食品安全地重要作用及影響.關(guān)鍵字：食品微生物檢測技術(shù)；研究(關(guān)鍵詞改了一下)酶聯(lián)免疫；PCR；基因芯片；流式細(xì)胞術(shù)Detection Technology Research Progress of Food Microbiologyb5E2R。Abstract: With the rapid development of food industry

2、，the establishment of foodmicrobiology rapid detection method for the quality monitoring during food production, transportation and sales is of great significance. In this paper, several food safety detection methods and technologies were introduced based on biochemistry, immunology, metabolism, mol

3、ecular biology and instrument of testing methods and techniques, and summarized the importance and impact of these tests on the food safety.Key words: Detection technology; ELISA; PCR; gene chip; flow cytometryp1Ean。隨著人們生活水平不斷提高，食品安全問題越來越受到重視，微生物對食 品食品安全地影響也相應(yīng)地備受關(guān)注.特別是近年來世界各國都相繼發(fā)生地重大 地食品安全事件，從而給食品安全

4、敲響了警鐘.因此，靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、簡便快捷地食品安全檢測技術(shù)和方法，建立和完善食品安全微生物檢測技術(shù)和 體系迫在眉睫1.近幾年各國地許多機(jī)構(gòu)和學(xué)者都致力于快速檢測技術(shù)和方法地 研究，已改進(jìn)和開發(fā)了一些快速地檢測技術(shù)和方法，微生物檢測技術(shù)已由培養(yǎng) 水平逐步向分子水平邁進(jìn)，本文對食品中微生物地快速檢測方法進(jìn)展情況進(jìn)行 綜述，以利于對食品進(jìn)行篩選和檢測，最終達(dá)到預(yù)防腸道傳染病和食物中毒地發(fā)生地目地.DXDiT。1.生化檢測技術(shù)生化檢測技術(shù)包括了生化試劑盒（生化鑒定管法）、鑒別培養(yǎng)基法、快速測試片法和快速生化檢測儀器法.生化試劑盒(生化鑒定管)地原理就是將多種常用地細(xì)菌生化分析試劑、培養(yǎng)基集成

5、在特定地微型化地裝置中，將傳統(tǒng)方法中需要多次完成地實(shí)驗(yàn)改進(jìn)為一次完成，其優(yōu)點(diǎn)是能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得結(jié)果，從而節(jié)約了樣品地分析時(shí)間， 節(jié)約成本，提高了檢驗(yàn)速度2.RTCrp。鑒別培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使難以區(qū)分地微生物經(jīng)培養(yǎng)后呈現(xiàn)出明顯差別，因而有助快速鑒別某種微生物地一種培養(yǎng)基.例如對大腸桿菌 O157:H7 進(jìn)行檢測地 SMAC 瓊脂培養(yǎng)基等，其主要原理是細(xì)菌產(chǎn)生特定地代謝產(chǎn)物同培養(yǎng)基中生化物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，從而根據(jù)不同地顏色進(jìn)行判斷3.5PCzV?？焖贉y試片法是指以紙片、膠片等作為培養(yǎng)基載體，將特定地培養(yǎng)基和顯 色物質(zhì)附著在載體上面，通過微生物在其上地生長、顯色來測定食品中微

6、生物 地方法.其具有以下優(yōu)點(diǎn)：可測定少量檢品、操作簡便、易消毒保存、價(jià)格低廉、污染小、能真實(shí)反應(yīng)檢品中地細(xì)菌數(shù)等4.目前已商品化地微生物測試片有：菌 落總數(shù)測試片、大腸菌群測試片、霉菌和酵母菌測試片、沙門氏菌測試片和金 黃色葡萄球菌測試片.jLBHr。微生物地自動化檢測具有操作標(biāo)準(zhǔn)化、簡便、快捷、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)，是微生物檢測發(fā)展地方向之一.國內(nèi)外現(xiàn)在已有很多全自動微生物分析系統(tǒng)問世， 如 Vitek 系統(tǒng)、Biolog 系統(tǒng)、Midd 系統(tǒng)、Sensititre 系統(tǒng)、Autosceptor 系統(tǒng)、BAX 系統(tǒng)和 Phoenix 細(xì)菌鑒定/藥敏試驗(yàn)系統(tǒng)等，其中法國生物梅里埃地 Vitek- A

7、ms 系統(tǒng)已被 AOAC 列為法定分析法.xHAQX。2 免疫學(xué)技術(shù)免疫學(xué)技術(shù)包括免疫熒光技術(shù)(IFT)、免疫擴(kuò)散技術(shù)(IDT)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）和酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)(VIDAS)LDAYt。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性地?zé)晒馍貥?biāo)記在抗體(或抗原) 上，與其相應(yīng)地抗原(或抗體)結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng).可用來對沙門氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E.ColiO157 和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等進(jìn)行快速檢測.王軍等6建立了養(yǎng)殖大黃魚病原溶藻弧菌地間接熒光抗體免疫快速檢測技術(shù).此技術(shù)地主要特點(diǎn)有特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快.但還存在不足，如非特異性染色問題

8、尚未完全解決，結(jié)果判定地客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜.Zzz6Z。免疫擴(kuò)散技術(shù)(IDT)，在免疫擴(kuò)散技術(shù)中，抗原抗體在凝膠內(nèi)擴(kuò)散，特異性地抗原抗體相遇后，在凝膠內(nèi)地電解質(zhì)參與下發(fā)生沉淀，形成可見地沉淀線.免疫擴(kuò)散使用地凝膠種類很多，除瓊脂外還有明膠、果膠、聚丙烯酰胺等.張莎等7運(yùn)用瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)來檢測珍稀雉類新城疫病毒.dvzfv。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA），酶聯(lián)免疫吸附法是將抗原抗體反應(yīng)地高度特異性和酶地高效催化作用相結(jié)合發(fā)展建立地一種免疫分析方法)其基木原理是將受檢樣品和酶標(biāo)抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相抗原或抗體起反應(yīng)形成復(fù)合物，固相載體上酶標(biāo)抗原或抗體被結(jié)合

9、量(免疫復(fù)合物)即與標(biāo)木中待檢抗體或抗原地量成一定比例，加入酶底物后顯色，最后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量確定樣品中待測物含量.rqyn1。酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)將酶系統(tǒng)與熒光免疫分析結(jié)合起來，在普通酶免疫分析地基礎(chǔ)上用理想地?zé)晒獾孜锎嫔孜铮涂商岣叻治龅仂`敏度和增寬測量范圍，減少試劑地用量.酶放大技術(shù)、固相分離及熒光檢測三者地聯(lián)合將成為熒光免疫分析中最靈敏地方法.陳思強(qiáng)等8采用自動酶聯(lián)熒光免疫分析系統(tǒng)檢測凍肉中沙門氏菌.Emxvx。隨著生物技術(shù)地迅猛發(fā)展，在繼基因芯片以后又誕生了免疫芯片技術(shù).免疫芯片是指包被在固相載體上地高密度抗原或抗體微點(diǎn)陣，是在載體上已設(shè)計(jì)好地微陣列方式固定多種抗體

10、或抗原，用標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原，利用配體間特異地相互作用方式進(jìn)行反應(yīng)、結(jié)合，然后通過特定地掃描裝置進(jìn)行檢測，結(jié)果由計(jì)算機(jī)分析處理.高志賢等9已將該技術(shù)用于檢測葡萄球菌腸毒素.SixE2。3 代謝學(xué)技術(shù)代謝學(xué)技術(shù)包括電阻抗技術(shù)、微熱量計(jì)技術(shù)、放射測量技術(shù)和接觸酶測定技術(shù)電阻抗技術(shù)是指細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖地過程中會使培養(yǎng)基中地大分子 電惰性物質(zhì)如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類等，代謝為具有電活性地小分子物質(zhì)， 如乳酸鹽、醋酸鹽等，這些離子態(tài)物質(zhì)能增加培養(yǎng)基地導(dǎo)電性，使培養(yǎng)基地阻抗發(fā)生變化，通過檢測培養(yǎng)基地電阻抗變化情況即可判定細(xì)菌在培養(yǎng)基中地生長繁殖特性.該法已用于食品中細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌、沙門氏菌、

11、酵母菌、霉菌和支原體地檢測，具有高敏感性、特異性、快反應(yīng)性和高度重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn).陳廣全等已用該法檢測食品中沙門氏菌10.6ewMy。3.2 微熱量計(jì)技術(shù)微熱量計(jì)技術(shù)是通過測定細(xì)菌生長時(shí)熱量地變化進(jìn)行細(xì)菌地檢出和鑒別.微生物在生長過程中產(chǎn)生熱量，用微量熱計(jì)測量產(chǎn)熱量等數(shù)據(jù)，均存儲于計(jì)算機(jī)中，經(jīng)過適當(dāng)信號上地?cái)?shù)字模擬界面，在記錄器上繪制成以產(chǎn)熱量對比時(shí)間組成地?zé)崆€圖.根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)所得地?zé)崆€圖，和已知細(xì)菌熱曲線圖直觀比較， 即對細(xì)菌進(jìn)行鑒別.劉永軍等采用該技術(shù)研究細(xì)菌地抑制作用11.kavU4。3.3 放射測量技術(shù)放射測量技術(shù)是根據(jù)微生物在生長繁殖過程中代謝碳水化合物產(chǎn)生 CO2 地原理，把微量地

12、放射性 14C 標(biāo)記引入碳水化合物或鹽類等底物分子中進(jìn)行檢測地.在微生物生長時(shí)，這些底物被利用并釋放出含放射性 CO2，然后通過 14C 自動化放射測定儀 Bactec 測量 CO 地含量，從而根據(jù)碳 14CO2 含量地多少來判斷微生物地?cái)?shù)量.y6v3A。3.4 接觸酶測定技術(shù)接觸酶測定技術(shù)是通過計(jì)算一個(gè)含有接觸酶地紙盤，在盛有 H2O2 地試管中地漂浮時(shí)間來估計(jì)菌數(shù).接觸酶與 H2O2 之間產(chǎn)生生化反應(yīng)，放出氧氣，使紙盤由試管底部浮到表面.當(dāng)樣品中接觸酶含量高時(shí)，紙盤上浮地時(shí)間短.大多數(shù)腐敗微生物是嗜冷性細(xì)菌.而大多數(shù)嗜冷細(xì)菌接觸酶呈陽性，故可以用接觸酶反應(yīng)來估計(jì)食品中地嗜冷性菌群.M2ub

13、6。4 分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)包括核酸探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)和基因芯片4.1 核酸探針技術(shù)核酸探針技術(shù)是將已知核苷酸序列 DNA 片段用同位素或其他方法標(biāo)記， 加入已變性地被檢 DNA 樣品中，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列地DNA 區(qū)段形成雜交雙鏈，從而達(dá)到鑒定樣品中 DNA 地目地.根據(jù)核酸探針中核苷酸成分地不同，可將其分成 DNA 探針或 RNA 探針根據(jù)選用基因地不同分成兩種，一種探針能同微生物中全部 DNA 分子中地一部分發(fā)生反應(yīng)，它對某些菌屬、菌種、菌株有特異性，另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組DNA 發(fā)生雜交反應(yīng)，它對某種微生物中地一種菌株或僅對微

14、生物中某一菌屬有特異性.0YujC。核酸探針檢測技術(shù)地最大優(yōu)點(diǎn)是：特異性和敏感性.但探針檢測技術(shù)中也存在一定地問題，如檢測一種菌就需要制備一種探針；要達(dá)到檢測量還要對樣品進(jìn)行一定時(shí)間地培養(yǎng)；eUts8。4.2 聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)是體外選擇性擴(kuò)增 DNA 或 RNA 地技術(shù).它以待擴(kuò)增地兩條核苷酸鏈為模板，由人工合成地寡核苷酸介導(dǎo)，通過核酸聚合酶促反應(yīng)快速擴(kuò)增核酸序列.它具有快速、靈敏、簡單和特異等特點(diǎn)，該技術(shù)能在短時(shí)間內(nèi)對特定 DNA 序列作百萬倍擴(kuò)增.sQsAE。PCR 技術(shù)在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中地應(yīng)用很廣泛，可直接檢測標(biāo)本中地大腸桿菌，檢測痢疾桿菌、金葡菌各種

15、毒素、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、肉毒梭菌、乳酸桿菌等食品中常見地微生物.利用 PCR 檢測食品中地微生物，多數(shù)情況下因樣品中存在著不同程度地干擾因子或抑制因子，影響 PCR 地?cái)U(kuò)增效率，導(dǎo)致假結(jié)果地產(chǎn)生.為克服這一缺陷，可將 PCR 與其它一些化學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)聯(lián)合使用，以提高反應(yīng)地特異性.但不能有排除或代替常規(guī)微生物檢驗(yàn)方法.GMsIa。4.3 基因芯片基因芯片技術(shù)是上個(gè)世紀(jì)末誕生地一項(xiàng)新型生物技術(shù).它是將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品 DNA 經(jīng) PCR 擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確 定檢測樣品是否存在某些特異微生

16、物.基因芯片技術(shù)理論上可以在一次實(shí)驗(yàn)中檢出所有潛在地致病原，也可以用同一張芯片檢測某一致病原地各種遺傳學(xué)指標(biāo)， 檢測地靈敏度、特異性和快速便捷性都很高，因而在致病原分析檢測中有很好 地發(fā)展前景.TIrRG。此外還有流式細(xì)胞術(shù)、旋轉(zhuǎn)平板技術(shù)和激光菌落掃描儀以及免疫磁性微粒技術(shù).5 儀器法流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是采用流式細(xì)胞儀對單個(gè)細(xì)胞或其他生物微粒進(jìn)行快 速定性、定量分析與分選地一門技術(shù).流式細(xì)胞儀主要由細(xì)胞流動室(包括樣品管、鞘液管)、激光聚焦區(qū)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等 4 部分組成，其工作原理是 將被檢測對象制備成一定濃度地細(xì)胞(微粒)懸液，經(jīng)熒光染色后放入流式細(xì)胞儀地樣品管中，細(xì)胞在氣體地

17、壓力下進(jìn)入鞘液管，在鞘液地約束下，細(xì)胞(微粒)排列成單列從流動室地噴嘴高速噴出成為細(xì)胞(微粒)液粒，經(jīng)熒光染色后地細(xì)胞經(jīng)過激光聚焦區(qū)時(shí)受激光激發(fā)，產(chǎn)生散射光和熒光信號，通過一些波長選擇通透性濾光片，可以將不同波長地散射光和熒光信號區(qū)分而將單個(gè)細(xì)胞(微粒)液滴分離，并由計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象及數(shù)據(jù)處理.現(xiàn)在該技術(shù)已經(jīng)能夠檢測純化地 DNA 可達(dá) pg 級水平，在 10min 內(nèi)可以完成數(shù)據(jù)地收集和分析.Tapp 等使用類似方法對蘇云金桿菌產(chǎn)生地毒素進(jìn)行檢驗(yàn)和示蹤，結(jié)果顯示 FCM 比斑點(diǎn) ELISA 法更敏感、快速.7EqZc。5.2 旋轉(zhuǎn)平板技術(shù)和激光菌落掃描儀自動旋轉(zhuǎn)平板技術(shù)是在瓊脂培養(yǎng)基表面倒一薄

18、層樣品，該儀器可使液體樣 品以螺旋轉(zhuǎn)動方式分布，液體慢速流出后，隨著平板地旋轉(zhuǎn)從中心向邊緣分布， 樣品分布非常均勻.這種方法可廣泛用于細(xì)菌、酵母、霉菌及乳類樣品中.樣品倒入平板后，菌落數(shù)可以用激光菌落計(jì)數(shù)器來計(jì)數(shù)，即將光檢測儀放置在儀器地 底部，激光儀從上面自動掃描平板，當(dāng)激光束通過菌落時(shí)，可以降低光地強(qiáng)度， 從而檢測出菌落地存在.這樣菌落數(shù)可以通過電子計(jì)數(shù)，從而不是傳統(tǒng)地視覺計(jì)數(shù).lzq7I。5.3 免疫磁性微球免疫磁性分離方法，是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病微生物發(fā)生特異性結(jié)合，載有致病微生物地磁性顆粒在外加磁場地作用下向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，使致病微生物不但得

19、到分離，而且也得到濃集.免疫磁性分離技術(shù)與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比具有顯著地優(yōu)點(diǎn)，可以很快地在含有大量雜菌地懸液有選擇性地分離出目地微生物，并節(jié)省時(shí)間.zvpge。綜上所述，微生物快速檢測技術(shù)都各自表現(xiàn)出很多地優(yōu)點(diǎn)，但也還存在著 不足，需要國內(nèi)外研究者不斷地完善和改進(jìn)現(xiàn)有地檢測技術(shù).同時(shí)，建立更靈敏、更有效、更可靠、更簡便地微生物檢測技術(shù)也是保證食品安全地迫切需求和食品微生物快速檢測技術(shù)地發(fā)展趨勢.NrpoJ。參考文獻(xiàn)：1 林蕾，張煒.食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)地研究進(jìn)展.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)J，2008 年 10 月第 15 卷第10 期.1nowf。2閆雪，姚衛(wèi)蓉，錢和.國內(nèi)外食品微生物快速檢測技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展.食品科學(xué)J，2005，Vol.26，No.6，269.fjnFL。3宋宏新，馬娜.食品中病原微生物快速檢測方法研究進(jìn)展J.食品研究與開發(fā)，2005，26(2):127-130.tfnNh