c1臨床微生物檢查

1、臨床微生物檢查南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院芮勇宇案例分析 某年9月某日晚上，某院急診科一病人。 突然起病，寒戰(zhàn)、劇烈頭痛、惡心嘔吐。 面色、眼結(jié)膜充血、咳嗽。 左耳紅腫熱痛，體溫40。 案例分析 醫(yī)生及時(shí)抽血進(jìn)行血液培養(yǎng)，血常規(guī)白細(xì)胞增高及核左移。 初步診斷敗血癥，收入院，使用泰能。 但是使用泰能3天，病人癥狀沒有改善，血液培養(yǎng)，給家屬下病危書。 案例分析 請(qǐng)南方醫(yī)院專家會(huì)診，詳細(xì)詢問病史和仔細(xì)體查，得到重要線索。 病人一周前爬過白云山，躺在草地上休息。 病人左耳有似被蚊蟲叮咬后形成焦痂。 案例分析 懷疑恙蟲病，外裴試驗(yàn)陽性。 -內(nèi)酰胺類藥物對(duì)恙蟲病無效，首選四環(huán)素類抗生素，1天后退熱，繼續(xù)用藥1周，

2、病人康復(fù)出院。 “臨床微生物檢查”重要性：明確臨床診斷和指導(dǎo)臨床合理用藥。檢驗(yàn)科三個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作“臨床微生物檢查” “臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)”實(shí)驗(yàn)室：酶鏈免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、膠體金層析試紙條、化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光、乳膠凝集方法。 檢測肝炎病毒、 、呼吸系統(tǒng)病原體抗原或抗體。檢驗(yàn)科三個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作“臨床微生物檢查” “臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)”實(shí)驗(yàn)室：熒光定量PCR方法，定量檢測病原體基因。 “臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)”實(shí)驗(yàn)室（重點(diǎn)）：細(xì)菌真菌涂片檢查、培養(yǎng)鑒定、耐藥性檢查。第一部分細(xì)菌真菌涂片檢查 第二部分細(xì)菌真菌培養(yǎng)鑒定第三部分細(xì)菌真菌耐藥性檢查Part 1 Morphological examination

3、s of bacteria and fungi1 non-stained.2 gram stain, bacteria and fungi.3 acid-fast stain, acid-fast bacillus. 4 Indian ink stain, cryptococcus. 1 Non-stained single-celled, budding forms called yeast (spore). multicellular, filamentous forms called mold (spore and hypha). dimorphic fungi, exist in tw

4、o distinct morphologic forms. Skinscraping,nail scraping, hairs. Employingadropof potassium hydroxide (15%) on a glass slide over thesurfaceofthe specimen. hairsSkinscraping Routine urine examination 2 Gram-stained Basic principle ? Peptidoglycan. Procedure ? crystal violet, iodine, alcohol. carbofu

5、chsin red. 2 Gram-stained Results, G+ or G- bacteria, cocci or bacillibacteria, bacteriaor fungi, in oil immersion field. fungi in urine positive cultured blood positive cultured blood positive cultured blood positive cultured blood positive cultured blood positive cultured bloodpositive cultured bl

6、ood sputum sputum sputum sputumsputumWBC25/LP上皮細(xì)胞 10 every visual field. acid-fast bacilli from sputum（+）4the Indian ink stain Cryptococcus in cerebrospinal fluid. Basic principle ? capsule. Procedure ? sediment. Cryptococcus neoformans germinativePart 1 Morphological examinations of bacteria and fu

7、ngi Advantages. cheap, rapid, diagnose primarily. Disadvantages. Not accurate.第一部分細(xì)菌真菌涂片檢查 第二部分細(xì)菌真菌培養(yǎng)鑒定第三部分細(xì)菌真菌耐藥性檢查第二部分細(xì)菌真菌培養(yǎng)鑒定一、血液 二、尿液 三、糞便 四、呼吸道五、穿刺液六、分泌物一、血液的細(xì)菌真菌培養(yǎng)鑒定Etiologic Examination of Blood and Bone Marrow 目的和意義； 采血指征； 采血注意事項(xiàng); 結(jié)果報(bào)告形式。目前我國社會(huì)老齡化日趨嚴(yán)重，慢 及惡性腫瘤、器官移植、 病和結(jié)核病病人不斷增多，侵襲性診療技術(shù)廣泛應(yīng)用，敗血

8、癥發(fā)病率不斷增加。敗血癥病死率30%以上；早期病原學(xué)診斷和合理抗生素治療，明顯降低敗血癥病死率。血液培養(yǎng)的送檢指征： 發(fā)熱38，或低溫10109/L，“核左移”白細(xì)胞增多； 粒細(xì)胞減少，成熟的多核白細(xì)胞90次/分；呼吸頻率20次/分； 二氧化碳分壓32mmHg；昏迷；多器官衰竭； 血清降鈣素原和C反應(yīng)蛋白升高； 嚴(yán)重局部感染（如嚴(yán)重肺炎同時(shí)采痰液和血液）。 血液標(biāo)本采集時(shí)間 最好在抗生素使用前采集， 若已用抗菌藥須，則盡量避開血藥濃度的高峰期，最好在下次用藥前。 血液標(biāo)本采集時(shí)間 血液標(biāo)本采集時(shí)間 建議第一次可在病人發(fā)熱初期或高峰期采集， 根據(jù)病人發(fā)熱情況，在24h內(nèi)再取2-3次標(biāo)本， 最好每

9、次“雙套”“雙瓶”， “雙套”指不同采血部位， “雙瓶”指需氧瓶和厭氧瓶。 需氧瓶，中和抗生素的樹脂瓶 厭氧瓶，營養(yǎng)豐富，提高兼性厭氧菌檢出率 血液量3-10ml，8-10ml最佳。兒童瓶，中和抗生素的樹脂瓶 血液量1-3ml。 注射器采血后， 將血培養(yǎng)瓶帽子揭下， 橡皮由金屬皮（ 圍脖） 固定于瓶上； 將橡皮塞用70%酒精消毒， 注射器針頭刺穿橡皮塞將血注入培養(yǎng)瓶內(nèi)； 橡皮塞裸露即可。已采集血液的培養(yǎng)瓶盡快送檢。立即放入自動(dòng)血液培養(yǎng)及檢測儀器。 結(jié)果報(bào)告形式陽性初步結(jié)果報(bào)告： 儀器陽性報(bào)警，90%以上陽性標(biāo)本24h內(nèi)檢出； 取出陽性瓶，對(duì)血液涂片及革蘭染色； 立即將涂片結(jié)果（G+、G-細(xì)菌，

10、球菌或桿菌， 或真菌）作為危急值報(bào)告電話 相應(yīng)科室， 或在網(wǎng)上發(fā)出。 結(jié)果報(bào)告形式陽性最終結(jié)果報(bào)告： 將陽性血液接種血平板培養(yǎng)細(xì)菌； 第二天將血平板上生長的細(xì)菌鑒定及MIC法藥敏試驗(yàn)； 第三天發(fā)鑒定及MIC法藥敏結(jié)果的正式報(bào)告。大腸埃希菌 肺炎克雷伯菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌 產(chǎn)氣腸桿菌陰溝腸桿菌 鮑曼不動(dòng)桿菌糞腸球菌溶血葡萄球菌不動(dòng)桿菌復(fù)合體屎腸球菌32 234234461267血液中分離750株菌主要種類及構(gòu)成比% 結(jié)果報(bào)告形式結(jié)果報(bào)告： 自動(dòng)化儀器培養(yǎng)5天仍為，發(fā)報(bào)告。二、尿液的細(xì)菌真菌培養(yǎng)鑒定Etiologic Examination of Urine 目的和意義； 采集

11、方法; 結(jié)果報(bào)告形式。 目的和意義 檢測泌尿系統(tǒng)感染； 細(xì)菌和真菌培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)和藥敏； 也可離心后對(duì)沉渣進(jìn)行涂片檢查，革蘭染色或抗酸染色。采集方法 常采集中段尿，晨起第一次尿送檢最佳；洗，最后用滅菌紗布檫拭； 排尿棄去前段尿，留取中段尿約10ml于無菌容器內(nèi)加蓋送檢。采集方法 病原菌可在溫暖尿液中繁殖，中段尿標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送檢，否則將影響病原菌計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性； 排尿困難者可導(dǎo)尿，避免多次導(dǎo)尿所致感染，導(dǎo)尿包必須為無菌的合格產(chǎn)品。 結(jié)果報(bào)告形式“培養(yǎng)出3種以上細(xì)菌，疑采集污染，重留標(biāo)本”： 如培養(yǎng)出3種或以上細(xì)菌，且無優(yōu)勢菌；約10%的標(biāo)本不合格，采集時(shí)污染，采集中段尿（尤其女性）最好由專門醫(yī)

12、護(hù)人員指導(dǎo)采集，以減少污染。 結(jié)果報(bào)告形式“培養(yǎng)出少量某種細(xì)菌、菌落計(jì)數(shù)結(jié)果”： 如菌量較少 105ml ，且必須有優(yōu)勢，才可以確定為感染，對(duì)優(yōu)勢菌進(jìn)行鑒定和藥敏。 104ml至105ml，也有意義。2335577產(chǎn)氣腸表皮葡萄球尿液中分離1014株菌主要種類及構(gòu)成比%三、糞便的細(xì)菌真菌培養(yǎng)鑒定Etiologic Examination of Stool 目的和意義：對(duì)腸道疾病進(jìn)行病原學(xué)診斷； 涂片染色：查真菌、弧菌、球菌/桿菌比； 培養(yǎng)病原菌和藥敏： 培養(yǎng)沙門氏和志賀菌；培養(yǎng)弧菌；培養(yǎng)真菌； 菌群失調(diào)病人，對(duì)占優(yōu)勢細(xì)菌進(jìn)行鑒定藥敏。 標(biāo)本采集： 挑取含膿、血或粘液糞便約2-3g； 置于清潔容

13、器或置于保存液中送檢； 排便困難者或嬰幼兒可用直腸拭子采集。四、呼吸道標(biāo)本的細(xì)菌真菌培養(yǎng)鑒定 檢查上下呼吸道感染 痰液（下呼吸道）和咽拭子（咽喉部）； 可進(jìn)行涂片查細(xì)菌、真菌或抗酸桿菌； 可進(jìn)行細(xì)菌、真菌或結(jié)核桿菌培養(yǎng)； 上述檢查只要一口痰即可，在一張檢查申請(qǐng)單上選上述多個(gè)項(xiàng)目。 采集方法 采集深部痰（sputum），不是唾液和口水； 自然咳痰法(Expectorated sputum)； 最好為清晨第一口痰，用清水反復(fù)漱口用力咳出第一口痰于無菌容器內(nèi)； 支氣管鏡采集法（Bronchoscopy）。 結(jié)果報(bào)告形式報(bào)“正常菌群”： 培養(yǎng)出的均為不致病的細(xì)菌； 培養(yǎng)出的細(xì)菌種類較多且無優(yōu)勢菌。 結(jié)

14、果報(bào)告形式報(bào)“無菌生長”： 病人抗生素使用過度導(dǎo)致； 可能病毒、支原體、衣原體等血平板無法培養(yǎng)。 結(jié)果報(bào)告形式報(bào)“分離出某種細(xì)菌或真菌，比例，藥敏”： 分離出致病菌，而不是常見的正常菌群，且具有優(yōu)勢，約占血平板菌群總數(shù)的百分比%； 同一病人如痰中連續(xù)分離出同一種菌，3天內(nèi)如果已經(jīng)做過藥敏試驗(yàn)，則不再做藥敏； 同一病人痰中細(xì)菌的種類和比例，會(huì)隨著治療情況變化，也受留取痰標(biāo)本的質(zhì)量影響。銅綠假單胞菌鮑曼不動(dòng)桿菌白色念珠菌金黃色葡萄球菌不動(dòng)桿菌復(fù)合體肺炎克雷伯菌 醋酸鈣不動(dòng)桿菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌大腸埃希菌溶血葡萄球菌產(chǎn)氣腸桿菌肺炎鏈球菌3 3 2153451478109痰液中分離1882株菌主要種類及

15、構(gòu)成比%五、穿刺液的細(xì)菌真菌培養(yǎng)鑒定Etiologic Examination of Cerebrospinal Fluid 目的和意義：判斷是否為感染性疾病 腦脊液采集： 通過腰椎穿刺術(shù)（ Lumber puncture）以無菌操作采集腦脊液3-5ml于無菌小瓶或無菌試管中，一般第一管用于微生物學(xué)檢查； 引起腦膜炎的病原體腦膜炎奈瑟菌等抵抗力弱，不耐冷，故采集的腦脊液應(yīng)立即保溫送檢或床邊接種; 可查一般細(xì)菌真菌、隱球菌、抗酸桿菌。 其它穿刺液：胸腹水、關(guān)節(jié)腔液等，將注射器直接送檢，或床旁接種血培養(yǎng)瓶； 如為多管穿刺液或相關(guān)組織，請(qǐng)?jiān)谏暾?qǐng)單上注明是否都做培養(yǎng)鑒定； 注意無菌操作；如培養(yǎng)出類白喉

16、桿菌，常為采集時(shí)污染所致。六、傷口分泌物的細(xì)菌真菌培養(yǎng)鑒定 開放性化膿灶：應(yīng)先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，再用棉拭子蘸取或注射器吸取膿性分泌物； 瘺管內(nèi)膿液：先用滅菌棉拭子擠壓瘺管棄去前端膿液，再收集膿汁； 封閉性膿腫：可用注射器穿刺抽取。 疑為厭氧菌感染者：取膿液后立即排凈注射器內(nèi)空氣，針頭插入無菌橡皮塞送檢； 如為液體，最好床旁接種厭氧血培養(yǎng)瓶； 外界相通部位標(biāo)本，如痰不能厭氧菌培養(yǎng)。金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌2 222322 217大腸埃希菌糞腸球菌表皮葡萄球菌溶血葡萄球菌肺炎克雷伯菌3奇異變形桿菌512白色念珠菌陰溝腸桿菌688屎腸球菌 產(chǎn)氣腸桿菌普通變形桿菌鮑曼不動(dòng)桿菌無乳鏈球菌傷

17、口分泌物中分離1208株菌主要種類及構(gòu)成比%六、生殖道分泌物的細(xì)菌真菌培養(yǎng)鑒定Etiologic Examination of STDs 性傳播疾病，簡稱 ，是一組通過性行為傳播的 皮膚、性器官和全身多臟器損害的感染性疾??； 標(biāo)本采集：常取生殖道分泌物，男性取口分泌物或前列腺液，女性取 糜爛面病灶邊緣分泌物、 宮頸口分泌物等。（gonorrhea） 涂片染色鏡檢： 急性 性 炎敏感度和特異度高達(dá)90% 以上；對(duì)慢性無癥狀 的女性患者涂片檢查漏診率達(dá)40%，故必須同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)鑒定及藥敏結(jié)果準(zhǔn)確，診斷金標(biāo)準(zhǔn)。解脲/人型支原體： 細(xì)菌室開展了培養(yǎng)鑒定及藥敏方法； 需注意的是標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送

18、檢。 診斷試劑和方法要符合相關(guān)規(guī)定； 注意保護(hù)病人的隱私。第一部分細(xì)菌真菌涂片檢查 第二部分細(xì)菌真菌培養(yǎng)鑒定第三部分細(xì)菌真菌耐藥性檢查第三部分細(xì)菌真菌耐藥性檢查一、常用藥敏試驗(yàn)方法二、常用抗生素種類 三、藥敏試驗(yàn)結(jié)果解讀一、常用藥敏試驗(yàn)方法(1)MIC稀釋法(2)K-B紙片擴(kuò)散法(3)E-test法(1) MIC稀釋法 MIC稀釋法一般在瓊脂或肉湯中將抗菌藥物系列對(duì)倍稀釋，定量接種待檢菌， 35培養(yǎng)18至24小時(shí)后觀察結(jié)果； 抑制檢測菌肉眼可見生長的最低藥物濃度，即最小抑菌濃度； MIC稀釋法結(jié)果以MIC（g/ml）數(shù)值報(bào)告，數(shù)值越小越敏感，與K-B法相反；圖 3- 55MIC 測定法的試驗(yàn)結(jié)

19、果左起第侶管為藥物最低濃度而無細(xì)菌生長 曝 即待檢菌的MlC。細(xì)菌自動(dòng)鑒定及藥敏分析儀MIC稀釋法藥敏試驗(yàn)孔生化試驗(yàn)細(xì)菌鑒定孔 MIC稀釋法藥物濃度主要包括折點(diǎn)濃度，可以判斷敏感、中介、耐藥， 少數(shù)藥物如亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶，萬古 霉素、拉寧、利奈唑胺等在判斷敏感的基礎(chǔ)上， 又增加了一些低濃度，以利于合理選用藥量， 不同抗生素判斷的折點(diǎn)濃度不同，故不同抗生素之間的MIC值沒有可比性。(2) K-B紙片擴(kuò)散法 補(bǔ)充藥敏板沒有的抗生素，如頭孢哌酮/舒巴坦。 含有定量抗菌藥物的紙片，貼在已接種待檢菌的MH平板上， 紙片中所含的藥物，吸取瓊脂中的水分溶解后， 不斷地向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成遞減

20、的藥物梯度濃度。 在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)，細(xì)菌的生長被抑制， 形成透明的抑菌圈。 抑菌圈大小，反映待檢菌對(duì)測定藥物敏感程度。 不同抗生素有不同的判斷標(biāo)準(zhǔn)，不同抗生素的抑菌圈大小沒有可比性。(3) E-test法 結(jié)合K-B法和稀釋法的優(yōu)點(diǎn)； 原理同稀釋法檢測，操作同K-B法簡單； 試紙條上含干化、穩(wěn)定、濃度由高到低呈指數(shù)梯度分布的某種抗菌藥物。 補(bǔ)充鑒定藥敏板沒有的抗生素，如替加環(huán)素（老虎素）。二、常用抗生素種類臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（clinical and laboratory standards of institute, CLSI） 系列指南，每年更新。真菌藥敏試驗(yàn)常用藥物 多烯類

21、：霉素B、制霉菌素。 唑類：克霉唑、咪康唑、益康唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑。 核苷類：氟胞嘧啶。 棘球白素類：卡泊芬凈。三、藥敏試驗(yàn)結(jié)果解讀臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（clinical and laboratory standards of institute, CLSI） 系列指南，每年更新。 敏感（Susceptible，S） 是指菌株能被使用推薦劑量治療感染部位可達(dá)到 的抗菌藥物濃度所抑制，推薦使用。 中介（Intermediate，I） 指抗菌藥物MIC接近血液和組織中通?？蛇_(dá)到的濃度，療效低于敏感菌株。 還表示藥物在生理濃集的部位具有臨床效力（如尿液中的喹諾酮類和-內(nèi)酰胺類），或者可用高于正常劑量的藥物進(jìn)行治療（如-內(nèi)酰胺類）。 另外，中介還作為緩沖區(qū)，以防止微小的、未受控制的技術(shù)因素導(dǎo)致較大的錯(cuò)誤結(jié)果，特別是對(duì)那些藥物毒性范圍窄的藥物。 耐藥（Resistant，R） 指菌株不能被常規(guī)劑量抗