現(xiàn)代生化藥學(xué)課后題答案

第一章 PCR1 PCR的英文全稱是什么? Polymerase Chain Reaction2 PCR是誰(shuí)發(fā)明的？Kary Mullis3 PCR的基本原理是什么？PCR的基本工作原理是以擬擴(kuò)增的DNA片段為模板，以一對(duì)分別與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸為引物，在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板DNA鏈延伸，直至新的DNA合成。不斷重復(fù)這一過程，則可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。4 PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中一般會(huì)生成幾種長(zhǎng)度不同的產(chǎn)物？反應(yīng)結(jié)束時(shí)他們的含量分別是怎樣的？PCR反應(yīng)中一般會(huì)產(chǎn)生2種不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物：一種是預(yù)期長(zhǎng)度的產(chǎn)物，一種是比預(yù)期長(zhǎng)度長(zhǎng)得多的產(chǎn)物；前者以指數(shù)級(jí)數(shù)增加（2n），后者以幾何級(jí)數(shù)增加（2n）。因此后者在總產(chǎn)物中所占比重很小，可忽略不計(jì)。5 一般PCR反應(yīng)中包括幾種基本成份？它們的功能分別是什么？7種基本成分:模板,特異性引物,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,脫氧核苷三磷酸(dNTP),二價(jià)陽(yáng)離子,緩沖液及一價(jià)陽(yáng)離子,石蠟油(可忽略)模板：待擴(kuò)增的DNA或RNA,甚至細(xì)胞；引物：與靶DNA的3端和5端特異性結(jié)合的寡核苷酸片段，是決定PCR特異性的關(guān)鍵。只有每條引物都與靶DNA特異性結(jié)合，才能保證其特異性，引物越長(zhǎng)，特異性越高。兩段引物間的距離決定了擴(kuò)增片斷的長(zhǎng)度；兩引物的5端決定了擴(kuò)增產(chǎn)物的5端位置。說明引物決定了擴(kuò)增片斷的長(zhǎng)度、位置和結(jié)果。DNA聚合酶：a.聚合作用，將dNTP中脫氧單核苷酸逐個(gè)加到3-OH末端,b.3-5外切酶活性，校正功能,c.5-3外切酶活性，切除錯(cuò)配核苷酸；石蠟油：維持恒熱和整個(gè)體系中鹽濃度，減少PCR過程中尤其是變性時(shí)液體蒸發(fā)所造成的產(chǎn)物的丟失。6 PCR反應(yīng)對(duì)模板有什么要求（種類及質(zhì)量要求等）？基因組DNA、噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA、cDNA、mRNA、預(yù)先擴(kuò)增的DNA均可作為模板。PCR反應(yīng)對(duì)模板純度要求不是很高，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法制備的樣品即可以作為模板；但是模板中絕對(duì)不能含有蛋白酶、核酸酶、Taq酶抑制劑和任何可以結(jié)合DNA的蛋白；雖然片段長(zhǎng)短不是影響PCR效率的關(guān)鍵因素，短片段模板PCR效率更高；為保證反應(yīng)的特異性，應(yīng)使用ng級(jí)的克隆DNA、g級(jí)的單拷貝染色體DNA、或104拷貝的待擴(kuò)增片段。7 什么叫PCR的引物？什么叫特異性引物？什么叫簡(jiǎn)并性引物？引物：所謂引物，實(shí)際上就是兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，兩引物的5端決定擴(kuò)增產(chǎn)物的5末端位置。(引物要大大過量)特異性引物：引物是與靶DNA的3端和5端特異性結(jié)合的寡核苷酸片段，是決定PCR特異性的關(guān)鍵。只有當(dāng)每條引物都能特異性地與模板DNA中的靶序列復(fù)性形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，才能保證其特異性。簡(jiǎn)并性引物：簡(jiǎn)并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性,可以參考密碼子使用表,根據(jù)不同生物的堿基使用偏好,減少簡(jiǎn)并性。8 引物設(shè)計(jì)的基本原則有哪些？a. 引物長(zhǎng)度一般在2024bp(16,30)：這樣長(zhǎng)度的引物保證了不易形成雜合體；b. （G+C）%含量：兩段引物的此數(shù)值應(yīng)相近；在已知模板序列時(shí)應(yīng)與模板的相近。40%-60%c. 引物本身不能形成明顯的次級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡結(jié)構(gòu)；d. 兩引物間不可發(fā)生互補(bǔ)(特別是3端，若不可避免那3端互補(bǔ)堿基不可超過2個(gè)堿基)；e. 引物3端配對(duì)：引物3端為DNA聚合酶連上寡核苷酸的地方，因此該端5-6個(gè)堿基與DNA的配對(duì)必須嚴(yán)格、準(zhǔn)確。9 PCR中使用的DNA聚合酶有哪幾種，各具有哪些特點(diǎn)？a. Klenow片段：為DNA聚合酶的片段，有聚合酶活性和35外切酶活性(最適37)；b. Taq酶：耐熱DNA聚合酶，可耐受9395攝氏度(最適74-75)，是PCR普及的關(guān)鍵。它避免了不斷補(bǔ)加DNA聚合酶的繁瑣操作，提高了退火和延伸的溫度，減少了非特異性產(chǎn)物和DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR的干擾，提高了PCR的特異性、敏感度和產(chǎn)量。它沒有35外切酶活性，無(wú)校對(duì)功能，點(diǎn)突變較多。依賴Mg2+。c. Stoffel片段：第二代耐熱DNA聚合酶，去除Taq酶的53外切酶活性，將97.5攝氏度的半衰期提高到20min，而Taq酶只有5min；對(duì)復(fù)合PCR（2個(gè)或以上模板位點(diǎn)的PCR）更有效；d. VentTMDNA多聚酶：耐受100攝氏度以上高溫達(dá)2h；具有校對(duì)功能(35外切酶活性)。e. RTth 逆轉(zhuǎn)錄酶：有依賴于RNA的耐熱DNA聚合酶活性和依賴于DNA的耐熱DNA聚合酶活性，這兩種活性分別依賴于Mn2+和Mg2+。10 PCR反應(yīng)中對(duì)于加入的dNTP有什么要求？1）dNTP應(yīng)具有一定濃度：50-200mol/L, 不得低于10-15。濃度過高會(huì)抑制Taq酶活性，較低濃度可降低錯(cuò)誤摻入；高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，而濃度過低會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量過低；2）標(biāo)準(zhǔn)PCR中包含四種等摩爾濃度的脫氧核苷三磷酸，否則會(huì)誘導(dǎo)聚合酶錯(cuò)誤摻入而降低產(chǎn)率、提前終止反應(yīng)；3)不能反復(fù)凍融，否則會(huì)降解。11 PCR反應(yīng)中加入的二價(jià)陽(yáng)離子有什么功能？常用的是什么離子？緩沖液中二價(jià)陽(yáng)離子的存在至關(guān)重要，因?yàn)槟蜔酓NA聚合酶需要游離的二價(jià)陽(yáng)離子作為輔助離子，它影響著PCR的產(chǎn)量和特異性。常用Mn2+和Mg2+, Ca2+無(wú)效。(引物與dNTP都有二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合)12 PCR反應(yīng)一般分為幾個(gè)步驟？各步驟有什么特點(diǎn)？A變性：雙鏈DNA變成單鏈DNA。變性溫度的高低由G+C含量決定；變性時(shí)間由DNA鏈長(zhǎng)度決定。常規(guī)PCR變性條件為9495度45s。B 退火，將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA退火結(jié)合；退火是使引物和模板DNA復(fù)性。復(fù)性過程采取的溫度（Ta）至關(guān)重要。復(fù)性溫度過高，引物不能與模板很好地復(fù)性，擴(kuò)增效率很低；復(fù)性溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，導(dǎo)致非特異性的DNA片段的擴(kuò)增。退火溫度通常在比理論計(jì)算的引物和模板的熔解溫度低35的條件下進(jìn)行。C 延伸：寡核苷酸引物的延長(zhǎng)，一般在耐熱DNA聚合酶的最適溫度下進(jìn)行。對(duì)于Taq酶，為7278度。D 循環(huán)數(shù)：PCR擴(kuò)增所需的循環(huán)數(shù)取決于反應(yīng)體系中起始的模板拷貝數(shù)以及引物延伸和擴(kuò)增的效率。一般擴(kuò)展條件：9460s3760s72120s，共25-30個(gè)循環(huán)13 什么叫PCR的反應(yīng)平臺(tái)？形成的原因可能是什么？PCR反應(yīng)不是無(wú)窮的進(jìn)行，到了PCR后期，當(dāng)產(chǎn)物達(dá)0.31pmol/L時(shí)，由于產(chǎn)物的堆積，使原來(lái)以指數(shù)增長(zhǎng)的速率變成平坦的曲線。形成原因：由于引物和dNTP的減少，Taq酶失活；或由于底物過剩、非特異性產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)、變性時(shí)解鏈不完全、退火時(shí)產(chǎn)物單鏈自己締合、最終產(chǎn)物的阻化作用。14 提高PCR反應(yīng)的特異性一般可以使用哪幾種方法？A 引物設(shè)計(jì)：引物長(zhǎng)度、堿基配對(duì)是否嚴(yán)格、GC%含量、退火溫度、引物濃度與純度、穩(wěn)定性、是否為簡(jiǎn)并性引物等；B 使用熱啟動(dòng)：在變性完成之后再加入DNA聚合酶(或聚合酶才有活性)，這樣可以提高特異性，因?yàn)镈NA聚合酶在低溫時(shí)也有活性，可能引起非特異的擴(kuò)增。C 鎂離子濃度：不同的模板和引物有不同的鎂離子濃度，應(yīng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索；較高的鎂離子濃度會(huì)提高產(chǎn)量，同時(shí)降低特異性；dNTP濃度較高時(shí)應(yīng)適當(dāng)提高鎂離子濃度。E 促進(jìn)PCR的添加劑：降低DNA熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)，可提高特異性和產(chǎn)率；F 使用巢式PCR：降低擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，提高特異性15 常用的促進(jìn)PCR特異性的試劑有哪些？甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿，PCRx Enhancer Solution。16 什么是熱啟動(dòng)？在模板DNA完全變性后再加入DNA聚合酶（或使DNA聚合酶有活性）的方法，可減少低溫下DNA聚合酶活性造成的非特異性擴(kuò)增。17 RACE的全稱是什么？Rapid Amplification of cDNA Ends（cDNA末端的快速擴(kuò)增）18 什么叫定量PCR？利用PCR反應(yīng)來(lái)測(cè)定樣品中的DNA或RNA的原始拷貝數(shù)量。利用每個(gè)循環(huán)都能同步偵測(cè)到PCR產(chǎn)物的增生，以獲得達(dá)到反應(yīng)飽和前的資料。(注：不能根據(jù)終產(chǎn)物量來(lái)確定起始拷貝數(shù))19 為什么PCR中對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)檢定量不準(zhǔn)確？(PCR擴(kuò)增曲線為S型曲線)隨著PCR的進(jìn)行，反應(yīng)體系中的引物、dNTP，甚至模板都會(huì)供不應(yīng)求，導(dǎo)致PCR的效率下降，產(chǎn)物增長(zhǎng)速度越來(lái)越慢。直到Taq酶都被飽和后，反應(yīng)就進(jìn)入平臺(tái)期。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互影響，每個(gè)反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間及平臺(tái)期的高低都不同，導(dǎo)致終產(chǎn)物濃度各不相同。即使是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，也不可能做到同時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。因此反應(yīng)終產(chǎn)物與原始拷貝數(shù)無(wú)線性關(guān)系，定量不準(zhǔn)確。20 什么是定量PCR的Ct值？Ct值是如何確定的?Cycle threshold（Ct）：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即在PCR中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)的拐點(diǎn)處所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。Ct值的含義是：PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。確定：PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省沒置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。實(shí)驗(yàn)操作中，Ct值定義為極限上方產(chǎn)生可檢測(cè)到的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的熒光發(fā)射所對(duì)應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)?！盎€上方”也就是閾值高度的量化，定義是基線范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。閾值所在的橫線與PCR擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)所指的PCR循環(huán)次數(shù)就是Ct值。Ct值越小，模板DNA的起始拷貝數(shù)越多；Ct值越大，反之。正常：1830。Ct值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于試驗(yàn)質(zhì)量。21 簡(jiǎn)述Taqman探針技術(shù)的原理。Taqman探針法是高度特異性的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的53外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)，由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對(duì)PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性的結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)，3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基因所發(fā)出的熒光能量被淬滅集團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其53外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。所以，每經(jīng)過一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過程。信號(hào)強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。根據(jù)其3，端標(biāo)記的熒光猝滅基團(tuán)的不同分為：普通的Taqman探針和TaqmanMGB探針22 解釋下列各種PCR的基本原理：(1) RT-PCR （Reverse Translation-PCR）(獲得基因完整編碼區(qū)序列)RT-PCR是一種從細(xì)胞mRNA中高效靈敏地?cái)U(kuò)增cDNA序列的方法。由兩大步驟組成，一是反轉(zhuǎn)錄(RT)；另一是PCR。反轉(zhuǎn)錄的起始材料為RNA(mRNA)。RNA的提?。河卯惲蚯杷犭?酚-氯仿提取細(xì)胞中的RNA；mRNA的提取：親和層析法(mRNA3端的polyA尾巴與固定相oligo(dT)特異性結(jié)合)；RT：在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，即以oligo（dT）、隨機(jī)六聚寡核苷酸或基因特異序列為引物，與mRNA結(jié)合之后，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下延伸合成cDNA第一鏈，再以其為模板PCR；PCR：設(shè)計(jì)基因特異的上下游引物，其中上游引物與cDNA第一鏈復(fù)性后延伸合成cDNA第二鏈，再以cDNA第一鏈和第二鏈為模板，用上下游引物進(jìn)行PCR。(2) 多重PCR (腫瘤檢測(cè))用于檢測(cè)多個(gè)基因的表達(dá)，且這些基因都與某一疾病的檢測(cè)、治療或預(yù)后有關(guān)。其原理與常規(guī)RT-PCR相似，分為反轉(zhuǎn)錄和PCR兩部分，不同點(diǎn)在于：在反轉(zhuǎn)錄過程，前者使用Oligo（dT）或隨機(jī)六聚寡核苷酸為引物，而不用基因特異性引物；在PCR過程，前者需要設(shè)計(jì)多對(duì)引物，以擴(kuò)增多個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物。(3) 3-RACE 3RACE用于mRNA已知序列下游(即3端)未知序列的擴(kuò)增，可分為兩步。 （1）以與polyA尾巴互補(bǔ)的序列為引物， 反轉(zhuǎn)錄獲得3末端第一鏈cDNA序列（2）以靠近第一鏈cDNA3端的序列為特異引物合成cDNA第二鏈，再PCR擴(kuò)增A反轉(zhuǎn)錄獲得3末端第一鏈cDNA：3末端本身具有PolyA，可以與引物結(jié)合。引物也同樣具有oligo(dT)，但這種引物在5端有OP（Outer Primer）和IP（Inner Primer）的特殊結(jié)構(gòu)，便于為以后的兩輪PCR提供引物；在3端加入一個(gè)錨定核苷酸，可以使反轉(zhuǎn)錄在緊接著PolyA的交界處進(jìn)行，這樣可以有效減少同聚物的產(chǎn)生。B第一鏈cDNA3端的擴(kuò)增：設(shè)計(jì)兩種引物GSOP和GSIP。由于cDNA已含有外源性O(shè)P和IP序列，故可以用來(lái)自目的基因的GSOP和來(lái)自錨定序列的外源性O(shè)P進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，用GSIP和IP進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，以此增強(qiáng)特異性。(4) 簡(jiǎn)并PCR 一般PCR根據(jù)確定的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，簡(jiǎn)并PCR一般用于已知氨基酸序列而不知道核苷酸序列的情況。根據(jù)氨基酸密碼子的簡(jiǎn)并性，設(shè)計(jì)兩組帶有一定簡(jiǎn)并性的引物庫(kù)，以擴(kuò)增出未知核苷酸序列的基因。這些引物有很多相同堿基，但也有堿基不同，這樣保證了和多種同源序列發(fā)生退火。(5) 不對(duì)稱PCR不對(duì)稱PCR的基本原理是采用不等量的一對(duì)引物產(chǎn)生大量的單鏈DNA。 分為引物濃度不對(duì)稱PCR和熱不對(duì)稱PCR。結(jié)果是產(chǎn)生大量的單鏈DNA，又避免了在檢測(cè)時(shí)要先出去剩余引物的操作。引物濃度不對(duì)稱PCR：兩引物的濃度不同，其中濃度低的為限制性引物，起決定性作用，只有當(dāng)限制性引物耗盡后才會(huì)開始大量產(chǎn)生ssDNA；濃度高的為非限制性引物。前10-15循環(huán)為雙鏈產(chǎn)物，而后為單鏈。常規(guī)熱不對(duì)稱PCR（常規(guī)引物長(zhǎng)度不對(duì)稱PCR）：一對(duì)引物的堿基數(shù)目與組成不同造成退火溫度不同。將限制性引物比非限制性引物的退火溫度低至少10度。在剛開始的1015個(gè)循環(huán)中，退火溫度略低于限制性引物的退火溫度，產(chǎn)生雙鏈DNA，以耗盡限制性引物；之后的退火溫度便以非限制性引物的退火溫度為準(zhǔn)，大量產(chǎn)生單鏈DNA。交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR(TAIL-PCR)：利用一系列序列特異性的巢式引物和一個(gè)短的任意引物引導(dǎo)擴(kuò)增，一種半特異性的PCR(6) 競(jìng)爭(zhēng)性PCR (C-PCR) (mRNA最精確的定量方法之一，定量PCR的改進(jìn))首先將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后在擴(kuò)增體系中加入濃度已知的競(jìng)爭(zhēng)性參考模板，這兩種模板都可以與引物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，但產(chǎn)物可因大小不同或酶切位點(diǎn)不同而區(qū)分開。之后在凝膠電泳上測(cè)定兩種產(chǎn)物的濃度后即可推斷mRNA的初始濃度。(7)巢式PCR 由兩輪PCR和兩套引物組成。首先對(duì)靶DNA進(jìn)行第一步擴(kuò)增，然后從第一次反應(yīng)產(chǎn)物中取出少量作為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增，第二次PCR引物與第一步反應(yīng)產(chǎn)物序列互補(bǔ)，第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即為目的產(chǎn)物。提高特異性和靈敏性。外側(cè)引物25bp，退火溫度高(68)；內(nèi)側(cè)引物17bp，退火溫度低(46)(8) 降落PCR(touch-down PCR)降落PCR是Don于1991年最早發(fā)明的，退火溫度起始于高于Tm值計(jì)算15度，之后每過一個(gè)循環(huán)溫度降低1(或n)，直到達(dá)到一個(gè)較低的退火溫度(Tm值以下5)，這個(gè)溫度為“touchdown”退火溫度。由于正確和非正確的退火溫度造成的產(chǎn)量是指數(shù)級(jí)的，因此可以使正確產(chǎn)物得到累計(jì)。當(dāng)溫度降低到非特異性退火溫度時(shí)，就會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合，但此時(shí)的特異性結(jié)合產(chǎn)物已經(jīng)累計(jì)了一個(gè)幾何級(jí)數(shù)的優(yōu)勢(shì)，因此非特異性結(jié)合產(chǎn)物的量不會(huì)很多。第2章 放射性同位素知識(shí)和應(yīng)用1 什么叫“核衰變”？放射性同位素的原子核很不穩(wěn)定，會(huì)持續(xù)不斷、自發(fā)放地出射線，直到變成另一種穩(wěn)定同位素。衰變時(shí)可放出射線、射線、射線、電子俘獲，但不一定幾種同時(shí)都會(huì)放出。2 什么叫半衰期？特點(diǎn)是什么？半衰期：一定數(shù)量的放射性同位素原子數(shù)目減少到原來(lái)一半時(shí)所需要的時(shí)間。半衰期越長(zhǎng)，說明衰變的越慢；反之越快。半衰期是放射性同位素的特征參數(shù)，不同的放射性同位素有不同的半衰期。3 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的幾種放射性同位素有哪幾種？他們的半衰期分別是多少？氫-3 ：12.3年( E最小) 碳-14 ：5720年 磷32：14.3天( E最大) 硫35：87.1天 碘131 ：8.05天 4 什么叫放射源？用放射性物質(zhì)制成的，能產(chǎn)生輻射照射的物體。5 什么叫同位素示蹤法？有什么優(yōu)點(diǎn)？利用放射性核素作為示蹤劑對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行標(biāo)記的微量分析方法。靈敏度高(1014-1018克水平)、方法簡(jiǎn)便、定量定位準(zhǔn)確、符合生理?xiàng)l件。6 同位素示蹤法中使用的同位素是哪種同位素?在不同的實(shí)驗(yàn)中、不同的實(shí)驗(yàn)要求下選用的同位素不同。一般情形是根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)短，來(lái)選擇具有合適的衰變方式，輻射類型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。7 什么叫同位素效應(yīng)？指放射性同位素（或是穩(wěn)定性同位素）與相應(yīng)的普通元素之間存在著化學(xué)性質(zhì)上的微小差異所引起的個(gè)別性質(zhì)上的明顯區(qū)別，對(duì)于輕元素而言，同位素效應(yīng)比較嚴(yán)重。8 舉例說明同位素示蹤法在分子生物學(xué)核生物化學(xué)中的應(yīng)用。物質(zhì)代謝的研究、物質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究、動(dòng)態(tài)平衡的研究、生物樣品中微量物質(zhì)的分析、最近鄰序列分析法物質(zhì)代謝的研究：體內(nèi)存在著很多種物質(zhì)，究竟它們之間是如何轉(zhuǎn)變的，如果在研究中應(yīng)用適當(dāng)?shù)耐凰貥?biāo)記物作示蹤劑分析這些物質(zhì)中同位素含量的變化，就可以知道它們之間相互轉(zhuǎn)變的關(guān)系，還能分辯出誰(shuí)是前身物，誰(shuí)是產(chǎn)物 ，分析同位素示蹤劑存在于物質(zhì)分子的哪些原子上，可以進(jìn)一步推斷各種物質(zhì)之間的轉(zhuǎn)變機(jī)制。9 放射性測(cè)量的原理是什么？探測(cè)儀可以分為哪2類？放射性同位素發(fā)出的射線與物質(zhì)相互作用，會(huì)直接或間接產(chǎn)生電力和激發(fā)等效應(yīng)，以此探測(cè)放射性的存在、強(qiáng)度和放射性同位素的性質(zhì)。分為徑跡型和信號(hào)型。10 閃爍計(jì)數(shù)器的工作原理是什么？閃爍型探測(cè)器由閃爍體-光電倍增管-放大器-分析器-定標(biāo)器組成。閃爍體吸收射線后發(fā)出光信號(hào)，被光電倍增管收到而發(fā)生光電效應(yīng)，轉(zhuǎn)化成電信號(hào)并逐級(jí)放大，最后被定標(biāo)器記錄下來(lái)。放射性同位素越多，發(fā)出的光信號(hào)越多，電信號(hào)也越多。11 什么叫閃爍體？一類能吸收能量，并在1微秒內(nèi)甚至更短將能量以光的形式發(fā)射出來(lái)的物質(zhì)。12 液體閃爍計(jì)數(shù)器和晶體閃爍計(jì)數(shù)器分別適合檢測(cè)什么樣的放射性線？液體閃爍計(jì)數(shù)器適合檢測(cè)-ray和低能-ray；晶體閃爍計(jì)數(shù)器適合-ray。13 人體各種器官中，對(duì)輻射最為敏感的是什么器官?造血器官、胃腸道（小腸最敏感，胃和結(jié)腸次之）14 什么叫細(xì)胞的間期死亡？增殖死亡？細(xì)胞的間期死亡：細(xì)胞受輻射照射后，不經(jīng)分裂，在幾小時(shí)內(nèi)死亡。（兩類細(xì)胞發(fā)生間期死亡一類是不分裂或分裂能力有限的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞和胸腺細(xì)胞；另一類是不分裂或可逆性分裂的細(xì)胞，如成熟神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞等。）增殖死亡：細(xì)胞受輻射照射后，經(jīng)1個(gè)或幾個(gè)分裂周期后，因失去增值能力而死亡。主要是由于DNA分子損傷后錯(cuò)誤修復(fù)和染色體畸變等原因造成有絲分裂障礙。15 什么叫外照射？?jī)?nèi)照射？輻射的確定性效應(yīng)？隨機(jī)效應(yīng)？外照射：輻射源由體外照射人體。生物效應(yīng)強(qiáng)。如-ray、中子、X-ray。內(nèi)照射：放射性物質(zhì)通過某種途徑進(jìn)入人體，以其輻射能產(chǎn)生生物效應(yīng)者為內(nèi)照射。如ray。輻射的確定性效應(yīng)：輻射的嚴(yán)重程度與照射劑量的大小有關(guān)，效應(yīng)的嚴(yán)重程度取決于細(xì)胞群中受損細(xì)胞的數(shù)量或百分率。如白細(xì)胞減少、皮膚紅斑脫毛、白內(nèi)障。隨機(jī)效應(yīng)：效應(yīng)的發(fā)生率與照射劑量的大小有關(guān)，這種效應(yīng)在個(gè)別細(xì)胞損傷時(shí)即可出現(xiàn)，無(wú)閾劑量。如誘發(fā)癌癥和遺傳效應(yīng)。16 放射防護(hù)的3原則是什么？放射實(shí)踐正當(dāng)化；放射防護(hù)最優(yōu)化；個(gè)人劑量限制。17 外照射防護(hù)的基本措施是什么？時(shí)間防護(hù)、距離防護(hù)、屏障防護(hù)。18 放射性的“三廢”是指哪三廢？放射性廢氣、廢液、固廢。19 外照射的，和伽馬射線應(yīng)該分別如何防護(hù)？粒子穿透能力弱，不會(huì)引起外照射損傷，紙可阻擋；輻射常采用低原子序列的鋁或有機(jī)玻璃；X、射線常采用高原子序列的鉛、鐵或經(jīng)濟(jì)適用的混凝土等材料；20 醫(yī)院中使用的X光機(jī)中有沒有輻射源？為什么？沒有。高速電子轟擊靶物質(zhì)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生X射線。X光機(jī)的核心部分是X線管，通常由安裝在真空玻璃殼內(nèi)的陰極和陽(yáng)極組成。陰極為鎢絲，陽(yáng)極則根據(jù)不同需要由不同材料制成多種形狀。也就是說，X光機(jī)里沒有“密封源”第3章 分子雜交技術(shù)1 核酸分子雜交的分子基礎(chǔ)是什么？核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對(duì)之間非共價(jià)鍵（主要是氫鍵）的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，這就是核酸分子雜交的基礎(chǔ)。不要求兩條單鏈堿基順序完全互補(bǔ)。RNA-RNA, DNA-DNA,DNA-RNA2 舉例說明哪些生物反應(yīng)是屬于探針靶反應(yīng)？a抗原-抗體b.外源凝集素-碳水化合物c.親和素-生物素d.受體-配基e.互補(bǔ)核酸間的雜交3 核酸探針的種類有哪些？各有什么特點(diǎn)？A基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類。B根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針及寡核苷酸探針等幾類。C DNA探針還有單鏈和雙鏈之分各自特點(diǎn)：DNA探針：最常用的核酸探針；主要特點(diǎn)有：這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡，制備方法簡(jiǎn)便DNA探針不易降解。一般可有效抑制DNA酶活性DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇。(多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列，須是特異的)cDNA探針：互補(bǔ)于mRNA的DNA分子(一般都為編碼序列)。cDNA是由RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生的不含有內(nèi)含子序列，尤其適合于基本表達(dá)的檢測(cè)。RNA探針：主要用于研究目的，而不是用于檢測(cè)。高雜交效率，但也易降解、標(biāo)記方法復(fù)雜（標(biāo)記效率低）。寡核酸探針：鏈短、序列復(fù)雜度低、分子量小，所以和等量靶位點(diǎn)完全雜交的時(shí)間比克隆探針短。寡核苷酸探針可識(shí)別靶序列內(nèi)1個(gè)堿基對(duì)變化一次可大量合成寡核苷酸探針，價(jià)格低廉，可用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記4 探針標(biāo)記技術(shù)可以分為哪兩類？非放射性標(biāo)記技術(shù)(金屬Hg,熒光物質(zhì)FITC,半抗原如地高辛,生物素,酶如辣根過氧化物酶)和放射性同位素標(biāo)記技術(shù)(32P 14.3天,35S 87.1天,125I 60天,3H 12.3年，其中32P最常用)5 核酸探針常用的酶促標(biāo)記技術(shù)有哪幾種？缺口平移、DNA快速末端標(biāo)記、用T4多核苷酸激酶(PNK)標(biāo)記DNA5末端、隨機(jī)引物延伸(DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR，用于大規(guī)模檢測(cè)和非放射性標(biāo)記)6 缺口平移標(biāo)記技術(shù)的原理是什么？利用了什么酶的哪些？原理：首先用DNA酶在雙鏈DNA探針分子的一條鏈上制造一些缺口，缺口處會(huì)形成3-羥基末端，這時(shí)再在大腸桿菌DNA聚合酶的催化下將核苷酸殘基加在3-OH上，同時(shí)根據(jù)該酶的53核酸外切酶活性，此酶將缺口5側(cè)核苷酸依次切除。其結(jié)果是在缺口平移。若用高強(qiáng)度的放射性核苷酸（-32 PdATP）,即得到被標(biāo)記的DNA探針。酶：DNA聚合酶的核酸外切酶活性，核酸外切酶水解核苷酸的活性7 DNA快速末端標(biāo)記中使用的酶是什么酶？使用的常用同位素是什么？DNA快速末端標(biāo)記中使用的酶：a.Klenow片段(用于5延伸端，大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶切割得到，有5-3聚合酶活性；3-5外切酶活性)；b.T4DNA聚合酶(用于3延伸端)DNA快速末端標(biāo)記中使用的同位素：-32 PdNTP8 標(biāo)記DNA 5末端時(shí)使用的酶是什么酶？使用的常用同位素是什么？與DNA快速末端標(biāo)記中使用的有什么不同？標(biāo)記DNA 5末端時(shí)使用的酶：T4多核苷酸激酶（PNK）使用的同位素是-32 PdNTP(來(lái)源于ATP)DNA快速末端標(biāo)記中使用的同位素是-32 PdNTP9 核酸的非放射性標(biāo)記技術(shù)可以分哪幾類？?jī)纱箢悾好复俜磻?yīng)標(biāo)記法(缺口平移,隨機(jī)引物,末端加尾.敏感度高,產(chǎn)量低,成本高)化學(xué)修飾標(biāo)記法(將標(biāo)記物用化學(xué)反應(yīng)連于DNA分子,成本低,用于大量制備)10 常用的非放射性標(biāo)記系統(tǒng)中，有哪幾種常用的非放射性物質(zhì)可用來(lái)標(biāo)記核酸分子？a生物素標(biāo)記核酸探針法 b異羥基洋地黃甙 c光敏生物素d辣根過氧化物酶e三硝基苯磺酸(TNBS)核酸分子雜交分：固相雜交(southern,northern,菌落原位雜交,斑點(diǎn)雜交)；液相雜交固相雜交過程：DNA變性-變性DNA在支持物上固定-封閉(預(yù)雜交)-雜交-洗膜-結(jié)果顯示11 Souther雜交的過程一般分為哪幾步驟？(常用醋酸纖維素膜和尼龍膜)DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段DNA堿變性,Tris緩沖液中和高鹽下通過毛吸作用將DNA轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素濾膜上,烘干固定(在凝膠中的相對(duì)位置在轉(zhuǎn)移到膜的過程中仍保持著)附于膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶動(dòng)位置12 預(yù)雜交的作用是什么？A、防止非特異性雜交，B、封閉試劑13 核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化一般可以從哪幾個(gè)方面考慮？1探針的選擇2探針的標(biāo)記方法3探針的濃度4雜交率5雜交最適溫度（高溫6058特異性高；低溫5055特異性低）6雜交的嚴(yán)格性7雜交的反應(yīng)時(shí)間8雜交促進(jìn)劑第4章 cDNA文庫(kù)1 什么叫基因組文庫(kù)？cDNA文庫(kù)？有什么區(qū)別？基因組文庫(kù)(genomic DNA library)：指將基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機(jī)的同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA所有的序列。cDNA文庫(kù)（cDNA library)：指只包括在特定組織或細(xì)胞類型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的所有的基因序列。區(qū)別： 重組DNA片段來(lái)源不同基因組文庫(kù)：來(lái)源于某特定生物個(gè)體的基因組DNADNA文庫(kù)：來(lái)源于細(xì)胞中表達(dá)出的RNA使用范圍不同基因組文庫(kù)：開展人類基因組計(jì)劃研究，構(gòu)建物理圖譜等DNA文庫(kù)：研究某特定細(xì)胞中基因組表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定2 構(gòu)建一個(gè)理想的cDNA文庫(kù)需要考慮的因素有哪些？acDNA文庫(kù)的質(zhì)量（1）文庫(kù)的代表性：是指文庫(kù)中包含的重組cDNA分子是否能完整地反映出來(lái)源細(xì)胞中表達(dá)的全部信息（即mRNA種類），是體現(xiàn)文庫(kù)質(zhì)量的最重要指標(biāo)。（2）重組cDNA片段的序列完整性：5端非翻譯區(qū)，中間的編碼序列和3端非翻譯區(qū)文庫(kù)中重組cDNA片段盡可能完整的反應(yīng)出天然基因的結(jié)構(gòu)cDNA是否完整，對(duì)文庫(kù)使用價(jià)值的影響并不是絕對(duì)的完整性這一指標(biāo)要根據(jù)研究目的及篩選方法來(lái)靈活考慮使細(xì)胞中表達(dá)出的mRNA在構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中盡可能含有相應(yīng)其各部分序列的重疊cDNA片段是其中一種折中的做法。b文庫(kù)篩選可選擇的具體方法 決定文庫(kù)篩選方法的主要因素是a.構(gòu)建文庫(kù)的克隆載體系統(tǒng)；b.相應(yīng)的宿主細(xì)胞系統(tǒng)。最理想的情況是對(duì)于具體構(gòu)建出的一個(gè)cDNA文庫(kù)，應(yīng)能夠使用多種篩選方法，有效地分離鑒定出目的基因，從而使研究者能夠在已有研究條件上，在文庫(kù)篩選的具體方法上有靈活的選擇余地。3 如何考察確定一個(gè)cDNA文庫(kù)的質(zhì)量？（1）文庫(kù)的代表性：是指文庫(kù)中包含的重組cDNA分子是否能完整地反映出來(lái)源細(xì)胞中表達(dá)的全部信息（即mRNA種類），是體現(xiàn)文庫(kù)質(zhì)量的最重要指標(biāo)。文庫(kù)的代表性好壞可用一個(gè)量化的指標(biāo)來(lái)衡量，即文庫(kù)的庫(kù)容量，它是指構(gòu)建出的原始cDNA文庫(kù)中所包含的獨(dú)立的重組子克隆數(shù)。（2）重組cDNA片段的序列完整性：在細(xì)胞中表達(dá)出的各種mRNA盡管具體的序列不同，但基本上由三個(gè)部分組成，即5端非翻譯區(qū)，中間的編碼序列和3端非翻譯區(qū)4 什么叫文庫(kù)的代表性？是指文庫(kù)中包含的重組cDNA分子是否能完整地反映出來(lái)源細(xì)胞中表達(dá)的全部信息（即mRNA種類），是體現(xiàn)文庫(kù)質(zhì)量的最重要指標(biāo)5 什么叫文庫(kù)的庫(kù)容量？有什么意義？文庫(kù)的庫(kù)容量：它是指構(gòu)建出的原始cDNA文庫(kù)中所包含的獨(dú)立的重組子克隆數(shù)。意義：它是衡量文庫(kù)代表性好壞的量化指標(biāo)。 (至少106以上的庫(kù)容量)6 常用來(lái)構(gòu)建文庫(kù)使用的載體系統(tǒng)有哪些？各有什么特點(diǎn)？1）噬菌體載體系統(tǒng)：構(gòu)建的庫(kù)容量最大（適于全長(zhǎng)cDNA的克?。D(zhuǎn)染效率最高，有較好的質(zhì)量控制指標(biāo)（通過對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表現(xiàn)鑒定，如藍(lán)白斑分析），適合于cDNA文庫(kù)的長(zhǎng)期保持。缺點(diǎn)：采用的文庫(kù)篩選方法有限，文庫(kù)中許多的cDNA片段在宿主細(xì)胞中常常無(wú)法獲得功能性表達(dá)2）質(zhì)粒載體系統(tǒng)：體外操作方便，在載體本身的設(shè)計(jì)上有很大的可塑性，可對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行功能性篩選缺點(diǎn)，插入片段的載體容量小，因此文庫(kù)中含有全長(zhǎng)cDNA的克隆比例少；文庫(kù)的庫(kù)容量較小，質(zhì)粒文庫(kù)需要以活的轉(zhuǎn)化菌形式保存和擴(kuò)增，保存條件嚴(yán)格，不適于長(zhǎng)期保存。3）噬菌粒載體系統(tǒng)：功能性篩選，缺點(diǎn)同“質(zhì)粒載體”，cDNA文庫(kù)功能篩選的重要方法4）哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體：侵染的細(xì)胞增廣；對(duì)細(xì)胞侵染率高；轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞的重組病毒基因能高頻地整合到宿主細(xì)胞基因組中。7 構(gòu)建cDNA文庫(kù)的基本步驟有哪些？制備mRNA樣品、合成cDNA的第一鏈、雙鏈cDNA的轉(zhuǎn)換合成、cDNA克隆mRNA純度對(duì)文庫(kù)質(zhì)量有影響，借助3末端polyA尾與oligodT互補(bǔ)而分離出mRNA。合成cDNA兩種方法：a.oligodT引導(dǎo)；b.隨機(jī)引物引導(dǎo)。8 對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選的策略