免疫組化染色操作步驟

1、免疫組織化學(xué)染色原理和操作步驟一、免疫組織化學(xué)原理免疫組織化學(xué)（IHC）又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，應(yīng)用帶有可見標(biāo)記的特異性抗體作為探針，檢測組織和細(xì)胞中抗原性物質(zhì)的一種技術(shù)。免疫組化技術(shù)主要有直接法和間接法：直接法是以標(biāo)記的一抗孵育標(biāo)本以檢測其中的抗原成分；間接法則先后加入一抗和二抗，形成抗原一抗二抗復(fù)合體以達(dá)到檢測該抗原的目的，該法因二抗的放大作用而具有較高的敏感性。間接法常用的有過氧化物酶抗過氧化物酶（PAP）法、親和素生物素過氧化物酶（ABC）法和鏈霉親和素過氧化物酶（SP）法。PAP法一抗和二抗均不標(biāo)記，避免了標(biāo)記過程對抗體活性的影響，但需要制備過氧化物酶的抗體

2、，與適量過氧化物酶混合形成PAP復(fù)合物（含3個(gè)酶分子和2個(gè)抗體分子），染色時(shí)依次加入一抗、二抗、PAP復(fù)合物孵育標(biāo)本，最后用H2O2和二氨基聯(lián)苯（DAB）為底物顯示過氧化物酶，即可檢測標(biāo)本中的抗原成分。生物素為含硫的雜環(huán)單羧酸，可通過其羧基與蛋白質(zhì)中的氨基結(jié)合，從而標(biāo)記抗體和酶。親合素又稱抗生物素蛋白，與生物素有很高的親合力，1分子親合素可結(jié)合4分子生物素，ABC法即在此基礎(chǔ)上建立。ABC法與PAP法相似，一抗不標(biāo)記，二抗用生物素標(biāo)記，染色前按一定比例將親和素與生物素標(biāo)記的過氧化物酶混合，制成ABC復(fù)合物，并使親合素分子上至少空出一個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。在標(biāo)本孵育過一抗和二抗后，再加入ABC復(fù)合物

3、使其結(jié)合到二抗的生物素上，最后加入DAB進(jìn)行顯色。ABC法的敏感性較PAP法更高。圖1. 免疫組織化學(xué)基本原理示意圖（引自八年制組織學(xué)與胚胎學(xué)）圖2. SP法原理示意圖SP法與ABC法相似，其不同于ABC法之處在于用生物學(xué)特性與親和素相似的鏈親和素標(biāo)記過氧化物酶。在標(biāo)本孵育過一抗和二抗后，加入鏈親和素標(biāo)記的過氧化物酶使其結(jié)合到二抗的生物素上，最后加入DAB進(jìn)行顯色。與親和素相比，鏈酶親和素的結(jié)合力與親和素相似而非特異性結(jié)合較親和素低。SP法簡化了操作步驟，同時(shí)也減少了非特異性背景，是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫綏化染色技術(shù)。2、 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：1. 標(biāo)本準(zhǔn)備石蠟包埋組織切片：由病理室常規(guī)處理冰凍組織切片

4、：由病理室常規(guī)處理細(xì)胞爬片：將無菌蓋玻片置于六孔板中，接種細(xì)胞，待細(xì)胞生長達(dá)到60以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h。2. 試劑準(zhǔn)備抗體選擇單克隆抗體針對單一表位，具有較高的特異性，但在該表位破壞后將得不到陽性結(jié)果；多克隆抗體表位針對多個(gè)表位，可避免單克隆抗體的缺點(diǎn)，但是可能出現(xiàn)非特異性雜交。因此，不論選擇單克隆還是多克隆抗體，最好同時(shí)購買兩個(gè)貨號的抗體，購買抗體時(shí)一定要明確是能夠做IHC的抗體，抗體說明書上必須有IHC測試結(jié)果。如果該分子文獻(xiàn)報(bào)道較多，可選擇文獻(xiàn)上常用的經(jīng)典抗體。二抗試劑盒目前本實(shí)驗(yàn)室所用二抗試劑盒為Life Technologies Histostain-Plus Ki

5、t (HRP, Broad Spectrum)，貨號85-9043，一抗反應(yīng)性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。DAB試劑盒目前本實(shí)驗(yàn)室所用為加強(qiáng)型DAB顯色試劑盒，貨號DAB-2032。其他試劑二甲苯、無水乙醇、蘇木素、中性封片樹脂、檸檬酸鈉、APES膠3. 抗體特異性驗(yàn)證所有免疫組化抗體均須Western blot驗(yàn)證抗體特異性，并需免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗原定位。4. 耗材準(zhǔn)備免疫組化筆或者蠟筆、蓋玻片、載玻片5. 溶液配制磷酸鹽緩沖液（PBS）10PBS母液配制NaCl72 gNa2HPO412H2O37.3 gKH2PO44.3g加蒸餾水至1000 ml，充分混勻貯存。使用時(shí)用蒸餾水10倍稀釋，調(diào)整

6、pH值至7.37.4。檸檬酸抗原修復(fù)液抗原修復(fù)使用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，配方如下：稱取檸檬酸10.5 g，溶于500 ml蒸餾水；稱取Na2HPO412H2O 57.3g，溶于800 ml蒸餾水。分別量取358 ml檸檬酸溶液和642 ml Na2HPO4溶液，充分混勻后調(diào)整pH值至6.0，即得2母液，貯存?zhèn)溆谩?%鹽酸酒精濃鹽酸與75%酒精按照1:99比例混合，充分混勻。三、免疫組化操作步驟1. 組織片脫蠟水化將組織片依次放入3個(gè)裝有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15 min。依次放入2個(gè)裝有無水乙醇的玻璃缸，每缸5 min。依次放入2個(gè)裝有95%乙醇的玻璃缸，每缸5 min。依次放入9

7、0乙醇、85乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2 min，取出。放入自來水、蒸餾水的玻璃缸中清洗，重復(fù)3次。2. 抗原修復(fù)將切片浸入1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，高壓煮沸后繼續(xù)加熱2 min，然后停止加熱讓切片自然冷卻。注意：抗原修復(fù)過度或不足，均會(huì)影響最終染色結(jié)果。切片驟冷可致脫片，必須自然冷卻！3. 封閉內(nèi)源性過氧化氫酶放入3% H2O2溶液的玻璃缸中，浸泡15 min。放入蒸餾水的玻璃缸中清洗，重復(fù)3次。放入PBS緩沖液的玻璃缸中，浸泡5 min。4. 抗體雜交甩去PBS余液，將組織片平輔在濕盒中，加正常山羊血清1滴20 l（試劑盒中的A液，根據(jù)組織大小調(diào)整用量），28放置20 min，甩干

8、。加稀釋好的一抗1滴（2050 l，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整），置于濕盒4過夜。置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5 min，更換PBS緩沖液，同法操作4次，甩干。加入生物素偶聯(lián)的二抗2050 l（試劑盒中的B液，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整），放置濕盒，37放置20 min。置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5 min，更換PBS緩沖液，同法操作3次，甩干。5. 顯色 加鏈親和素-辣根過氧化物酶2050 l（試劑盒中的C液，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整），濕盒內(nèi)28放置520 min，甩干。置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5 min，更換PBS緩沖液，同法操作3次，甩干。滴加新鮮配制的DAB

9、工作液100 l（以覆蓋組織為宜），放置觀察反應(yīng)部位呈現(xiàn)黃褐色時(shí)（35 min），置裝有自來水玻璃缸中涮洗3次；6. 復(fù)染浸入蘇木精溶液中復(fù)染，放置5 min后，用自來水反復(fù)涮洗至水不變色，再用1%鹽酸酒精分化12 s后，自來水沖洗后，反藍(lán)水洗2 min。7. 脫水、透明和封片依次放入95、95乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡5 min，取出；依次放入2個(gè)無水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡5 min，取出。依次放入2個(gè)裝有二甲苯的玻璃缸中，每缸浸泡5 min，取出。滴加適量中性樹膠，封片，晾干。8. 注意事項(xiàng)整個(gè)染色過程中組織塊要保持濕潤，不能干片，否則會(huì)導(dǎo)致非特異性染色。組織切片邊緣易干，因此抗體、封閉液、顯色液等試劑要充分覆蓋組織塊，避免干片。四、結(jié)果判定1. 陽性細(xì)胞判斷DAB顯色呈黃色。每批染色都要有特異性陽性和陰性對照為基礎(chǔ)，才能對染色結(jié)果作出判斷。抗原表達(dá)必須在特定部位，對于臨床診斷來說，不在抗原所在部位的陽性著色，一概不能視為陽性。盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的著色多系內(nèi)源干擾或人為因素所致，不能視為陽性。2. 抗原表達(dá)評價(jià)免疫顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度是定性定量指標(biāo)，實(shí)際工作中常采