反式作用因子的作用特點和規(guī)律

1、反式作用因子的作用特點和規(guī)律 (1)一種反式因子能與一種以上的順式元件結(jié)合：真核生物的轉(zhuǎn)錄因子不像原核生物的調(diào)控蛋白與順式調(diào)控元件的結(jié)合有高度的專一性，有些反式因子可以和同源性很小的順式元件結(jié)合。 (2)一種順式元件能和一種以上的反式因子結(jié)合：與CAAT框結(jié)合的反式因子有好幾類，如CTF類反式因子、CAAT結(jié)合蛋白(CP)類反式因子等。多種反式因子識別同一順式元件，能加強(qiáng)這些反式因子單獨或協(xié)同調(diào)節(jié)基因表達(dá)的精確性和靈活性。 (3)有些反式因子以二聚體或多聚體與順式元件作用：反式因子二聚體形成的機(jī)制已在前文提及，二聚體以不同因子形成的異二聚體為主。 (4)有些反式因子的活性通過化學(xué)修飾來調(diào)節(jié)：有

2、些反式因子激活基因轉(zhuǎn)錄的活性，是在修飾(磷酸化、乙酰化等)后才具有的。 (5)有些反式因子之間的相互作用對其發(fā)揮功能是必需的：在RNA聚合酶發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用時，幾種轉(zhuǎn)錄因子如TFA、TFB、TFD、TFE的相互作用是必需的。幾種反式因子和RNA聚合酶按一定的時間和空間順序，形成具有活性的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。 真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控 真核細(xì)胞的3種RNA聚合酶(1、和)中，只有RNA聚合酶能轉(zhuǎn)錄生成mRNA，以下主要討論RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。(一)順式作用元件 順式作用元件是指可影響自身基因表達(dá)活性的DNA序列，為特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，J頃式作用元件通常是非編碼序列。順式作用元件并非都位于轉(zhuǎn)錄起點上游(5

3、端)。根據(jù)順式作用元件在基因中的位置、轉(zhuǎn)錄激活作用的性質(zhì)及發(fā)揮作用的方式，可將真核基因的這些功能元件分為啟動子、增強(qiáng)子及沉默子等。 1啟動子 2增強(qiáng)子 3終止子 在3端終止密碼的下游有一段AATAAA的核苷酸序列，它可能對mRNA的加尾有重要作用。這個序列的下游有一個反向重復(fù)序列，轉(zhuǎn)錄后可形成一個發(fā)卡結(jié)構(gòu)。該發(fā)卡結(jié)構(gòu)可以阻礙RNA聚合酶的移動。發(fā)卡結(jié)構(gòu)末尾的一串U與轉(zhuǎn)錄模板DNA中的一串A之間形成的氫鍵結(jié)合力較弱，使mRNA與DNA雜交部分的結(jié)合不穩(wěn)定，mRNA容易從模板上脫落下來，同時RNA聚合酶也從DNA上解離下來，轉(zhuǎn)錄終止。AATAAA序列和其下游的反向重復(fù)序列合稱為終止子，是轉(zhuǎn)錄終止信

4、號。 4沉默子 某些基因含有負(fù)性調(diào)節(jié)元件沉默子，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時，對基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。沉默子最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，以后在T細(xì)胞的T抗原受體基因上也被發(fā)現(xiàn)。沉默子的作用可不受序列方向的影響，也能遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用，并可對異源基因的表達(dá)起作用。 5絕緣子 絕緣子(insulator)長約數(shù)百個核苷酸，通常位于啟動子與增強(qiáng)子或沉默子之間，其明顯特征是能夠絕緣或保護(hù)啟動子免受上游增強(qiáng)子的影響。(二)反式作用因子 反式作用因子又稱轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactors，TF)。絕大多數(shù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子由某一基因表達(dá)后，通過與特異的順式作用元件相互作用反式激活另一基因的轉(zhuǎn)錄，故稱反式作用因子。

5、有些基因產(chǎn)物可特異識別、結(jié)合自身基因的調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)自身基因的開啟或關(guān)閉，這就是順式作用。具有這種調(diào)節(jié)方式的調(diào)節(jié)蛋白稱為順式作用蛋白。 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子分為兩類：基本轉(zhuǎn)錄因子是RNA聚合酶結(jié)合啟動子所必需的一組因子，為所有mRNA轉(zhuǎn)錄啟動共有。特異轉(zhuǎn)錄因子為個別基因轉(zhuǎn)錄所必需，決定該基因的時間、空間特異性表達(dá)，包括轉(zhuǎn)錄激活因子和抑制因子。所有轉(zhuǎn)錄因子至少包括兩個結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域。此外，很多轉(zhuǎn)錄因子還包含一個介導(dǎo)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域，最常見的是二聚化結(jié)構(gòu)域。 1轉(zhuǎn)錄激活域 2二聚化結(jié)構(gòu)域 與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子大多以二聚體形式起作用，與亮氨酸拉鏈、螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。 3DN

6、A結(jié)合域 DNA結(jié)合域(DNA binding domain)通常由60100個氨基酸殘基組成。最常見的DNA結(jié)合域結(jié)構(gòu)形式是鋅指結(jié)構(gòu)和堿性。螺旋。類似的堿性DNA結(jié)合域多見于堿性亮氨酸拉鏈和堿性螺旋環(huán)螺旋。真核基因的轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化相關(guān) 真核基因組DNA絕大部分都在細(xì)胞核內(nèi)與組蛋白等結(jié)合成染色質(zhì)，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、染色質(zhì)中DNA和組蛋白的結(jié)構(gòu)狀態(tài)都影響轉(zhuǎn)錄。 1染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄 細(xì)胞分裂時染色體的大部分到間期時松開分散在核內(nèi)，稱為常染色質(zhì)(euchromatin)，松散的染色質(zhì)中的基因可以轉(zhuǎn)錄。染色體中的某些區(qū)段到分裂期后不像其他部分解旋松開，仍保持緊湊折疊的結(jié)構(gòu)，在間期核中可以看到

7、其濃集的斑塊，稱為異染色質(zhì)(heterochromatin)，其中從未見有基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，原本在常染色質(zhì)中表達(dá)的基因如移到異染色質(zhì)內(nèi)也會停止表達(dá)。哺乳類雌體細(xì)胞2條X染色體，到間期一條變成異染色質(zhì)者，這條X染色體上的基因就全部失活。所以，緊密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)阻止基因表達(dá)。 2組蛋白的作用 早期體外實驗觀察到組蛋白與DNA結(jié)合阻止DNA上基因的轉(zhuǎn)錄，去除組蛋白基因又能夠轉(zhuǎn)錄。組蛋白是堿性蛋白質(zhì)，帶正電荷，可與DNA鏈上帶負(fù)電荷的磷酸基相結(jié)合，從而遮蔽了DNA分子，妨礙了轉(zhuǎn)錄，可能扮演了非特異性阻遏蛋白的作用。染色質(zhì)中的非組蛋白成分具有組織細(xì)胞特異性，可能消除組蛋白的阻遏，起到特異性的去阻遏促轉(zhuǎn)錄作用。

8、活躍轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)區(qū)段，富含賴氨酸的組蛋白(H1組蛋白)水平降低，組蛋白2A2B(H2AH2B)二聚體不穩(wěn)定性增加、組蛋白發(fā)生乙?；?acetylation)、泛素化(ubiquitination)和組蛋白3(H3)巰基化等現(xiàn)象，這些都是核小體不穩(wěn)定或解體的因素或指征。轉(zhuǎn)錄活躍的區(qū)域也常缺乏核小體的結(jié)構(gòu)。這些都表明核小體結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄。 3轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域?qū)怂崦缸饔妹舾卸仍黾?染色質(zhì)DNA經(jīng)DNase I作用后，通常會被降解成100bp和400bP的片段，反映了完整的核小體規(guī)則的重復(fù)結(jié)構(gòu)。但活躍進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)區(qū)域受DNase I消化后，常出現(xiàn)100200bp的DNA片段，且長短不均一，說明其D

9、NA受組蛋白掩蓋的結(jié)構(gòu)有變化，出現(xiàn)了對DNase I的高敏感點(hypersensitivesite)。這種高敏感點常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄基因的5端、3端或在基因上，多在調(diào)控蛋白結(jié)合位點附近。該區(qū)域核小體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可能有利于調(diào)控蛋白結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。 4DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化 天然雙鏈DNA的構(gòu)象大多是負(fù)性超螺旋。當(dāng)基因活躍轉(zhuǎn)錄時，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄方向前方DNA的構(gòu)象是正性超螺旋，其后面的DNA為負(fù)性超螺旋。正性超螺旋會拆散核小體，有利于RNA聚合酶向前移動轉(zhuǎn)錄，而負(fù)性超螺旋則有利于核小體的再形成。 5DNA堿基修飾變化 真核DNA中的胞嘧啶約有5被甲基化為5甲基胞嘧啶(5methylcytosine，

10、m5C)，而活躍轉(zhuǎn)錄的DNA片段中胞嘧啶甲基化程度常較低。這種甲基化最常發(fā)生在某些基因5側(cè)區(qū)的CpG序列中，實驗表明這段序列甲基化可使其后的基因不能轉(zhuǎn)錄，甲基化可能阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA特定部位的結(jié)合從而影響轉(zhuǎn)錄。如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常發(fā)育而死亡，可見DNA的甲基化對基因表達(dá)調(diào)控是重要的。 由此可見，染色質(zhì)中的基因轉(zhuǎn)錄前先要有一個被激活的過程，但目前對激活機(jī)制還缺乏認(rèn)識。 基因表達(dá)的概念及特點 真核基因組比原核基因組復(fù)雜得多，至今人類對真核基因組的認(rèn)識還很有限。要搞清楚人的全部基因的功能及其相互關(guān)系，特別是要明了基因表達(dá)調(diào)控的全部規(guī)律，還需要經(jīng)歷很長期

11、艱巨的研究過程。 (一)基因表達(dá)的概念 基因表達(dá)就是基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程。在一定調(diào)節(jié)機(jī)制控制下，大多數(shù)基因經(jīng)歷基因激活、轉(zhuǎn)錄及翻譯等過程，產(chǎn)生具有特異生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子。但并非所有基因表達(dá)過程都產(chǎn)生蛋白質(zhì)，tRNA、rRNA編碼基因轉(zhuǎn)錄合成RNA的過程也屬于基因表達(dá)。 (二)基因表達(dá)的時間性及空間性 基因表達(dá)的時間、空間特異性由特異基因的啟動子(序列)和(或)增強(qiáng)子與調(diào)節(jié)蛋白相互作用所決定。 1時間特異性 按功能需要，某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按特定的時間順序發(fā)生，這是基因表達(dá)的時間特異性。多細(xì)胞生物基因表達(dá)的時間特異性又稱階段特異性。 2空間特異性在個體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體按不同組

12、織空間順序出現(xiàn)，這就是基因表達(dá)的空間特異性，又稱細(xì)胞特異性或組織特異性。 (三)基因表達(dá)的方式 1組成性表達(dá) 某些基因產(chǎn)物對生命全過程是必需的或必不可少的。這類基因在一個生物個體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，通常被稱為管家基因。管家基因較少受環(huán)境因素影響，而是在個體各個生長階段的大多數(shù)或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小。這類基因表達(dá)視為基本的或組成性基因表達(dá)。 2誘導(dǎo)和阻遏表達(dá) 與管家基因不同，另有一些基因表達(dá)極易受環(huán)境變化影響。在特定環(huán)境信號刺激下，相應(yīng)的基因被激活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，這種基因是可誘導(dǎo)的，稱為誘導(dǎo)。相反，如果基因?qū)Νh(huán)境信號應(yīng)答時被抑制，基因表達(dá)產(chǎn)物水平降低，稱為阻遏。誘導(dǎo)和阻遏

13、是同一事物的兩種表現(xiàn)形式，在生物界普遍存在，也是生物體適應(yīng)環(huán)境的基本途徑。在一定機(jī)制控制下，功能上相關(guān)的一組基因，無論其為何種表達(dá)方式，均需協(xié)調(diào)一致、共同表達(dá)，即為協(xié)調(diào)表達(dá)。這種調(diào)節(jié)稱為協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)。 全基因組掃描 遺傳分析仍是當(dāng)前對致病相關(guān)基因識別、鑒定的主要方法，分為連鎖分析和關(guān)聯(lián)研究兩種。由于人類基因組多態(tài)性的研究以及SNP分型技術(shù)的發(fā)展，目前全基因組連鎖分析和關(guān)聯(lián)研究亦變得切實可行。根據(jù)研究規(guī)模的大小，可以將疾病遺傳分析分為以下幾類，即定位克隆、連鎖不平衡基因定位、全基因組候選基因分析、候選基因關(guān)聯(lián)研究和定位候選基因克隆，其中定位克隆、連鎖不平衡基因定位和全基因組候選基因分析均屬于全基因組

14、掃描。 不管是單基因疾病還是多基因疾病，通常是先行全基因組掃描(genome scanning)；將疾病相關(guān)位點定位于染色體某個區(qū)域，然后再行候選基因策略或連鎖不平衡分析，確定致病基因位點。如果利用家系進(jìn)行連鎖分析，即采用定位克??；若是利用群體樣本，則應(yīng)用連鎖不平衡分析進(jìn)行基因定位。全基因組掃描已成功地應(yīng)用在許多疾病的致病相關(guān)基因克隆上，并取得了一定的成果。 全基因組掃描所利用的是在人類基因組大量存在的微衛(wèi)星或SNP，雖然當(dāng)前使用較多的仍是微衛(wèi)星，但由于芯片技術(shù)的發(fā)展，全基因組高分布密度的商品化SNP芯片相繼面世(如Affymetrix公司的10k，100k和500k人基因組SNP芯片)，越來

15、越多的研究者使用SNP進(jìn)行全基因組掃描。由于這些高密度的SNP芯片價格昂貴，不是一般的實驗室所能承受。 微衛(wèi)星全基因組掃描的原理是利用特定的引物將某條染色體上特定位置的微衛(wèi)星擴(kuò)增出來，并進(jìn)行分析。這種分析所使用的微衛(wèi)星通常具有較高的多態(tài)性，在不同的個體其長度不盡相同(也就是微衛(wèi)星基本單位重復(fù)次數(shù)的不同)，而不同長度的PCR產(chǎn)物則代表某一位點不同的等位基因。該種分析方法實際上是利用平均分布于各條染色體上的密度約為10cM的微衛(wèi)星，檢測每個微衛(wèi)星是否存在與其鄰近的疾病相關(guān)基因座位連鎖。全基因組掃描并不能直接搜尋具體的疾病相關(guān)基因，而是通過研究均勻分布于整個基因組的微衛(wèi)星標(biāo)記來間接選擇其相關(guān)的基因座

16、位。在得到陽性結(jié)果后，又可在這些陽性位點附近再加密微衛(wèi)星標(biāo)記或利用SNP，用同樣的方法來確定哪一個多態(tài)性位點與疾病連鎖的可能性最大等等。這樣在不斷地縮小分析范圍后，疾病相關(guān)基因定位的范圍也越來越精細(xì)。由于人類基因組序列已知，一旦發(fā)現(xiàn)了與疾病相關(guān)基因連鎖兩側(cè)的遺傳標(biāo)記，根據(jù)標(biāo)記位點的具體位置，我們就可以知道定位區(qū)域內(nèi)所有的基因。因此，當(dāng)定位區(qū)域確定后，在該區(qū)域內(nèi)選擇候選基因直接進(jìn)行測序，對所發(fā)現(xiàn)的突變在病人和對照組進(jìn)行分型并分析，搜尋致病基因。另一個方法是直接從公共數(shù)據(jù)庫挑選候選基因編碼區(qū)、調(diào)控區(qū)(包括內(nèi)含子)中的SNP，進(jìn)行連鎖不平衡分析，確定致病基因。 雖然單個SNP的多態(tài)信息量(polym

17、orphism information content，PIC)不如微衛(wèi)星，但在相同的PIC值的要求下，SNP圖譜的密度為微衛(wèi)星圖譜的22525倍。因此在相同的信息提取效果下，利用10cM間隔的微衛(wèi)星圖譜即300個左右的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行初期定位，與4cM分辨率的約750個SNP圖譜差不多，顯然后者對基因定位的范圍更精細(xì)，因此利用SNP標(biāo)記能檢測出微衛(wèi)星標(biāo)記不能探測到的疾病相關(guān)區(qū)域。隨著人類基因組的重測序和DNA芯片技術(shù)的不斷完善，目前已有應(yīng)用于全基因組掃描的SNP芯片，如Affymetrix公司的GeneChip Mapping 500K ArraySet、100kArraySet和10k的SNP芯片(SNP數(shù)目分別約為50萬、10萬和1萬)。顯然這些芯片的SNP分布密度以及信息度大大高于定位克隆常規(guī)使用的微衛(wèi)星，并已成功應(yīng)用于疾病相關(guān)基因的研究。預(yù)計隨著SNP芯片的進(jìn)一步完善和成本的降低，將是未