細(xì)胞生物技術(shù)論文-免疫熒光技術(shù)的原理及應(yīng)用.doc

免疫熒光技術(shù)的原理及應(yīng)用 摘要：免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。本文綜述了免疫熒光技術(shù)的主要實(shí)驗(yàn)原理及應(yīng)用。關(guān)鍵詞：免疫熒光技術(shù)；熒光色素；原理；應(yīng)用 以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)（fluorescentantibodytechnique）。Coons等于1941年首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法，用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)【1】。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有專供TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)【2】。由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。近年來發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。1原理免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原抗體抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同【3】。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于雞任何抗原的診斷。2技術(shù)分類：2.1 熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù))抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查【4】。2.2免疫熒光測定技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法。染色程序分為兩步，第一步，用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體【4】。 3 常用熒光色素選擇3.1常用的熒光色素 許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料【3】。常用的熒光色素有：(1)異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。(2)四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595600nm，呈橘紅色熒光。(3)四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。（2）其他熒光物質(zhì)1）酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。2）鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3 ）、鋱（Tb3 ）、鈰（Ce3 ）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用最廣。Eu3 螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時(shí)間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。3.2合適熒光素的選擇 1）具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。2）熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。3）熒光色澤與背景色澤對比鮮明。4）標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性5）標(biāo)記方法簡單、快速。6）安全無毒4免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用 由于免疫熒光技術(shù)具有將免疫學(xué)的特異性和敏感性與顯微形態(tài)學(xué)的精確性相結(jié)合的特點(diǎn),它已在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、生物學(xué)研究的各個(gè)方面廣泛應(yīng)用【5】。4.1在免疫組織化學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用4.1.1 激素和酶的定位免疫熒光組織化學(xué)方法建立以后,對各種激素和酶的定位研究迅速發(fā)展。如促腎上腺皮質(zhì)激素、黃體生成素、生長激素、催乳素、胰島素、酸與堿性核糖核酸酶、過氧化氫酶、三磷酸目油醛脫氫酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等。4.1.2 組織和細(xì)胞內(nèi)抗原性物質(zhì)的示蹤具有杭原性的組織和細(xì)胞組分兒乎均可用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行定位示蹤。如腎組織抗原、肌動(dòng)蛋白和肌球蛋臼等。4.1.3 細(xì)胞膜杭原和膜受體的觀察用免疫熒光技術(shù)已證明動(dòng)物細(xì)胞的膜抗原和膜受體,特別是淋巴細(xì)胞的膜受體。如小白鼠組織相容性抗原、器官抗原、同種白細(xì)胞抗原、血型抗原等。4.1.4 在免疫細(xì)胞學(xué)上的應(yīng)用，免疫熒光方法已能觀察細(xì)胞的分化過程,探討細(xì)胞來源及機(jī)能。4.2在細(xì)菌學(xué)和病毒學(xué)研究中的應(yīng)用 在細(xì)菌學(xué)中主要用于菌種的鑒定及抗原定位研究,在病毒學(xué)中主要用于病毒抗原的定位及病毒在細(xì)胞內(nèi)的繁殖、擴(kuò)散以及病毒感染的快速診斷。4.3在自身免疫病及病理學(xué)研究中的應(yīng)用 作為一種研究手段和診斷方法,熒光杭體技術(shù)對探討某些疾病的發(fā)病機(jī)制及實(shí)驗(yàn)診斷十分重要,如動(dòng)脈粥樣硬