第十二單元移植免疫學(xué)檢測(cè).ppt

1、第十二單元,移植免疫學(xué)檢測(cè),實(shí)驗(yàn)一 HLA微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn),微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（Microcytotoxicity assay）是在經(jīng)典的補(bǔ)體依賴的淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（complement dependent cytotoxicity，CDC）基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于器官移植供、受者間的交叉配型、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的封閉抗體檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。在器官移植的文獻(xiàn)中提及的CDC法多指微量淋巴細(xì)胞毒法。,微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)概念,器械 微量淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)板（泰薩奇板）、倒置熒光顯微鏡、 微量移液器、吸管、溫箱、離心機(jī)、磁架等 。 試劑 淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll, 1.077)、T/B淋巴

2、細(xì)胞分離磁珠及洗滌液、凍干補(bǔ)體、熒光染色液、供者全血23ml（EDTA或ACD抗凝）、受者血清2ml、陰性對(duì)照血清（可用1640培養(yǎng)液或PBS替代）、陽(yáng)性對(duì)照血清（抗全淋 巴細(xì)胞抗體ALG/ATG）。,實(shí)驗(yàn)器材和材料,淋巴細(xì)胞的分離（Ficoll法）： 1. 將供者全血用PBS(pH7.4)緩沖液 按1:1稀釋，混勻備用； 2. 取15ml離心管一支，加入一定體積的Ficoll液，用吸取稀釋后的供者全血，沿試管壁緩慢加入，使全血置于Ficoll上層。Ficoll液與稀釋后的全血體積之比為1:2； 3. 15002000rpm/min（半徑15cm水平轉(zhuǎn)子）離心10min； 4. 取出離心管，吸

3、取中間白膜層，置于另一干凈離心管中； 5. 加入PBS，洗滌； 6. 2000rpm/min離心5min，傾出上清液； 7. 重復(fù)步驟5、6； 8. PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為2109/L。,實(shí)驗(yàn)方法,淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)（一步法） 1. 于泰薩奇板每孔中加入5l石蠟油，以防反應(yīng)物揮發(fā)； 2. 建立反應(yīng)格局，每位待測(cè)標(biāo)本均應(yīng)設(shè)立陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照； 3. 分別于各相應(yīng)孔中加入1l淋巴細(xì)胞（混合淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）、1l待測(cè)血清以及2l補(bǔ)體； 4. 2225溫度下孵育1h； 5. 熒光染色液染色并終止反應(yīng)。,結(jié)果應(yīng)在染色后10分鐘內(nèi)觀察，以防熒光猝滅。特殊情況不能立即觀察時(shí)，應(yīng)將反應(yīng)板用避光紙

4、包緊，置于4冰箱中，盡早觀察結(jié)果。死亡細(xì)胞由于熒光染料進(jìn)入而呈紅色（染料中的EB與DNA結(jié)合），體積略為增大?；罴?xì)胞因?yàn)榧?xì)胞膜完整而呈明亮的綠色（染料中的CFDA與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合），具有強(qiáng)折光性。,結(jié)果觀察,根據(jù)死亡細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比來(lái)計(jì)分，目前普遍采用國(guó)際通用的NIH計(jì)分方法，如下表。判斷死細(xì)胞的百分比需要操作者具備一定的工作經(jīng)驗(yàn)，大致原則為：可疑2分，30為4，過(guò)半記6，強(qiáng)陽(yáng)寫8。,結(jié)果判斷,淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)記分標(biāo)準(zhǔn),1. 每份標(biāo)本都必須設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照； 2. 溫度過(guò)低有可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果； 3. 只有當(dāng)陰性和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果準(zhǔn)確時(shí)，該實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性和陰性結(jié)果方能成立。,注意事項(xiàng),淋巴細(xì)胞毒試

5、驗(yàn)是測(cè)定患者機(jī)體內(nèi)是否含有特異性針對(duì)供者的淋巴細(xì)胞毒抗體，檢測(cè)的是HLA特異性的IgG和IgM抗體，包括HLA-I類抗體和II類抗體。由于混合淋巴細(xì)胞中主要為T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞數(shù)量較少，而HLA-II類抗體在T淋巴細(xì)胞表面不表達(dá)，僅在B淋巴細(xì)胞表面表達(dá)，因而，利用混合淋巴細(xì)胞進(jìn)行CDC試驗(yàn)時(shí)，對(duì)HLA-I類抗體陰性、II類抗體陽(yáng)性的患者，易產(chǎn)生漏檢，而造成這種結(jié)果的原因是由于混合淋巴細(xì)胞中B淋巴細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例較少所致。 為了更加真實(shí)、全面地反應(yīng)患者的免疫狀態(tài)，我們應(yīng)該如何改善上述局限性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié) 果造成的影響？,南方醫(yī)科大學(xué) 裘宇容,實(shí)驗(yàn)討論,實(shí)驗(yàn)二 群體反應(yīng)性抗體檢測(cè),群體反應(yīng)抗體（

6、Pannel reactive antibody）是指存在于某些人體內(nèi)的抗人類白細(xì)胞(HLA)抗體，可通過(guò)輸血、輸血小板、妊娠以及器官移植等免疫途徑獲得。PRA測(cè)定即是檢測(cè)患者體內(nèi)是否存在HLA抗體、抗體的水平高低以及抗體特異性如何。PRA對(duì)于患者是否發(fā)生排斥、移植物的存活狀態(tài)以及器官功能的實(shí)現(xiàn)都有著不可忽視的作用。,群體反應(yīng)性抗體的概念,實(shí)驗(yàn)原理,將涵蓋不同地域、不同人種的HLA-I類和II類純化IgG抗原預(yù)先包被于泰薩奇微孔板中，與待測(cè)、血清反應(yīng)，再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，孵育后加入酶作用底物，待顯色反應(yīng)完成后終止反應(yīng)。如果待測(cè)血清中存在HLA-I類抗體，則相應(yīng)的HLA-I類混合抗原孔中

7、會(huì)發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，反應(yīng)孔呈現(xiàn)藍(lán)色的陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果；若無(wú)相應(yīng)抗體，則反應(yīng)孔中為無(wú)色陰性結(jié)果。,器械： 各種移液器、吸頭、溫箱、離心機(jī) 、微量酶標(biāo)儀等。 試劑： 抗原微孔板（以LAT mix tray為例） 對(duì)照血清（10serum control） 去離子水(sterile deionized water) 酶標(biāo)二抗（100alkaline phosphatase-conjugated anti-human IgG) 抗體稀釋液（1antibody diluent） 洗液（10wash buffer） 底物A和B（1colorimetric enzyme substrate A&B） 反

8、應(yīng)終止液（1stop reagent）,實(shí)驗(yàn)器材和材料,試劑準(zhǔn)備 1. 在第一次使用時(shí)，至少提前20min取出凍干對(duì)照血清以2ml去離子水輕輕搖震使其徹底溶解。將溶解后的對(duì)照血清溶液分裝，每管100l，儲(chǔ)存在-20冰箱中，每次實(shí)驗(yàn)前取出，恢復(fù)至室溫后使用； 2. 將洗液用去離子水(sterile deionized water)按1：9稀釋，可根據(jù)工作頻率一次性配制一定量的工作液，4冰箱貯存?zhèn)溆茫?3. 將待測(cè)標(biāo)本用抗體稀釋液（antibody diluent)按1：2稀釋，約60l/test； 4. 酶標(biāo)二抗（alkaline phosphatase-conjugated anti-huma

9、n IgG)在第一次洗滌之前用抗體稀釋液按1：100稀釋，50l/test； 5. 底物A、B (colorimetric enzyme substrate A&B)在第二次洗滌之前按1：1比例混勻，50l/test。,實(shí)驗(yàn)方法,酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng) 1. 根據(jù)反應(yīng)格局表，將待測(cè)血清和各種對(duì)照品加入相應(yīng)的孔中，每孔10l（陰性對(duì)照孔加入抗體稀釋液，陽(yáng)性對(duì)照孔和質(zhì)控孔加入對(duì)照血清）； 2. 蓋好反應(yīng)板，2225孵育60min； 3. 用力將反應(yīng)板中的血清甩出，并在墊有紙巾的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上叩擊反應(yīng)板兩至三次，在加入下一液體前，請(qǐng)注意加蓋，保持反應(yīng)孔濕潤(rùn)； 4. 于每孔中加入洗液(wash buffer)

10、20-30l， 輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板，甩出洗液，叩擊反應(yīng)板兩至三次； 5. 再重復(fù)步驟9兩次； 6. 加入10ul酶標(biāo)二抗，輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板, 2225孵育40min； 7. 重復(fù)步驟9三次； 8. 每孔加入10l混合好的底物，37避光孵育1015min（一般不要超過(guò)15min）； 9. 待質(zhì)控孔和陽(yáng)性對(duì)照變成深藍(lán)色后, 每孔加入5l 終止液(stop reagent)，蓋上反應(yīng)板，15分鐘后觀察結(jié)果。,肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果，藍(lán)色或深藍(lán)色為陽(yáng)性, 無(wú)色為陰性，陽(yáng)性結(jié)果的顏色深淺程度與待測(cè)標(biāo)本HLA抗體水平的高低成正比。有條件時(shí)可在微量酶標(biāo)儀上讀取吸光度值，并根據(jù)陰、陽(yáng)性對(duì)照的吸光度值判定標(biāo)本的陰、陽(yáng)性。盡

11、量在顯色終止反應(yīng)后1小時(shí)內(nèi)讀取反應(yīng)結(jié)果，上機(jī)前請(qǐng)移去反應(yīng)板蓋。如因特殊情況需延遲觀察結(jié)果時(shí)，請(qǐng)將反應(yīng)板貯存于25冰箱中，此情況下可能會(huì)引起反應(yīng)孔吸光度值降低，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。,觀察結(jié)果,注意事項(xiàng),洗滌 洗滌是ELISA實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵的步驟，如洗滌不充分，則可能出現(xiàn)本底過(guò)高的現(xiàn)象；但洗滌過(guò)度，亦可能丟失一些陽(yáng)性反應(yīng)； 溫度 除二抗反應(yīng)過(guò)程外，本實(shí)驗(yàn)以2225為宜，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不同性質(zhì)的干擾； 對(duì)于強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本，可加大稀釋倍數(shù)后再進(jìn)行檢測(cè)； 本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)為陽(yáng)性結(jié)果的評(píng)價(jià)和判斷，因此，如果操作者具備豐富的HLA專業(yè)基礎(chǔ)知識(shí)，將會(huì)大大提高本實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷的可靠性和準(zhǔn)確性。,結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 1

12、. 依據(jù)實(shí)驗(yàn)條件不同，各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果具有不同的波動(dòng)范圍； 2. 當(dāng)空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及質(zhì)控孔的OD值均在試劑盒可接受范圍時(shí)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠； 3. 肉眼判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)根據(jù)反應(yīng)孔的顏色深淺計(jì)分，計(jì)分方法同“微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)”，以0，2，4，6，8分來(lái)表示反應(yīng)由弱至強(qiáng)的程度。 4. 對(duì)于HLA混合抗體檢測(cè)，建議4分以上為陽(yáng)性。對(duì)于2分結(jié)果的定義是本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)，應(yīng)結(jié)合患者機(jī)體免疫狀態(tài)而定。,結(jié)果分析,Cut-off值的確定 不同的HLA抗體檢測(cè)試劑盒，可設(shè)置不同的調(diào)節(jié)Cut-off值，建議在HLA抗體初篩時(shí)適當(dāng)下調(diào)Cut-off值； 對(duì)于HLA抗體特異性及抗體水平的檢測(cè)，可根據(jù)試劑

13、盒類型（LAT1240/1288/1HD/240）相應(yīng)上調(diào)Cut-off值。 調(diào)節(jié)Cut-off值的計(jì)算： 調(diào)節(jié)Cut-off（陽(yáng)性孔均值空白均值）校正系數(shù)空白均值 PRA值的計(jì)算 PRA陽(yáng)性孔數(shù)/總檢測(cè)孔數(shù)100%,南方醫(yī)科大學(xué) 裘宇容,如孔2A2E均為陽(yáng)性，根據(jù)反應(yīng)工作表格局，說(shuō)明抗體特異性為抗HLA-A1抗體；如孔2A2E中有3孔強(qiáng)陽(yáng)性，而2孔陰性，應(yīng)該如何分析？,實(shí)驗(yàn)討論,實(shí)驗(yàn)三 病例討論,病歷 患者吳xx,女性，39歲，漢族，廣東省汕頭籍，家住汕頭市鱸崗鎮(zhèn)，2007年5月18入院。 主訴： 尿檢、腎功異常6年，加重半年。緣于2001年5月無(wú)明顯誘因出現(xiàn)頭暈，腰酸痛，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就診，査

14、尿常規(guī)提示尿蛋白（+），腎功異常（肌酐130umol/L左右），給予對(duì)癥治療（具體不詳），癥狀緩解。此后病情平穩(wěn)。監(jiān)測(cè)腎功肌酐逐步上升，2006年9月為200umol/L,11月再次出現(xiàn)頭暈，伴惡心，嘔吐，測(cè)肌酐達(dá)700umol/L,就診于西安某醫(yī)院，診斷“慢性腎功不全尿毒癥期”，行左前臂內(nèi)瘺術(shù)，術(shù)后內(nèi)瘺栓塞。擬行腎移植術(shù)，但因無(wú)合適供體，回當(dāng)?shù)蒯t(yī)院繼續(xù)治療。2007-5-15復(fù)查肌酐1400umol/L,為行腎移植術(shù)，就診我院，門診以“慢性腎功能不全尿毒癥期”收入科。病程中精神、飲食一般。24小時(shí)尿量1400ml左右，大便正常，體重?zé)o明顯變化。婚育史：患者23歲已婚，生有2子3女，流產(chǎn)1次,

15、查體： 體溫 36.6 0C，脈搏80次/分，呼吸18次/分，血壓150/100mmHg發(fā)育正常，營(yíng)養(yǎng)中等，神志清楚，精神欠佳，慢性病容，貧血貌，全身皮膚、黏膜無(wú)黃染，全身淺表淋巴結(jié)未觸及腫大。頸靜脈無(wú)怒張，頸動(dòng)脈無(wú)異常搏動(dòng)，未捫及包塊，甲狀腺不腫大，氣管居中，頸軟無(wú)抵抗。胸廓對(duì)稱無(wú)畸形，無(wú)局限性隆起，雙側(cè)乳房對(duì)稱，未捫及腫塊。胸壁未見靜脈曲張，胸式呼吸存在，節(jié)律規(guī)整，叩診呈清音，肺肝界位于右鎖骨中線第5肋間，雙肺呼吸音清，未聞及干濕性羅音及胸膜摩擦音。心前區(qū)無(wú)隆起，心尖搏動(dòng)不明顯，未見異常搏動(dòng)，心界不大，心率80次/分，律齊，各瓣膜聽診區(qū)未聞及病理性雜音，無(wú)心包摩擦音。腹平坦，腹肌軟，全腹無(wú)

16、壓痛及反跳痛，未捫及包塊，肝脾肋緣下未觸及。肝脾及雙腎區(qū)無(wú)叩擊痛，移動(dòng)性濁音陰性，腸鳴音正常35次/分。生理反射存在，病理反射未引出。專科檢查: 雙側(cè)肋脊角未見異常隆起，皮膚無(wú)紅腫，雙腎區(qū)平坦，未觸及包塊，雙側(cè)肋脊點(diǎn)無(wú)明顯壓痛，雙腎區(qū)無(wú)叩擊痛，未聞及血管雜音。雙側(cè)輸尿管行徑無(wú)壓痛點(diǎn)，恥骨上區(qū)無(wú)膨隆及壓痛，膀胱叩診空虛。,實(shí)驗(yàn)室檢查： 血常規(guī)：WBC 4.42G/L，NEU% 68.5%，RBC 2.37G/L，HGB 60g/L，HCT 0.193,PLT 132G/L；血型：“B”型；血生化：BUN 25.4mmol/L，Cr 975umol/L,GLU 4.7mmol/L，K+ 3.51m

17、mol/L，Ca22.13mmol/L，TG1.35mmol/L，Tco2 21.1mmol/L；肝功能轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素結(jié)果正常；ALB 39.8g/L；自身抗體陰性；凝血四項(xiàng)基本正常；乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病及結(jié)核相關(guān)檢查均陰性；腫瘤標(biāo)記物檢查未見異常；尿常規(guī)：尿蛋白（+），尿白細(xì)胞（+），尿隱血（+）。PRA40。 心電圖：1.竇性心律，2.左室肥厚。 胸片：心影增大，符合尿毒癥性心肌病。 腹部B超：1.雙腎縮小，實(shí)質(zhì)回聲增強(qiáng)，左腎囊腫，2.右側(cè)附件區(qū)囊性占位，建議定期復(fù)查，3.肝、膽、胰、脾未見明顯異常。 超聲心動(dòng)圖：1.左房輕度增大，2.主動(dòng)脈瓣反流（輕度），3.左室順應(yīng)性減低。 胃鏡：

18、十二指腸球炎。,討論 患者高PRA,腎移植術(shù)前、術(shù)后注意事項(xiàng)。 患者出現(xiàn)高PRA的可能原因有哪些？ 等待移植的患者術(shù)前如果接受過(guò)輸血治療、或者前一次移植后因排斥而導(dǎo)致移植物失功以及女性患者曾經(jīng)生育過(guò)孩子（妊娠），那么患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)有可能受到來(lái)自其他個(gè)體（同種異體）的人類白細(xì)胞抗原（HLA）分子刺激（致敏），導(dǎo)致患者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)同種異體HLA分子的特異性抗體，并釋放到外周血液中，我們將這些抗體稱為群體反應(yīng)性抗體（Panel Reactive Antibody, PRA），簡(jiǎn)稱為PRA。PRA陽(yáng)性受者稱為致敏受者，PRA40%的受者稱為高致敏受者?；颊呱?子3女，流產(chǎn)1次。這可能是高PRA的主要原因。 高PRA患者的器官移植存在哪些危害？ 研究表明，PRA在實(shí)體器官（腎、心、肺、肝等）移植排斥反應(yīng)中扮演了重要角色，不僅與腎移植超急性排斥反應(yīng)密切相關(guān)，而且與移植物功能延遲、急性排斥、慢性排斥以及移植物存活率下降也有關(guān)系 。,PRA陽(yáng)性患者在移植配型上應(yīng)嚴(yán)格注意哪些問(wèn)題？ 臨床上對(duì)患者術(shù)前的PRA水平及抗體特異性應(yīng)進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)，并針對(duì)每一個(gè)患者體內(nèi)的HLA抗體水平及特異性制定治療方案。PRA已成為實(shí)體器官移植術(shù)前組織配型的常規(guī)和首選指標(biāo)，越來(lái)越受到臨床醫(yī)生的重視與關(guān)注。對(duì)PRA陽(yáng)性致敏受者術(shù)前必須進(jìn)行嚴(yán)格的交叉配型（補(bǔ)體依賴性淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)，CDC），選擇HLA相