羅氏實時熒光定量PCR儀【知識薈萃】

1、實時熒光定量PCR儀,1,行業(yè)重點,一、實時熒光定量PCR的原理,熒光定量 PCR 通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進行分析，計算待測樣品的初始模板量。 熒光定量 PCR儀 熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。,2,行業(yè)重點,定量PCR技術(shù)的產(chǎn)生 1992年由Higuchi等人第一次報告：使用EB內(nèi)插染料法插至雙鏈DNA，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測樣品的熒光強度 PCR循環(huán) = 雙鏈DNA = 染料 = 熒光 后來用與雙鏈DNA有更強結(jié)合力的SYB

2、R Green I取代EB,3,行業(yè)重點,熒光定量實時PCR與普通PCR的比較 實時在線監(jiān)控 對樣品擴增的整個過程進行實時監(jiān)控，能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加，直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)期 降低反應(yīng)的非特異性 使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應(yīng)的特異性 增加定量的精確性 全程監(jiān)控，準確的算法進行定量 結(jié)果分析更加快捷方便，無需跑膠,4,行業(yè)重點,羅氏產(chǎn)品介紹以及與同類產(chǎn)品之間的對比,5,行業(yè)重點,一、LC1.5和LC2.0,LightCycler熒光定量PCR系統(tǒng),LC1.5,LC2.0,6,行業(yè)重點,Lightcycler 1.5 結(jié)構(gòu)分析,以空氣加熱及冷卻迅速改變溫度,帶有極高

3、表面積/容量比例的密封20l毛細管,加熱線圈,可容納32個樣品的卡盤,將熒光儀定位的 分檔器發(fā)動機,將樣品置于 光學儀上的 分檔器發(fā)動機,熱室,風扇,濾器,免維護的 LED光源,光學倍增管,7,行業(yè)重點,Lightcycler 2.0 結(jié)構(gòu)分析,空氣加熱系統(tǒng),LED激發(fā)光源,PMT檢測系統(tǒng),光纖,8,行業(yè)重點,熱力學結(jié)構(gòu),特點： 1、空氣加熱 2、毛細管反應(yīng)體系 優(yōu)點: 1、升降溫速度快（0.05 -20/秒）， 2、體系均一，不存在邊緣現(xiàn)象 3、把反應(yīng)體系縮小到0-20ul，節(jié)省試劑成本 實現(xiàn)快速PCR,9,行業(yè)重點,光學結(jié)構(gòu),特點： 1、免維護的LED冷光源，壽命長達2萬小時以上 2、光學

4、倍增管（Rodenstock ） 3、多達6通道（LC2.0）和3通道（LC1.5）實時檢 測 優(yōu)點： 1、毛細管光學特性將光線散射、衍射降至最低， 避免LED 功率低的問題 2、免維護，帶自動檢驗功能 3、輕易實現(xiàn)內(nèi)標、內(nèi)對照及多重PCR,10,行業(yè)重點,LightCycler 結(jié)構(gòu)分析,11,行業(yè)重點,LightCycler 軟件 4.0 更先進的自動定量方法 全新的相對定量軟件 全自動熔點曲線分組 全自動熔點溫度提示 簡化數(shù)據(jù)和用戶管理,12,行業(yè)重點,PCR領(lǐng)域最聰明的革新 LightCycler熒光定量PCR系統(tǒng),超高速 30至40分鐘完成PCR過程 實時在線監(jiān)測 收集每一循環(huán)的數(shù)據(jù)

5、并立即顯示于聯(lián)機電腦上 高靈敏 在一個基因組當量中可檢測出單基因拷貝 范圍廣 可檢測101010拷貝線性范圍，無需稀釋樣品 開放性 全開放，成為國內(nèi)外試劑廠家的首選開發(fā)平臺 六個熒光通道 輕易實現(xiàn)內(nèi)標、內(nèi)對照或多重PCR 最小化 定量反應(yīng)體積降至1020ul，費用低廉 靈活性 支持水解探針、雜交探針及 SYBR Green I 閉管分析 消除污染風險,13,行業(yè)重點,Lightcycler 的分析模式,適用于所有的通用探針及染料分析模式： SYBR Green I（熒光染料） TaqMan（水解探針） Molecular beacon（分子信標） Lightcycler上開發(fā)獨有的分析模式：

6、Hybridization Probe Format（雜交探針） SimpleProbe （單探針）,14,行業(yè)重點,SYBR-Green I 檢測模式 SYBR Green I能選擇性地與雙鏈DNA結(jié)合，在外界光源激發(fā)下產(chǎn)生強烈熒光。在PCR過程中， SYBR Green I可與新合成地雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生地熒光信號強度與雙鏈DNA含量成正比，熒光檢測在每一循環(huán)的延期后進行。 SYBR Green I與非特異性雙鏈DNA（如引物二聚體）結(jié)合產(chǎn)生的干擾可通過融解曲線分析而得到解決。,15,行業(yè)重點,水解探針（Taqman ）檢測模式 同時標記有熒光發(fā)光分子和熒光淬滅分子的一條探針在激發(fā)光作用下

7、，發(fā)光分子所產(chǎn)生的熒光可被淬滅分子吸收，因而檢測不到熒光。在PCR延伸時，因Taq酶具有的5，3，核酸外切酶活性，可降解熒光探針，使熒光發(fā)光分子與熒光淬滅分子分開，在外界光源激發(fā)下即可發(fā)出熒光，熒光強度與PCR擴增產(chǎn)物量有關(guān)。,16,行業(yè)重點,分子信標（Molecular Beacon Probe） 獨特的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，由非特異的頸和特異的環(huán)組成，探針的5端標記熒光分子，3端 標記一個吸收或淬滅熒光的分子 。自身環(huán)化時儀器檢測不到熒光，在PCR反應(yīng)的退火階段，探針因與模板鏈雜交而打開，使5端熒光分子與3端吸收或淬滅熒光的分子分開，儀器就會檢測到熒光信號。每一個循環(huán)，隨著PCR擴增產(chǎn)物的增加，熒光信

8、號會增強，從而根據(jù)熒光信號的增強來計算PCR擴增產(chǎn)物的增加量。,17,行業(yè)重點,雜交探針（HybProbe）檢測模式 設(shè)計與檢測區(qū)互補的分別帶有不同染料標記的一對寡核苷酸（既雜交探針），在與擴增的DNA片斷雜交時，兩種染料互相接近。其中供體熒光染料受外來光源激發(fā)后，將能量傳遞給附近的受體染料，既發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），從而釋放出受體染料分子的發(fā)射波長熒光信號。熒光信號的強度和DNA的產(chǎn)量成正比。其他非特異性產(chǎn)物由于不會與探針雜交，因而不產(chǎn)生信號干擾。,18,行業(yè)重點,for sequence specific detection of DNA,雜交探針檢測羅氏專利性技術(shù),19,行業(yè)重

9、點,Template: Plasmid; Target: CycA; Detection Format: Hybridization Probes,Standard Calculated concentration,9.522E+9 1.024E+9 9.433E+7 1.127E+7 1.029E+6 9.902E+4 1.021E+4 9.217E+2 9.276E+1 1.085E+1 H2O,1.0E+10 1.0E+9 1.0E+8 1.0E+7 1.0E+6 1.0E+5 1.0E+4 1.0E+3 1.0E+2 1.0E+1 H2O,雜交探針的優(yōu)點： 1.靈敏度高 2.寬動力學范

10、圍 3.特異性高 4.可用于突變分析,Monitoring of PCR with the LightCyclerUsing Hybridization Probes,20,行業(yè)重點,專用于SNP基因分型和突變檢測的 SimpleProbe SimpleProbe作為一種獨特的雜交探針只含有一條寡核苷酸探針，能夠特異性的與目的基因上含有SNP位點的靶序列結(jié)合。探針與靶序列結(jié)合后，釋放出能夠被檢測到的熒光信號，通過對熔點曲線分析中探針釋放的熒光信號強度的分析，可以得到對目的基因的多態(tài)位點的準確分析結(jié)果。,21,行業(yè)重點,Denaturation phase: SimpleProbe free i

11、n solution; emission of reporter dye is quenched,Annealing phase: Fluorescence from reporter dye increases when probe is annealed to its complementary target,New Probe Format : SimpleProbe Format-高效低成本的新型探針,R = Reporter (Fluorescein) Q = Quencher,22,行業(yè)重點,熒光定量PCR儀的部分應(yīng)用,醫(yī)學相關(guān)研究 疾病的臨床早期診斷 病原體的含量檢測 合理用藥分

12、子水平的療效研究 疾病的發(fā)病監(jiān)控研究 腫瘤相關(guān)基因腫瘤、耐藥基因的檢測 研究組織或培養(yǎng)細胞中mRNA的表達水平 各種處理對細胞mRNA含量變化的影響 比較染病組織與正常組織中各種mRNA含量差異 DNA或RNA的轉(zhuǎn)染量與實驗結(jié)果關(guān)系的研究 基因分型及SNP分析 轉(zhuǎn)基因動物及植物研究,23,行業(yè)重點,重點問題說明,超高速的熱循環(huán) 由于采用空氣迅速改變溫度，以及利用有高表面積/體積比的光學玻璃毛細管模式，使升降溫速度最高可達20/秒，溫控0.2 ， 每2030分鐘便能完成3040個循環(huán)。 升降溫數(shù)率唯一可調(diào)可以根據(jù)實驗的需要調(diào)整升降溫速率的系統(tǒng)0.0520 /秒，優(yōu)化實驗。,24,行業(yè)重點,配套功

13、能強大的分析軟件： （1）絕對定量（具“單點定標”功能） （2）相對定量（可進行效率校正） （3）自動基因分型（SNP） （4） 顏色干擾校正 獨特的熔點曲線分析功能，可進一步作PCR后分析： - 檢測非特異擴增并作矯正 - 鑒別基因型而又無需采用測序凝膠 - 檢測點突變，并可利用雙色檢測及顏色補償軟 件在同 一反應(yīng)中分析較復雜的突變,25,行業(yè)重點,為什么使用DNase-Free & RNase-Free 的光學玻璃 毛細管? 玻璃反應(yīng)管可加快熱傳導速率. 毛細管增加表面積/體積比，確保空氣和反應(yīng)成分之間的 溫度迅速平衡，溫度均一. 縮短了PCR反應(yīng)時間，特別是熒光激發(fā)的時間，保證了 反應(yīng)成

14、分的穩(wěn)定性，尤其是熒光染料的穩(wěn)定性。 縮小反應(yīng)體系， 降低檢測成本。 光學玻璃毛細管的材料適合熒光訊號的測定，類似光纖 的形狀，保證熒光訊號的準確捕獲。沒有邊緣效應(yīng).,26,行業(yè)重點,LightCycler / 毛細管 / 試劑的成本核算 儀器的維護費用 LightCycler是免維護的儀器,采用的光源是普通的發(fā)光二極管，壽命長達20000小時以上，非常穩(wěn)定，價格低廉。而鹵素燈光源，壽命2000小時，發(fā)光強度衰減明顯，需要定期更換，價格昂貴。 單一反應(yīng)成本的計算 單一反應(yīng)成本包括試劑成本和反應(yīng)管成本，由于毛細管的反應(yīng)體系是1020ul，而其他同類機器的反應(yīng)體系是50ul，所以使用LC試劑的成本

15、可以減少至少一半。,27,行業(yè)重點,28,行業(yè)重點,LC1.5與同質(zhì)產(chǎn)品的對比,29,行業(yè)重點,30,行業(yè)重點,LC2.0與同質(zhì)產(chǎn)品的對比,31,行業(yè)重點,二、LC480,LightCycler480實時熒光定量PCR系統(tǒng),32,行業(yè)重點,高靈敏 可檢測單拷貝基因動力學范圍廣 可檢測101010個拷貝高重復性 重復性高，CV0.3高分辨率 輕松區(qū)分1000拷貝以下2倍濃度差異高速 40分鐘完成40個PCR循環(huán)技術(shù)創(chuàng)新 采用Therma-BaseTM熱循環(huán)專利技術(shù) 和先進的光學檢測系 統(tǒng)，徹底消除邊緣效應(yīng)，保持穩(wěn)定優(yōu)異的檢測結(jié)果。靈活 分析模式多樣，絕對定量，相對定量，融解曲線分析等幾乎 適用所

16、有的檢測模式（SYBR Green ，Taqman Probe， Hybprobe，SimpleProbe等）模塊化 可互換的96孔，384孔加熱模塊，用戶可以自助更換模塊， 不需要工程師到場自動化平臺 配以LIMS系統(tǒng)及自動進樣機械臂，可實現(xiàn)遠程操作及全 自動化運作用戶界面友好 軟件直觀簡潔，易操作,LightCycler480系統(tǒng)主要特點,33,行業(yè)重點,LightCycler480系統(tǒng)主要參數(shù),34,行業(yè)重點,創(chuàng)新的PCR熱循環(huán)模塊設(shè)計,Therma-BaseTM 是一個內(nèi)壁布滿燈芯狀毛細管結(jié)構(gòu)的腔體，通過一系列的冷凝合蒸發(fā)，Therma-BaseTM 高效地傳遞熱量，從而實現(xiàn)整板最大的

17、溫度均一性。,Therma-BaseTM核心優(yōu)勢 優(yōu)異的空間溫度均一性 快速、準確的溫度調(diào)控 40個循環(huán)40分鐘(384孔板),35,行業(yè)重點,36,行業(yè)重點,先進獨特的光學系統(tǒng),LC480系統(tǒng)使用寬光譜、高強度的氙燈作為光源。激發(fā)光經(jīng)過多次反射后形成與孔板大小相同、光強均一的光柱，有效消除邊緣效應(yīng)。激發(fā)波長和發(fā)射波長的任意組合，使得多種熒光染料和檢測模式可用于目前所有的實時熒光定量PCR實驗。 LC480光學系統(tǒng)的核心優(yōu)勢： 最靈活地選擇熒光染料及檢測模式 整板數(shù)據(jù)的精確捕獲 強大的多重PCR能力,37,行業(yè)重點,多檢測通道支持所有的檢測模式 LightCycler 480系統(tǒng)支持目前所有檢

18、測模式的使用，包括雜交探針、 SYBR Green I DNA結(jié)合染色、單探針、水解探針和分子信標等等。多色熒光檢 測系統(tǒng)，提供五色激發(fā)通道（450 nm, 483 nm, 523 nm, 558 nm, 615 nm）和六色熒 光檢測通道（ 500 nm, 533 nm, 568 nm, 610 nm, 640 nm, 670 nm）,并具有顏色補償 功能；可自由選擇，輕松實現(xiàn)多重或多色PCR。,38,行業(yè)重點,公認的性能獨特的軟件,基于用戶公認的LC480軟件，新的LC480軟件采用羅氏獨特的算法來 進行高度精確、自動化的數(shù)據(jù)分析。而且，新軟件還提供了許多新的的 特性，讓用戶能夠輕松、省時地處理高通量的實驗數(shù)據(jù)。 LC480軟件設(shè)計宗旨是為了用戶需求量身定做。支持絕對定量、融解 曲線分析、相對定量和自動基因分型等功能。 LC480軟件的核心優(yōu)勢： 采用公認的優(yōu)秀算法來分析數(shù)據(jù) 友好的用戶界面，簡單的快捷方式，便于進行高通量樣品編輯及數(shù)據(jù)處理。 軟件模塊化，用戶可根據(jù)自己的研究情況選擇性安裝。,39,行業(yè)重點,40,行業(yè)重點,模塊系統(tǒng)概念,LightCycler 480在系統(tǒng)初始配置的基礎(chǔ)上，還可根據(jù)客戶的特別要求，通過在系統(tǒng)中添加各種先進的軟件分析模塊進行系統(tǒng)升級，滿足用戶不同階段的研究需求。目前可提供的系