SNP開發(fā)驗(yàn)證的研究方法和技術(shù)路線

1、SNP開發(fā)/驗(yàn)證的研究方法和技術(shù)路線1分子標(biāo)記：分子標(biāo)記，我想這部分是我們分子標(biāo)記組最核心的任務(wù)。現(xiàn)在，我們沒有任何可用的標(biāo)記檢測我們的定位材料。即使想要驗(yàn)證已經(jīng)定位的QTLs，我們也需要相對應(yīng)的區(qū)間內(nèi)的分子標(biāo)記，尤其是SNP標(biāo)記。1.1 全基因組SNPAffymetrix芯片：一套完整的全基因組的SNP芯片，相對于Douglas體系，其操作簡單，高通量?？梢灾苯訉Χㄎ蝗后w進(jìn)行初定位的掃描或是對育種材料的背景進(jìn)行分析。在國家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用來對玉米材料進(jìn)行高通量檢測，基因型檢測結(jié)果通?？梢杂脕鞶TLs初定位，育種材料的群體劃分與純度鑒定以及低密度的關(guān)聯(lián)分析

2、等。在此，我建議我們應(yīng)該開發(fā)一套番茄基因型檢測的芯片。目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720條探針。而Affymetrix公司目前并沒有相應(yīng)的產(chǎn)品。但是通過跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的結(jié)果進(jìn)行開發(fā)。番茄目前測序結(jié)果顯示其全基因組大小為760Mb，而玉米為2,500Mb，但是他們包括的基因數(shù)目30,000個(gè)，整體情況相近。另外，番茄作為自交植物，其LD的衰減值應(yīng)該更大，有效的歷史重組會(huì)更少，遺傳多樣性低。因此，綜合考慮，我建議我們可以開發(fā)3k芯片，應(yīng)該可以滿足大多數(shù)研究材料、育種材料的基因型檢測需求。雖然目前下一代測序技術(shù)

3、蓬勃發(fā)展，但是對于用于基因型檢測來講，其數(shù)據(jù)分析與成本相對于芯片都要更復(fù)雜和更高。總之，我們番茄處于剛剛發(fā)展階段，我認(rèn)為就基因型檢測方面，芯片有其很高的應(yīng)用價(jià)值。即使像玉米，這樣測序技術(shù)發(fā)展很多年的材料，芯片技術(shù)也在應(yīng)用。1.2全基因組SNPDouglas：當(dāng)用Affymetrix芯片檢測鑒定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）對于優(yōu)良的QTLs或是基因，我們可以直接選擇覆蓋整個(gè)區(qū)間的分子標(biāo)記運(yùn)行Douglas系統(tǒng)進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種，2）對于需要進(jìn)一步驗(yàn)證的QTLs，我們也可以利用Douglas系統(tǒng)只檢測材料覆蓋定位區(qū)間的基因型，而不需要再一次利用Affymetrix芯片或是其他方法進(jìn)行全

4、基因檢測（圖1.1）。3）對于一些高信息量，均勻分布在全基因的SNP分子標(biāo)記，可以用來構(gòu)建番茄的指紋圖譜。因此，一套完整能夠與Affymetrix芯片相對應(yīng)的SNP標(biāo)記是必不可少的。圖1.1 QTL區(qū)間上的SNP標(biāo)記分布圖注：藍(lán)色為深入片段，棕色為背景染色體。1.3 Douglas系統(tǒng)下SNP標(biāo)記的開發(fā)通過建立穩(wěn)定、可靠的番茄DNA提取流程與優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，篩選具有一致性、穩(wěn)定性與多態(tài)性SNP分子標(biāo)記引物，從而構(gòu)建番茄全基因組SNP分子標(biāo)記。全基因組的SNP分子標(biāo)記，可以用于番茄QTL定位群體的檢測，分子標(biāo)記輔助育種的選擇以及全基因組選擇的群體基因型的檢測。同時(shí)，從中挑選高質(zhì)量，高信息量的

5、分子標(biāo)記用于構(gòu)建一套完成的番茄指紋圖譜，檢測品種一致性。1.3.1 供試材料：22份材料的DNA用作特異性引物篩選，2份水作為NTC（None Template Control），共計(jì)24份模板作為SNP引物的初期篩選。以上實(shí)驗(yàn)在Q6儀器上進(jìn)行。對于篩選獲得的一致性引物，在利用94株番茄自交系與2份水作為模板，進(jìn)一步在Douglas儀器上驗(yàn)證。1.3.2 DNA提?。?. 取10mg 植物組織，加入研磨介質(zhì)和400l 裂解液，研磨5min，3000g離心5min。2. 加入裂解液1/3 體積的提取液，旋渦振蕩混勻，冰?。ɑ蛑糜?20冰箱中）5min，于4，3200g 離心10min，吸取上清3

6、00400l 加入到樣品板中。3. 按照下表在各96 孔板中加入試劑：板號板型板名成分樣品及試劑體積1Microtiter deep well 96plate樣品板（Lysis）樣品反應(yīng)液無水乙醇300400l400l2Microtiter deep well 96plate洗滌板I（W1）PW磁珠800l30l3Microtiter deep well 96plate洗滌板II（W2）80%乙醇磁套800l4KingFisher 96 KF plate洗脫板（Elution）TE1.050100l4. 將各96 孔板按儀器提示順序放入儀器中，運(yùn)行程序。5. 程序運(yùn)行結(jié)束后，將DNA 溶液轉(zhuǎn)移

7、PCR 板中并測量濃度（100ng/l），進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或于-20保存待用。1.3.3 分子標(biāo)記命名：分子標(biāo)記全部采用統(tǒng)一的命名規(guī)則，這樣有利于結(jié)果的修改與維護(hù)。例如：名稱IDSNP位點(diǎn)正向引物反向引物模板序列SolBeckman-00001-V1Sol00001A/G引物合成：由上海生工公司負(fù)責(zé)引物合成。1.3.4 SNP分子標(biāo)記的開發(fā)：最近，Sim等人利用番茄的Illumina芯片檢測410份自交系與16份番茄品種的基因型。本研究在此基礎(chǔ)上，利用Illumina開發(fā)的7,720條探針序列，選擇其中丟失頻率小于10%，等位基因頻率大于10%的探針序列，獲得3,500條探針序列，作為SNP引物開

8、發(fā)的模板序列（），每條序列的長度為100bp，SNP 上下游各50bp。初期，我們可以從3500條探針中，選取120探針序列作為模板發(fā)展引物，這120條序列要求分布在12條染色體上而且在每條染色體上盡量保證均勻分布。如果實(shí)驗(yàn)成功，我們可以逐步地將剩余的探針序列發(fā)展成為SNP引物。1.3.5正向引物設(shè)計(jì)：由于我們需要使用KASP基因分型檢測試劑盒，本試劑盒對正向引物已經(jīng)確定為SNP位點(diǎn)上游20bp（包括SNP位點(diǎn)），同時(shí)需要人工加上FAM或是HEX序列（圖1.2）。因此，我們需要單獨(dú)設(shè)計(jì)反向引物。圖1.2 正向引物設(shè)計(jì)1.3.6反向引物設(shè)計(jì)：利用Prim

9、er3.0軟件對模板序列進(jìn)行引物選擇，引物參數(shù)設(shè)定如下：1 引物長度為1825bp；2 GC含量為4060%；3 TM值5862C。如果其上述模板序列不足以滿足引物開發(fā)的需要：我們可以利用剩余4,200條探針，繼續(xù)開發(fā)新的引物。另外，我們還可以利用PCR產(chǎn)物測序的方式獲得gap中序列，尋找新的SNP位點(diǎn)。1.3.6 PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系需要保證均一化，這樣可以滿足將來在Douglas系統(tǒng)下進(jìn)行SNP檢測。初期我們會(huì)在Q6儀器上進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索一致后，再在Douglas系統(tǒng)中進(jìn)行。Primer Mix反應(yīng)體系：名稱體積（l）FAM-Primer12HEX-Primer12R

10、everse-Primer30ddH2O46Total100PCR反應(yīng)體系：名稱體積（l）Reaction Mix2.5Primer Mix0.7ddH2O0.8DNA1Total51.3.7 PCR反應(yīng)程序：我們的PCR產(chǎn)物應(yīng)該都為100bp，因此我們可以采用統(tǒng)一設(shè)定，保證均一化。采用兩步法進(jìn)行PCR反應(yīng)，前期篩選引物我們設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)性梯度：60C、57C以及55C，以便找到最合適的復(fù)性溫度。首先，利用60C的復(fù)性溫度進(jìn)行篩選：步驟參數(shù)意義125C 1:30min反應(yīng)前收集熒光294C 10min預(yù)變性394C 15s變性460C 1min復(fù)性，延伸53-4重復(fù)40個(gè)循環(huán)625C 1:30mi

11、n反應(yīng)完收集熒光如果SNP引物在60C復(fù)性溫度時(shí)擴(kuò)增結(jié)果正常，則保留該引物在60C復(fù)性進(jìn)行PCR反應(yīng)。如果得到引物擴(kuò)增效果不好，則降低復(fù)性溫度，利用57C進(jìn)行復(fù)性。57 C復(fù)性溫度PCR反應(yīng)程序篩選：步驟參數(shù)意義125C 1:30min反應(yīng)前收集熒光294C 10min預(yù)變性394C 15s變性457C 1min復(fù)性，延伸53-4重復(fù)40個(gè)循環(huán)625C 1:30min反應(yīng)完收集熒光如果SNP引物在57C復(fù)性溫度時(shí)擴(kuò)增結(jié)果正常，則保留該引物在57C復(fù)性進(jìn)行PCR反應(yīng)。如果得到引物擴(kuò)增效果不好，則降低復(fù)性溫度，利用55C進(jìn)行復(fù)性。最終，如果55C復(fù)性溫度時(shí)，反應(yīng)結(jié)果不好，則該SNP引物剔除去掉。5

12、5C復(fù)性溫度PCR反應(yīng)程序篩選：步驟參數(shù)意義125C 1:30min反應(yīng)前收集熒光294C 10min預(yù)變性394C 15s變性455C 1min復(fù)性，延伸53-4重復(fù)40個(gè)循環(huán)625C 1:30min反應(yīng)完收集熒光1.3.8 SNP分子標(biāo)記準(zhǔn)確性驗(yàn)證：對于已在21份模板DNA擴(kuò)增穩(wěn)定的SNP引物，需要進(jìn)一步在大群體中驗(yàn)證其穩(wěn)定性、一致性、多態(tài)性。選擇84份番茄自交系或品種的DNA，通過相同的PCR方法，驗(yàn)證新開發(fā)的SNP分子標(biāo)記。1.3.9目標(biāo)要求：番茄全基因組SNP標(biāo)記：在番茄的全基因上，我們獲得1200對特異的SNP引物（平均100對/染色體）覆蓋番茄的全基因組。已獲得在12份模板DNA

13、能夠穩(wěn)定擴(kuò)增的SNP分子標(biāo)記，全部保留。2分子標(biāo)記輔助育種：2.1 ILs群體：如果利用現(xiàn)在群體不再進(jìn)一步構(gòu)建亞群體，ILs群體（L pennellii漸滲系群體）76個(gè)自交系，整個(gè)群體數(shù)目較小，不利于定位及QTLs驗(yàn)證（圖2.1）。但是對于這些材料的滲入片段都已經(jīng)注視清楚，因此我們可以直接比較深入系與M82自交系的表型差異，如果存在顯著性差異，則可以定義為有深入片段引起的表型差異。當(dāng)鑒定結(jié)果與已定位的QTLs信息一致時(shí)，我們就認(rèn)為此QTL在區(qū)間內(nèi)。同時(shí)我們要檢索此QTL定位時(shí)的位置，以此為基礎(chǔ)發(fā)展SNP標(biāo)記，用于以后分子標(biāo)記輔助育種。對于每個(gè)QTL的區(qū)間，需要發(fā)展48個(gè)SNP標(biāo)記覆蓋其定位區(qū)

14、間（圖1.1），其中，區(qū)間外兩段各一個(gè)標(biāo)記，內(nèi)部26個(gè)SNP標(biāo)記。這樣可以保證目標(biāo)QTL被完整的應(yīng)用。SNP標(biāo)記的開發(fā)，此時(shí)的SNP標(biāo)記只需要在ILs群體的兩個(gè)親本中有多態(tài)性就可以應(yīng)用。引物設(shè)計(jì)同全基因組SNP引物設(shè)計(jì)相同。性狀驗(yàn)證：對于確定的QTLs，我們需要開發(fā)對應(yīng)的SNP標(biāo)記，利用這些標(biāo)記重新驗(yàn)證定位結(jié)果：圖2.1 深入系材料的基因型2.2 IBLs群體：IBLs群體本身就是分離群體，因此可以直接用作定位（圖2.2）。如果該群體基因型已經(jīng)被鑒定，我們可以直接利用鑒定的基因型結(jié)合我們自己調(diào)查的表型，獲得QTL初定位的結(jié)果。同時(shí)，利用Affymetrix芯片進(jìn)行全基因組的SNP檢測，然后與表

15、型數(shù)據(jù)相結(jié)合進(jìn)行分析。然后，需要查看定位的QTL區(qū)間內(nèi)是否存在3 Douglas系統(tǒng)下SNP標(biāo)記，如果滿足分子標(biāo)記輔助育種的應(yīng)用，可以直接應(yīng)用。如果QTL區(qū)間內(nèi)的沒有或是過少的SNP標(biāo)記，則需要重新開發(fā)SNP標(biāo)記（標(biāo)記開發(fā)同上）。圖2.2 IBLs群體構(gòu)建2.3性狀調(diào)查：從我的觀點(diǎn)出發(fā)，對于分子育種比較有價(jià)值研究的QTL，應(yīng)為育種家需求的性狀所對應(yīng)的QTL。我認(rèn)為我們需要跟番茄育種家合作并討論育種需求與育種目標(biāo)。鑒于目前ILs群體定位情況（表1，表2），我認(rèn)為我們可以從中選擇一些我們能夠鑒定測量的性狀進(jìn)行研究，例如：糖分，可溶性固形物的含量，果實(shí)形狀與大小等?？傊覀円軌驕y量這些性狀。同時(shí)，

16、對于需要研究性狀，我們需要對其進(jìn)行界定，比如果實(shí)大小，我們需要測量成熟后幾天的果實(shí)，作為統(tǒng)一的判定。以保證性狀測量的準(zhǔn)確性。為了能夠獲得準(zhǔn)確的田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)該采用良好的田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在此，建議：現(xiàn)有的兩個(gè)群體材料都為永久性群體，一般可以采用隨機(jī)區(qū)組或是裂區(qū)設(shè)計(jì)，每個(gè)系23個(gè)重復(fù)，鑒定表型。因此我認(rèn)為我們應(yīng)該進(jìn)行田間實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，保證表型數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。3 SNP指紋圖譜構(gòu)建：通過已經(jīng)獲得的全基因SNP分子標(biāo)記，進(jìn)一步可以從中挑選出穩(wěn)定、一致的48對SNP分子標(biāo)記構(gòu)建番茄的指紋圖譜。挑選參數(shù)為：3.1 等位基因頻率（Allele Frequency）在一個(gè)二倍體的某特定基因座上某一個(gè)等位基因占該基因座上等位基因總數(shù)的比率，是群體遺傳結(jié)構(gòu)的一個(gè)最基本的尺度，該基因座上所有等位基因的頻率之和為1，對于SNP分子標(biāo)記，一般只包括兩種等位基因。因此，其等位基因頻率在0.5時(shí)為最適宜值。3.2 多態(tài)性信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）：多態(tài)信息量(Polytnorphism Information Content，PIC)由Botstein等在1980年提出，用來評價(jià)一個(gè)多態(tài)性基因座使用價(jià)值的一個(gè)量化概念。PIC由該基因座的等位基因數(shù)、等位基因頻率分布兩個(gè)因素決定。標(biāo)記基因座的等位基因數(shù)越多、各等位基因頻率