我的基因工程操作程序2

1、二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,1、為什么需要構(gòu)建基因表達(dá)載體？,2、如果運(yùn)載體是質(zhì)粒,如何構(gòu)建？,基因表達(dá)載體的組成：,目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因+復(fù)制原點(diǎn),它們有什么作用？,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,1.轉(zhuǎn)化,2.常用的受體細(xì)胞,3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理,借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。,動(dòng)植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4.方法,將目的基因?qū)?植物細(xì)胞,將目的基因?qū)?動(dòng)物細(xì)胞,將目的基因?qū)?微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,檢測(cè),鑒定,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目

2、的基因,檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法,方法,方法,DNA分子雜交,分子雜交（注意與上不同之處）,抗原抗體雜交,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？,不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是： （1） 生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)； （2） 通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄； （3） 目的

3、基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記； （4） 為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等； （5） 有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。 即真正被用作載體的質(zhì)粒都需在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工改造， 且受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入方法不同，均需構(gòu)建。,基因表達(dá)載體的構(gòu)建,基因表達(dá)載體的功能：使目的基因在受體細(xì)胞中存在，并且遺傳給下一代；使目的基因表達(dá)和發(fā)揮作用 啟動(dòng)子：位于基因的首端，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA 終止子 ：位于基因的尾端。終止

4、轉(zhuǎn)錄 標(biāo)記基因：檢測(cè)受體細(xì)胞是否含有目的基因,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物；Ti質(zhì)粒的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體上。 轉(zhuǎn)化:目的基因插入TDNA農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞穩(wěn)定維持和表達(dá),農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,操作程序： 目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩?顯微注射體內(nèi)發(fā)育新性狀動(dòng)物,顯微注射技術(shù),2.微生物作受體細(xì)胞原因：,3.轉(zhuǎn)化方法：,大腸桿菌,繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少,處理細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 _細(xì)胞吸收DNA分子。,Ca2+,感受態(tài),感受態(tài),1.常用菌：,將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序