《高通量藥物篩選》PPT課件.ppt

高通量藥物篩選,余嬋娟 10122565,高通量藥物篩選,高通量藥物篩選（high throughput screening，HTS），是指用現(xiàn)代科技手段，對可能作為藥用的物質(zhì)進行大規(guī)模的生物活性檢測，從而尋找出具有藥用價值的物質(zhì)，為新藥的開發(fā)研究奠定基礎。,高通量藥物篩選的形成,高通量藥物篩選是20世紀80年代后期發(fā)展起來的高新技術。它主要由生物高通量和藥物篩選結合而成。所謂的高通量就是以新的藥物作為靶點，對藥物的作用進行研究；而藥物篩選可以簡略的解釋為重復性實驗操作。 高通量藥物篩選的出現(xiàn)，使藥物篩選逐步實現(xiàn)規(guī)?；?、自動化和集成化，具有篩選速度快，所需樣品用量少的特點。,傳統(tǒng)藥物篩選,高通量藥物篩選,藥物作用分子靶點 藥物篩選 活性化合物 作用機制研究 組織、器官水平研究 藥效學研究 疾病相關動物模型研究,人類疾病相關動物模型 藥物篩選發(fā)現(xiàn)有效藥物 活性化合物 藥效學研究 組織器官水平研究 作用機制研究 分子細胞水平研究 ,藥物開發(fā)研究,高通量篩選與組合化學,組合化學應用組合合成的方法，可以在短時間內(nèi)合成出含有102106個化合物的化學庫，為高通量藥物篩選提供了物質(zhì)基礎。,高通量篩選與組合化學,組合化學實現(xiàn)了組合庫的虛擬化，從而可以根據(jù)合成目標，獲得一個虛擬組合庫。然后通過相關軟件，從虛擬組合庫中篩選出，可能實現(xiàn)的、符合目標要求的藥物化學式，這就得到了實驗組合庫。 通過對虛擬組合庫的優(yōu)化，可以大大減少實驗組合庫的藥物數(shù)量，這為我們節(jié)省了大量的時間和資源。,新藥的發(fā)現(xiàn)過程： 合成化合物， 純化， 鑒定結構， 進行生物活性的測定。,傳統(tǒng)合成方法是要逐一合成，這種方法效率低、速度慢、成本高、周期長。,高通量篩藥物選利用組合合成方法同時和成大量化合物，然后通過生物高通量方法，對大量化合物進行高速、高效、低成本、微量化的篩選，并促進了許多新的生物活性評價方法。,高通量篩選生物活性評價方法：,組合化學樣品的準備 藥理活性評價 細胞毒性評價 藥代動力學評價 高信息篩選技術,組合化學樣品的準備：,樣品登記稱量稀釋轉運標記 具體操作：樣品登記時涉及樣品名稱、理化性質(zhì)、測試目的等內(nèi)容，樣品入庫后稱取一定量并用相應的溶劑（常用而甲基亞砜）溶解后作為母液共篩選用，然后經(jīng)過稀釋制備工作液，實驗室一般工作液分布在96孔板上，每板可以分布80個樣品，剩余16個孔作為篩選時設置各種對照。一般母液經(jīng)過2次100倍稀釋后即可作為工作液供篩選使用。,2.藥理活性評價,靶點的選擇 受體結合分析法、酶活性測定法、細胞活性因子測定法、代謝物質(zhì)測定法、細胞活性測定法等。 藥理活性結果評價 陽性率法、活性指標法、陽性藥標準。,對于同一結構類型、具有活性的化學樣品，應將該類化合物作為一組樣品，選取活性較好的樣品進行進一步研究，并分析其構效關系。 對于毒性較大的化學樣品，就要比較其最小有效濃度和最低毒性濃度差距，然后判斷其藥用價值。,對于結構類型完全不同的化學樣品，通過活性綜合分析，判斷樣品的藥理作用的選擇性。若該樣品只在特定模型中表現(xiàn)活性，且選擇性較好，則具有特定方面的開發(fā)價值；若在多種模型上都表現(xiàn)活性，則需通過綜合資料分析其是否具有藥用價值，然后再做進一步藥理價值研究。,3.細胞毒性評價,細胞毒性終點包括細胞吸附、遷移、凋亡、分裂、分化和壞死等。因細胞的生長抑制具有較好的毒性預測性，常選擇單一來源的細胞進行高通量細胞毒性篩選作為毒性的初篩。 細胞毒性檢測方法有：化學染料法、MTT法、LDH法、放射性核素標記法、熒光法、化學發(fā)光法、生物發(fā)光檢測法。,4.藥代動力學評價,這是一種通過建立研究候選化合物吸收、分布和代謝的體外篩選模型，根據(jù)藥理學、毒理學和藥動學篩選結果反饋來指導下一步的合成或改造。 目前常用的模型有：肝切片、培養(yǎng)的肝細胞、亞細胞部分如S9及肝微粒體等。,5.高信息篩選技術,高信息篩選技術是指通過軟件（常用ArrayscanTM和ImageProTM）獲得高分辨率的圖像，從而獲得單個細胞、細胞器和細胞內(nèi)藥靶的多方位信息。圖像一般可以反映多種細胞毒性的指征：細胞密度、溶解后pH、細胞形態(tài)、核形態(tài)和膜通透性等。,高通量篩選常用分析技術,熒光分析法 放射性分析技術 比色技術 發(fā)光檢測技術 核磁共振技術,熒光分析法,熒光分析法的特點：靈敏度高、易于檢測、實驗條件簡單、可以實現(xiàn)篩選體系的微量化等。,熒光分析法包括:,熒光強度分析法 均相時間分辨熒光法（ HTRF ） 極化熒光法（FP） 熒光共振能量傳遞分析法（FRET） 時間分辨熒光能量傳遞分析法（TRET） 熒光關聯(lián)光譜法（FCS）,熒光強度分析法,原理：許多分子帶有天然熒光基團，當待測大分子本身的熒光團不夠強烈而無法檢測時，可結合一些熒光染料以加強其光譜特征，然后根據(jù)其熒光強度的變化進行檢測。,時間分辨熒光分析,原理：利用激發(fā)波長、發(fā)射波長和熒光壽命的變化，對物質(zhì)進行檢測。 該方法具有靈敏度高、無放射性危害、標記物穩(wěn)定、線性范圍寬、分析速度快和操作簡便等優(yōu)點，受到廣大藥物篩選工作者的關注。,熒光極化（熒光偏振）,原理：當處于激發(fā)期的可自由運動的熒光團分子，被平面極化的光激發(fā)，使其發(fā)射到一個固定平面，分子間的旋轉碰撞導致發(fā)射光平面與激發(fā)光平面產(chǎn)生差別，導致極化值變化，從而進行檢測。 適用于：酶催化水解的檢測、蛋白質(zhì)互相作用、DNA診斷、生物膜的流動性變化、高通量篩選。,熒光共振能量傳遞分析法,原理：在合適的能量供體和能量受體分子間，提供一定的條件，即當供體激發(fā)態(tài)能量滿足光學和空間上的要求時，能量就會有效轉移給受體，通過記錄能量轉移接受體的接收時間來進行檢測。,時間分辨能量傳遞分析方法,原理：常范圍能量傳遞在熒光鑭復合物和共振能力安防受體之間。 優(yōu)點：受體長期存活和受體信號的時間通過減少背景具有高的靈敏度，無需對試劑進行特殊處理、檢測或沉淀。適用于檢測大量天然產(chǎn)物。,放射性分析技術，主要應用于檢測RNA轉錄，測定P56激酶活性，對氨基乙?；痶RNAd進行測定以及肝炎C病毒NS3蛋白酶抑制劑的藥物篩選等方面。 比色技術，用于檢測具有吸收性質(zhì)的物質(zhì)濃度，根據(jù)光線經(jīng)過被檢物質(zhì)后被吸收的多少，來評價吸收物質(zhì)的含量。是目前應用最廣泛的一向檢測法。,核磁共振技術，通過改變碰撞能，測定復合體解離時的能量，測得配體的親和力。在應用于NMR研究小分子化合物與生物大分子相互作用時具有明顯優(yōu)勢。,發(fā)光檢測技術，有些生物和化學物質(zhì)可以在 一定條件下進行化學反應，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象， 根據(jù)這些發(fā)光反應產(chǎn)生的光線強弱，判斷反 應的進行程度。,高通量藥物篩選的基本步驟：,高通量藥物篩選模型的建立 操作程序的編制 帶篩樣品的準備 篩選的實施 數(shù)據(jù)分析,藥物發(fā)現(xiàn)的基本過程,初篩和復篩（分子、細胞水平） 深入篩選（綜合分析獲得先導化合物） 確證篩選（確定開發(fā)前景并進行臨床研究）,高通量藥物篩選的前景,高通量藥物篩選只經(jīng)過十余年的實踐檢驗，在藥