超臨界流體色譜法簡(jiǎn)介.ppt

1、20-5 超臨界流體色譜法簡(jiǎn)介,超臨界流體色譜法（Supercritical Fluid Chromatography ,SFC）是以超臨界流體作為流動(dòng)相的一種色譜方法。所謂超臨界流體，是指既不是氣體也不是液體的一些物質(zhì)，它們的物理性質(zhì)介于氣體和液體之間。超臨界流體色譜技術(shù)是2O世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種嶄新的色譜技術(shù)。由于它具有氣相和液相所沒有的優(yōu)點(diǎn)，并能分離和分析氣相和液相色譜不能解決的一些對(duì)象，應(yīng)用廣泛，發(fā)展十分迅速。據(jù)Chester估計(jì)，至今約有全部分離的25涉及難以對(duì)付的物質(zhì)，通過超臨界流體色譜能取得較為滿意的結(jié)果。,天馬行空官方博客： ；QQ:1318241189；QQ群：1755

2、69632,1超臨界流體的特性,(1) 物質(zhì)的臨界點(diǎn) 我們知道，某些純物質(zhì)具有三相點(diǎn)和臨界點(diǎn)。純物質(zhì)的相圖見圖20-s1由三相圖看出：物質(zhì)在三相點(diǎn)下，氣、液、固三態(tài)處于平衡狀態(tài)。而在物質(zhì)的超臨界溫度下，其氣相和液相具有相同的密度。當(dāng)處于臨界溫度以上，則不管施加多大壓力，氣體也不會(huì)液化。在臨界溫度和臨界壓力以上，物質(zhì)是以超臨界流體狀態(tài)存在。即在超臨界狀態(tài)下，隨溫度、壓力的升降，流體的密度會(huì)變化。此時(shí)的物質(zhì)既不是氣體也不是液體，卻始終保持為流體。臨界溫度通常高于物質(zhì)的沸點(diǎn)和三相點(diǎn)。,（2）超臨界流體的特性 超臨界流體具有對(duì)于分離極其有利的物理性質(zhì)。它們的這些性質(zhì)恰好介于氣體和液體之間。超臨界流體的

3、擴(kuò)散系數(shù)和粘度接近于氣相色譜，因此溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力小，可以獲得快速高效分離。另一方面，其密度與液相色譜類似，這樣就便于在較低溫度下分離和分析熱不穩(wěn)定性、相對(duì)分子質(zhì)量大的物質(zhì)。另外，超臨界流體的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)，如擴(kuò)散、粘度和溶劑力等，都是密度的函數(shù)。因此，只要改變流體的密度，就可以改變流體的性質(zhì)，從類似氣體到類似液體，無需通過氣液平衡曲線。超臨界流體色譜中的程序升密度相當(dāng)于氣相色譜中程序升溫度和液相色譜中的梯度淋洗。 通常作為超臨界流體色譜流動(dòng)相的一些物質(zhì)，其物理性質(zhì)列在表20-1中,天馬行空官方博客： ；QQ:1318241189；QQ群：175569632,2超臨界流體色譜儀,1985年出

4、現(xiàn)第一臺(tái)商品型的超臨界流體色譜儀。圖20-s6表示了超臨界流體色譜儀的一般流程。 圖中很多部分類似于高效液相色譜儀，但有兩點(diǎn)重要差別： （l）具有一根恒溫的色譜柱。這點(diǎn)類似氣相色譜中的色譜柱，目的是為了提供對(duì)流動(dòng)相的精確溫度控制。 （2）帶有一個(gè)限流器（或稱反壓裝置）。目的用以對(duì)柱維持一個(gè)合適的壓力，并且通過它使流體轉(zhuǎn)換為氣體后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)量。實(shí)際上，可把限流器看作柱末端延伸部分。,3壓力效應(yīng),在SCF中，壓力的變化對(duì)容量因子k產(chǎn)生顯著影響，由于以超流體作為流動(dòng)相，它的密度隨壓力增加而增加，而密度的增加引起流動(dòng)相溶劑效率的提高，同時(shí)可縮短淋 洗時(shí)間。例如，采用CO2流體作流動(dòng)相，當(dāng)壓力由

5、7.O106Pa增加到90106Pa時(shí)，對(duì)于十六碳烷烴的淋洗時(shí)間可由25min縮短到5min。在SFC中，通過程序升壓實(shí)現(xiàn)了流體的程序升密，達(dá)到改善分離的目的。,4.固定相和流動(dòng)相,用于SFC中的色譜柱可以是填充柱也可以是毛細(xì)管柱，目前，毛細(xì)管超臨界流體色譜（CSFC）由于具有特別高的分離效率，倍受人們的青睞。 在SFC中，最廣泛使用的流動(dòng)相要算是CO2流體，它無色、無味、無毒、易獲取并且價(jià)廉，對(duì)各類有機(jī)分子都是一種極好的溶劑。它在紫外區(qū)是透明的；臨界溫度31，臨界壓力7.29106Pa；在色譜分離中，CO2流體允許對(duì)溫度、壓力有寬的選擇范圍。有時(shí)可在流體中引入1%10%甲醇，以改進(jìn)分離的選擇

6、因子值。除CO2流體外，可作流動(dòng)相的還有乙烷、戊烷、氨、氧化亞氮、二氯二氟甲烷、二乙基醚和四氫呋喃等。,天馬行空官方博客： ；QQ:1318241189；QQ群：175569632,5.檢測(cè)器,在高效液相色譜儀中經(jīng)常采用的檢測(cè)器，如紫外、熒光、火焰光度等都能在SFC儀中很好應(yīng)用。但SFC比起HPLC還具有一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是可采用GC中火焰離子化檢測(cè)器（FID）。我們知道，F(xiàn)ID對(duì)一般有機(jī)物分析具有較高的靈敏度，這也就提高了SFC對(duì)有機(jī)物測(cè)定的靈敏.,6超臨界流體色譜法與其他色譜法比較,（l）與高效液相色譜法比較 實(shí)驗(yàn)證明SFC法的柱效一般比HPLC法要高：當(dāng)平均線速度為0.6cmS-1時(shí)，SFC法

7、的柱效可為HPLC法的3倍左右，在最小板高下載氣線速度是4倍左右；因此SFC法的分離時(shí)間也比HPLC法短。這是由于流體的低粘度使其流動(dòng)速度比HPLC法快，有利于縮短分離時(shí)間。 （2）與氣相色譜法比較 出于流體的擴(kuò)散系數(shù)與粘度介于氣體和液體之間，因此SFC的譜帶展寬比GC要??；另外，SFC中流動(dòng)相的作用類似LC中流動(dòng)相，流體作流動(dòng)相不僅載帶溶質(zhì)移動(dòng)，而且與溶質(zhì)會(huì)產(chǎn)生相互作用力，參與選擇競(jìng)爭(zhēng)。還有，如果我們把溶質(zhì)分子溶解在超臨界流體看作類似于揮發(fā)，這樣，大分子物質(zhì)的分壓很大，因此可應(yīng)用比GC低得多的溫度，實(shí)現(xiàn)對(duì)大分子物質(zhì)、熱不穩(wěn)定性化合物、高聚物等的有效分離。,（3）應(yīng)用范圍的比較 圖20-s7描

8、繪了SFC與其他色譜方法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量范圍的比較。由圖20-s7看出SFC比起GC法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量的范圍要大出好幾個(gè)數(shù)量級(jí)，基本與LC法相當(dāng)。當(dāng)然，尺寸排阻色譜法（SEC）所測(cè)分子質(zhì)量范圍是所有色譜法中最大的。 超臨界流體色譜法被廣泛應(yīng)用于天然物、藥物、表面活性劑、高聚物、多聚物、農(nóng)藥、炸藥和火箭推進(jìn)劑等物質(zhì)的分離和分析。,20-6 毛細(xì)管電泳 capillary electrophoresis,20-1概述 早在一百多年以前，較原始的電泳實(shí)驗(yàn)，是在一個(gè)U形一管中進(jìn)行的，管中盛有溶液，兩端置有電極，加上幾百伏電壓后，首次實(shí)驗(yàn)了對(duì)毒素和抗毒素的分離。1909年，L.Michaelis提出“電

9、泳”這一術(shù)語(yǔ)，他的實(shí)驗(yàn)是用于測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。此后，許多的研究報(bào)告涉及氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)的分離。為了防止電泳完成了的溶液中，再次發(fā)生對(duì)流混合，曾使用了各種穩(wěn)定介質(zhì)，如瓊脂、纖維粉、玻璃絲、硅膠及丙烯酸胺；為了防止熱擴(kuò)散而使用了一種內(nèi)徑小的管道，管道內(nèi)徑由3mm縮小至75m。1981年，Jorgenson和Lukacs 使用75m內(nèi)徑的熔融石英毛細(xì)管，電泳分離氨基酸和肽。至此，出現(xiàn)了毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）技術(shù)。,毛細(xì)管電泳，又稱高效毛細(xì)管電泳（High Performance capillary electrophoresis，HPCE），它不

10、同于經(jīng)典的區(qū)帶電泳，有如下特點(diǎn)：,（1）它是在內(nèi)徑（1O200）m的石英毛細(xì)管中進(jìn)行的，在毛細(xì)管中的散熱較好，沿著管截面的溫度梯度很小，因此，可以提高加在毛細(xì)管兩端的電壓，所加電壓可高達(dá)幾十千伏。 （2）它不需要阻流介質(zhì)，、但可使用凝膠作分子篩介質(zhì)。 （3）可使用在柱檢測(cè)法，縮短分析時(shí)間，結(jié)合計(jì)算機(jī)處理數(shù)據(jù)，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。 （4）靈敏度高，檢測(cè)眼可達(dá)（10-131O-15）mol，使用激光誘導(dǎo)的熒光檢測(cè)限可達(dá)（1O-191O-21）mol。 （5）分辨率高，理論塔板數(shù)為幾十萬至幾百萬米。 （6）取樣量少，有時(shí)只需幾個(gè)納升（nL，10-9L），流動(dòng)相只需幾毫升。,20-1 高效毛細(xì)管由泳的基

11、本原理,1.溶質(zhì)在毛細(xì)管區(qū)帶電泳過程中的傳遞 含離子的溶液，在電場(chǎng)中所發(fā)生的物理過程服從歐姆定律，當(dāng)有直流電通過溶液時(shí)，陰離子向陽(yáng)極遷極，陽(yáng)離子向陰極遷移，溶液的導(dǎo)電率取決于離于濃度和其遷移率(又稱淌度，即指溶質(zhì)在單位時(shí)間和單位電場(chǎng)強(qiáng)度下移動(dòng)的距離)。離子遷移率以表示，其大小受溶質(zhì)的電荷離子大小比例所控制。 在電場(chǎng)的影響下，帶電荷的質(zhì)點(diǎn)受到的力Fe，等于其凈電荷q與電場(chǎng)強(qiáng)度E的乘積，即Fe = qE。電場(chǎng)強(qiáng)度E以每單位長(zhǎng)度所加的電壓U來表示，即E=U/L，其中L是毛細(xì)管長(zhǎng)度。Fe對(duì)正電荷為正值，對(duì)負(fù)電行為負(fù)值。電場(chǎng)力促使帶電質(zhì)點(diǎn)向兩極移動(dòng)，質(zhì)點(diǎn)在移動(dòng)過程中，也受到一種與電場(chǎng)力方向相反的阻滯力F

12、d，阻止其移動(dòng)，此阻滯力與質(zhì)點(diǎn)的電泳速度成正比，由下式結(jié)出,Fd =f 式中，f是質(zhì)點(diǎn)平移動(dòng)所受的摩擦阻力，對(duì)小的球狀物質(zhì)點(diǎn)，可用斯托克斯（Stokes）定律表示，即： f=6r 式中，是溶液的粘度，r是離子半徑。即摩擦阻力正比于溶液的粘度、質(zhì)點(diǎn)大小和其電泳速度。由于存在摩擦阻力，一種帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)，被加速到一有限速度，此速度取決于Fe和Fd，這一有限速度稱為電泳速度，ep 。當(dāng)促進(jìn)力與阻滯力達(dá)到平衡時(shí)，則 ep qEf 將上述表達(dá)式合并，作為電泳遷移率（或電泳淌度）ep 。表示式，則 epepEq士6r 電泳遷移率定義為：一種質(zhì)點(diǎn)在每單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的穩(wěn)態(tài)速度。,ep 值的大小，取決于分

13、子的凈電荷數(shù)及其摩擦性質(zhì)，（分子大小和形狀）以及所用介質(zhì)的介電常數(shù)和粘度。因而，對(duì)于每一種質(zhì)點(diǎn)，在電場(chǎng)作用下的遷移均具有特定的速度。 對(duì)于大分子或膠體，其關(guān)系可表示為,式中，是帶電質(zhì)點(diǎn)的Zeta電位；為溶液的介電常數(shù)；K是德拜一修格爾常數(shù)； 為離子半徑；參數(shù)fK是一個(gè)常數(shù)；其值在115之間，取決于遷移質(zhì)點(diǎn)的形狀。,HPCE分離，幾乎都是在熔融石英毛細(xì)管中完成的，熔融石英是一種高度交聯(lián)的SiO2聚合物，具有很好的抗拉強(qiáng)度。石英毛細(xì)管表面含有許多硅酸基：）SiOH，在一定的條件下可離解。使表面帶有負(fù)電荷。由于表面帶負(fù)電，因此，帶負(fù)電荷的離子被表面排斥，而帶正電均離子則被毛細(xì)管壁吸引，如圖201所示

14、 在毛細(xì)管壁的陰離子，與來自主體溶液中的陽(yáng)離子在石英一溶液界面上形成雙電層。由于靜電場(chǎng)的作用，靠近表面的那些抗衡離子是不遷移的，因此構(gòu)成所謂稠密層。由于熱運(yùn)動(dòng)關(guān)系，離表面遠(yuǎn)的離子構(gòu)成可遷移層或擴(kuò)散層，因?yàn)樵陔p電層內(nèi)離子的立體分布，就形成一種電勢(shì)梯度.,當(dāng)在毛細(xì)管兩端加有電場(chǎng)時(shí)；擴(kuò)散層內(nèi)可遷移的陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)。由于離子是被水化的，因此，在緩沖液中的液體也隨遷移著的陽(yáng)離子一道，向陰極移動(dòng)，形成一種液流，稱之為電滲流（electroosmotic flow，EOF），它是一種電泳驅(qū)動(dòng)力。在雙電層內(nèi)，EOF總是向雙電層內(nèi)抗衡離子方向遷移，穿過雙電層的電勢(shì)下降的程度受電滲流速度所控制。電滲流的線速度e

15、o ，可以定義為：,式中，eo是電滲遷移率，即在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下，電滲流的線速度。,Zeta電勢(shì)可表示為： =4/ 式中，是毛細(xì)管表面電荷密度；為雙電層厚度。按近代電解質(zhì)理論，等于1K，因此式可寫為：,式中，K為德拜一修格爾參數(shù),20-2 在CZE分離中的遷移時(shí)間、效率及分辨率,在電滲流存在下，離子的遷移速度可表示為： =（eo）U/Lt 式中，Ld是毛細(xì)管總長(zhǎng)度；U是外加電壓。離子的遷移時(shí)間為t，則 t=LtLd/（eo）U 式中，Lt為進(jìn)樣端到檢測(cè)器之間的毛細(xì)管長(zhǎng)度，或稱為遷移長(zhǎng)度。分離效率n可表示為,式中，D為溶質(zhì)的平均擴(kuò)散系數(shù)。由上式可見，如果熱影響阿忽略不計(jì)的話，增大電壓，可增加分離效率。,按Gidding方程5，分辨率R只可定義為,式中，是兩溶質(zhì)的區(qū)帶間的相對(duì)速度差。對(duì)上面的公式處理，可得,1和2兩溶質(zhì)的電泳遷移率，而是它們的平均電泳遷移率。,在許多情況下，電滲流速度比許多質(zhì)點(diǎn)的電泳速度要快，因此，在毛細(xì)管中的所有溶質(zhì)將朝一個(gè)方向遷移，不管它們帶多少正電荷，都將先被檢出，繼之中性質(zhì)點(diǎn)被檢出，最后帶負(fù)電荷的