植物組織培養(yǎng)和生物反應(yīng)器.ppt

1、紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇,BY 孔華庭,通常認(rèn)為世界上紅豆杉屬植物有11種，中國有4種和1變種，分別是中國紅豆杉，西藏紅豆杉或喜飛拉雅紅豆杉、云南紅豆杉 ，東北紅豆杉和南方紅豆杉。紫杉醉是一種四環(huán)二路的化合物，經(jīng)過x、n與n期臨床試驗己證實是一種良好的抗癌藥物，但該化合物在紅豆杉植物中含量極低，約為0.01，并且提取困難；此外，該化合物不溶于水及在臨床應(yīng)用中亦有較大毒性，因而限制了其廣泛應(yīng)用。為解決以上問題，人們對紫杉酵的化學(xué)性質(zhì)，特別是其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進行了廣泛深人的研究，并取得了重大進展。了解紫杉醉的化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗癌活性的關(guān)系，可為解決資源短缺、增加此種化合物來源和尋找高效低毒的新紫杉露類

2、似物提供理論依據(jù)，并可研制出一些同位京標(biāo)記的策杉醉類似物用于檢測紫杉醉的生物學(xué)活性。,按美國國立癌癥研究所制訂的抗腫瘤休外和體內(nèi)篩選方案，對紫杉醉的抗腫瘤活性進行了試驗，在離體培養(yǎng)的細(xì)胞中加入2.5mmol/L紫杉醇可抑制Hela細(xì)胞生長；對KB細(xì)胞和L1210集落形成的抑制強度超過長春堿與秋水仙堿。,紫杉醇抗癌效果十分顯著！,紫杉醇的抗癌機理,紫杉醇是一種抗微管藥物，為細(xì)胞有絲分裂抑制劑或紡錘體毒物。這種作用對于迅速分裂的腫瘤細(xì)胞，可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在有絲分裂時，不能形成紡錘體和紡錘絲，抑制細(xì)胞分裂和增殖，使腫瘤細(xì)胞停止在G2期和M期，直到死亡。體外研究證明，紫杉醉以濃度依賴性方式可逆地結(jié)合到

3、N端微管蛋白的p亞單位上，增加聚合的速率和產(chǎn)量。紫杉醉能抑制有絲分裂時所必需的微管網(wǎng)的正常再生，防止紡錘體形成，導(dǎo)致染色體的斷裂并抑制細(xì)胞復(fù)制和移行。,作用比較復(fù)雜，有多種因素,天然提取紫杉醇,紫杉醇最早是從太平洋紅豆杉的樹皮中提取的，后來人們對其他紅豆杉屬植物的各部位包括針葉、嫩枝、樹皮及心材中的紫杉醉含量進行了分析，發(fā)現(xiàn)樹皮巾含量最局，枝葉次之，心材最低。因此從針葉中提取紫杉醉引起人們足夠的重視。即使針階中紫杉醇含量稍低但其產(chǎn)量與樹皮相當(dāng)，因針葉的總量是樹皮的24倍，而且針葉的再生力強，采集后對樹的生命無太大的影響，不會造成生態(tài)環(huán)境的破壞。由于多種紅豆杉桓株的小枝及針葉中紫杉醇含量與樹皮相

4、近，因此可采用人工培栽大量的紅豆杉桓株，利用從這些栽培植抹上餡剪下的小枝條及針葉提取紫杉醇。,從人工栽培植襪的小枝條與針葉中提取紫杉醇可能是獲取紫杉醉最便宜的途徑，其缺點是人工栽培需時較長，并且受到土地及地理條件等限制。,紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo),植物體是一個有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞系統(tǒng)，植物體中的不同組織及組成組織的不同細(xì)胞，均是以高度的協(xié)調(diào)方式在發(fā)揮作用。一個有結(jié)構(gòu)的器官或組織，如根、莖或葉等，將它與母體分離及培養(yǎng)在含有適當(dāng)激素的培養(yǎng)基里時，就可能轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N能迅速增殖的細(xì)胞團，即愈傷組織。,影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素,因素一：外植體的選擇。目前幾乎已從所有紅豆杉中誘導(dǎo)出愈傷組織。大量實驗結(jié)果表明，幼莖是最

5、合適的外植體。大部分愈傷組織呈淺黃色，易碎。從紅豆杉的針葉也可誘導(dǎo)出愈傷組織，但生長速度在早期較坦，這可能與針葉中相對較小比例的分生組織和薄型組織有關(guān)，其他幾種紅豆杉中誘導(dǎo)愈傷組織的實驗也都表明，幼莖是誘導(dǎo)愈傷組織最合適的外植體。,因素二： 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。激素成分的加入對愈傷組織的誘導(dǎo)極為重要。在通常情況下，生長素和細(xì)胞分裂素對保持愈傷組織的高速生長是必需的，特別是當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長素聯(lián)合應(yīng)用時，能更強烈地刺激愈傷組織的形成，最常使用的生長京是IAA、NAA和2，4D，最常用的細(xì)胞分裂素是激動素(KT)和六芐氨基嘌呤(6BA)。,因素三：誘導(dǎo)條件。在紅豆杉的組織培養(yǎng)中，適宜于誘導(dǎo)愈傷組織的

6、溫度為20一26c。愈傷組織在黑暗和光照下都可被誘導(dǎo)，但光照下誘導(dǎo)率低，形成量少。,紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化,有研究者曾把愈傷組織狀態(tài)的變化明確地列成數(shù)軸表示，數(shù)軸上標(biāo)記的是典型的不同類型的愈傷組織任何愈傷組織類型基本上都可以在數(shù)軸上找到相應(yīng)的位置。組織培養(yǎng)實際上就是按需要調(diào)控這些類型的愈傷組織間的相互轉(zhuǎn)化。Se是指細(xì)胞處在胚性狀態(tài)時的值，高于它時愈傷組織就會旺長，低于它時就會分化。從大量培養(yǎng)來講，se值高時細(xì)胞分裂快、生長好，低時則產(chǎn)生次生代謝物的能力強。因為任何培養(yǎng)物按其主要特征都可以在圖32所示的數(shù)軸上找到位置，所以無論對所培養(yǎng)的組織細(xì)胞是否熟悉，無論所選的培養(yǎng)基是否合適，理論上按

7、照模型和對外界因子(植物激素、氮源、無機離子及維生素、碳源、滲透壓、物理因素)的認(rèn)識都可對培養(yǎng)物進行調(diào)控，使之朝所需方向或位置移動。,試驗中，通過狀態(tài)調(diào)控把琉松愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)橹旅苡鷤M織顆粒，轉(zhuǎn)變后的愈傷組織內(nèi)部有一定程度的分化，如管狀分子的出現(xiàn)，每個顆?？煽醋魇且粋€有機整體，這些類似于有機體的顆粒中的分化結(jié)構(gòu)可能為營養(yǎng)和代謝物質(zhì)的輸送提供通道，而且這種有效的物質(zhì)傳遞通道不同于人工固定化的植物細(xì)胞顆粒，它只在具有一定結(jié)構(gòu)的植物組織中存在。因此，致密愈傷組織顆粒能積累較多的次生代謝產(chǎn)物紫杉醇。,添加抗褐變劑,在紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)過程中，常常會發(fā)生細(xì)胞褐變的現(xiàn)象，輕者影響細(xì)胞生長和繁殖，

8、重則導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如何減輕或控制褐變的發(fā)生，是紅豆杉組織培養(yǎng)中重要的研究內(nèi)容。紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生褐變的原因復(fù)雜，與材料的基因型和生理狀態(tài)、培養(yǎng)基成分和激累配比等因素有關(guān)。因此，要防止褐變發(fā)生，減輕褐變危害，除了要選擇合適的外植體、培養(yǎng)基和適宜的激家組合外，添加抗褐變劑是較為方便有效的常規(guī)手段。,活性炭（AC） 水解乳蛋白（LH） 植酸（PA）,不一一列舉！,高產(chǎn)細(xì)胞系的建立,適宜工業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)胞系條件：一是分散性好，適于工業(yè)化操作；二是均一性好，細(xì)胞形狀大小大致相同甚至在生理生化狀態(tài)上同步；三是生長迅速；四是細(xì)胞中次生產(chǎn)物含量高；五是細(xì)胞生長和次生產(chǎn)物合成能力穩(wěn)定。,技術(shù)路線,高產(chǎn)細(xì)胞系篩選,

9、種質(zhì)的保存,超低溫冷凍保存：優(yōu)良細(xì)胞系能夠得以長期穩(wěn)定保存的重要保證。,培養(yǎng)基建立 培養(yǎng)基優(yōu)化,細(xì)胞代謝產(chǎn)生紫杉醇,OVER!,生物反應(yīng)器,生物反應(yīng)器技術(shù)是植物組織或器官培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物走向工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵技術(shù)。 生物反應(yīng)器首先在發(fā)酵工業(yè)中得到應(yīng)用。發(fā)酵工業(yè)中使用的生物反應(yīng)器，實際上是發(fā)酵罐。另一種是以固定化酶或固定化細(xì)胞為催化劑的酶反應(yīng)器。,生物反應(yīng)器培養(yǎng)毛狀根次生代謝產(chǎn)物,以劉春朝等人采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素為例介紹下生物反應(yīng)器的植物組織與器官培養(yǎng)技術(shù)以其應(yīng)用。,毛狀根培養(yǎng)物生長速度快、分支多、生理生化特征穩(wěn)定，具有較穩(wěn)定的次生代謝產(chǎn)物合成能力。 毛狀跟外形像毛發(fā)，交

10、織纏繞。,青蒿素是一種含過氧基團的倍半萜內(nèi)酯，對腦型瘧疾、抗氯喹性瘧疾具有很好的療效，具有高效、低毒的特點。目前，世界上青蒿素要去主要從天然青蒿中提取，青蒿產(chǎn)量低，成本高，難以滿足市場需要。人工合成難度大，成本高，也難以推廣。,霧化生物反應(yīng)器培養(yǎng),霧化設(shè)備與培養(yǎng)裝置一體化設(shè)計 霧化設(shè)備與培養(yǎng)裝置分開設(shè)計,在培養(yǎng)液上設(shè)置單層板，距離液面較近，以使霧化后的營養(yǎng)霧能快速地與培養(yǎng)物接觸。此類反應(yīng)器的起霧高度低，難以進行多次培養(yǎng)，反應(yīng)器的空間利用率低，目前僅適合于實驗室進行植物組織的生理生化特性研究。,利用氣體將營養(yǎng)霧從霧化裝置帶入培養(yǎng)裝置，該類型結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，而且存在營養(yǎng)霧損失問題。取青蒿毛狀根的根尖2

11、030mm于MS固體培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，篩選出生長旺盛、分支多且細(xì)長的毛狀根進行液體震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25度、12h/12h的光暗周期照射，轉(zhuǎn)速120130r/min。10天后，將其接種于反應(yīng)器中的篩網(wǎng)上進行霧化培養(yǎng)。經(jīng)20天分批培養(yǎng)，可以獲得生物量10.3g/L，青蒿素產(chǎn)量達179.1mg/L，在毛狀根中含量為1.74%，高于搖瓶培養(yǎng)分批30天所得的含量。,流化床生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿,青蒿毛狀根的前培養(yǎng)與霧化生物反應(yīng)器相同。接種毛狀根于篩網(wǎng)之間，由于篩網(wǎng)的隔離作用，毛狀根有的附著在篩網(wǎng)上，有的在層間隨氣流混合而運動。由于混合和供氧充分，毛狀根的延伸生長及分支產(chǎn)生較快，生長方向沿著氣液流動方向

12、，而且生長過程中各層的生長速度較一致。培養(yǎng)20天，毛狀根長滿整個反應(yīng)器。生物量達21.3g/L，青蒿素濃度為349.8mg/L，占毛狀根的1.6%。,生物反應(yīng)器大規(guī)模繁殖脫毒植物,培養(yǎng)脫毒植物的傳統(tǒng)方法操作繁瑣，勞動力消耗大，培養(yǎng)條件不易控制等不足，而生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)的建立將為脫毒繁殖的放大和最終走向產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。,赫震龍等人利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)脫毒馬鈴薯,材料與培養(yǎng)基 將馬鈴薯脫毒苗切成小段后在固體的苗繁殖培養(yǎng)基（添加30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基、Ph5.8)上繼代培養(yǎng)34周。微型馬鈴薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加了10mg/L的BA和80mg/L的蔗糖的MS培養(yǎng)基。用于繼代培養(yǎng)和對照培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基另外附加6g/L的瓊脂。培養(yǎng)基調(diào)節(jié)Ph5.8后高壓蒸汽滅菌。,霧化生物反應(yīng)器培養(yǎng) 切成單節(jié)間莖段作為外植體，均勻接種于霧化培養(yǎng)器中。培養(yǎng)基為液體的苗繁殖培養(yǎng)基，25度、5min/2h、2000lx以12h/天光照、通氣量200ml/min條件下培養(yǎng)10天。然后更換培養(yǎng)液為微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10mg/L的BA和80g/L蔗糖的MS培養(yǎng)