DB33T537-2005動物組織中萊克多巴胺的測定.doc

DB33/T 2005浙江省質量技術監(jiān)督局 發(fā)布2005-03-18實施2005-02-17發(fā)布動物組織中萊克多巴胺的測定Determination of ractopamine in animal tissueDB33/T 5372005DB33浙江省地方標準ICS 65.120B 46備案號：1DB33/T 5372005前 言本標準由浙江省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標準由浙江省畜產(chǎn)品質量安全檢測中心、浙江省疾病預防控制中心負責起草，浙江一星集團飼料有限責任公司參與起草。本標準主要起草人：吳平谷、應永飛、朱聰英、陸春波、林仙軍、陳勇、周文海、浦琴華。I動物組織中萊克多巴胺的測定1 范圍本標準規(guī)定了以酶聯(lián)免疫（ELISA）法、高效液相色譜（HPLC）法和氣相色譜質譜（GCMS）法檢測動物組織中萊克多巴胺的方法，規(guī)定GCMS法為仲裁法。本標準適用于動物組織中萊克多巴胺的測定。酶聯(lián)免疫（ELISA）法為篩選方法，檢測限為5g/kg，高效液相色譜（HPLC）法和氣相色譜質譜（GCMS）法為定量方法，定量限HPLC法為5g/kg、GCMS法為1g/kg。線性范圍：酶聯(lián)免疫（ELISA）法為0.005ng-0.05ng，高效液相色譜（HPLC）法為2.5ng-10ng，氣相色譜質譜（GCMS）法為0.05ng-1.0ng。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3 試樣制備肌肉、肝臟、腎臟等動物組織，去筋后切成小塊，制成肉糜后，于18以下溫度冷凍保存。第一法 酶聯(lián)免疫法4 原理與方法4.1 原理本測定方法是酶聯(lián)免疫法中的競爭性測定法，其主要原理是：吸附在孔內的萊克多巴胺與標準或樣品中的萊克多巴胺競爭性地與萊克多巴胺抗體相結合，與標準品或樣品相結合的萊克多巴胺抗體被洗滌去除后，只剩下與微孔內藥物相結合的抗體，其再與加入的酶標記的第二抗體相結合，酶底物在酶作用下產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，吸光度的高低與樣品中萊克多巴胺的含量成反比。4.2 方法采用萊克多巴胺酶聯(lián)免疫試劑盒或類似產(chǎn)品，按試劑盒說明書操作。5 5試劑和溶液5.1 除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水巍去離子水，符合GB/T 6682二級水的規(guī)定。5.2 PBS緩沖液：用水10倍稀釋廠商提供的濃縮PBS緩沖液。5.3 工作洗液：用水20倍稀釋廠商提供的濃縮洗液。5.4 乙酸乙酯。5.5 碳酸鹽緩沖液：稱取4.3g碳酸鈉（Na2CO310H2O），2.9g碳酸氫鈉（NaHCO3），加水至1000mL，搖勻，調節(jié)pH值至9.5。5.6 提取液：取10mL甲醇，加90mLPBS緩沖液，搖勻。5.7 甲醇。5.8 第二抗體工作液：用第二抗體稀釋液2500倍稀釋第二抗體。6 儀器與設備6.1 微孔板酶標儀(帶450nm濾光片)。6.2 振蕩器。6.3 冷凍離心機。6.4 微量加樣器及配套吸頭：20L, 50L, 100L, 200L 。6.5 冰箱。6.6 洗板機。6.7 生化培養(yǎng)箱。6.8 氮吹儀。6.9 分析天平：感量0.01g。7 測定步驟7.1 注意事項不同品牌的試劑盒其操作步驟可能略有差別，實際操作過程中，操作步驟可根據(jù)試劑盒使用說明書略作調整。7.2 樣品處理取2.0g試樣于50mL離心管中，加入6mL提取液（5.5），用勻漿器勻漿，加入6mL碳酸鹽緩沖液（5.4），用勻漿器勻漿，再定量加入10mL乙酸乙酯（5.3），振蕩30min；以4000rpm的轉速離心5min，移取2.0mL上層有機相至另一新試管中，氮吹至干。加入50L甲醇（5.6）溶解殘余物后，再加入450LPBS緩沖液（5.1），即為供試溶液，取50L進行ELISA測定。7.3 測試程序根據(jù)所測定樣品及標準數(shù)，計算出所需微孔條數(shù)，將微孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個孔的平行重復，記錄標準和樣品的位置。加入50L的標準品和處理好的樣品到各自的微孔中，標準和樣品做兩個平行重復。加入100L第一抗體溶液到每一個微孔中，在37孵育30分鐘后倒出孔中的液體，將微孔架倒置在洗水紙上拍打（每輪拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，再加入工作洗液（5.2）250L，重復操作兩遍。最后用吸水紙吸干。加入150L稀釋的酶標記的第二抗體（5.7）37孵育30分鐘后倒出孔中的液體，將微孔架倒置在洗水紙上拍打（每輪拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，再加入工作洗液（5.2）250L，重復操作兩遍。最后用吸水紙吸干。加入100L底物液到微孔中，充分混合并在室溫孵育3-8min。加入50L反應終止液到微孔中，混合后在450nm處測量吸光度值。8 結果計算以空白（濃度為0的標準溶液）吸光度值為100%計算，折算出各標準和樣品的相對吸光度值。標準的吸光度值(或樣品) 相對吸光度值（%） = 100 空白的吸光度值計算出的標準相對吸光度值繪成為一個對應濃度(ng/L)的半對數(shù)坐標系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在200-2000ng/L范圍內應當成為線性。相對應每一個樣品的濃度(ng/L)可以從校正曲線上讀出。第二法 高效液相色譜法9 方法原理用乙腈提取試樣中的萊克多巴胺，經(jīng)固相萃取柱凈化，濃縮后用2乙酸溶液定容，用高效液相色譜熒光檢測法分離測定。 10 試劑和溶液10.1 除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T 6682二級水的規(guī)定。10.2 乙腈：色譜純。10.3 甲醇。10.4 乙腈。 10.5 乙酸乙酯。10.6 冰醋酸。10.7 無水硫酸鈉。10.8 戊烷磺酸鈉：色譜級。10.9 正己烷。10.10 氯化鈉。10.11 飽和氯化鈉溶液：取過量氯化鈉溶解于水中而得。10.12 2乙酸溶液：5mL冰醋酸加水至250mL，混勻。10.13 3甲醇/乙酸乙酯溶液：取15mL甲醇加乙酸乙酯至500mL，混勻。10.14 50甲醇/乙酸乙酯溶液：取250mL甲醇加乙酸乙酯至500mL，混勻。10.15 戊烷磺酸鈉溶液：取800mL水，加20mL冰醋酸和0.87g戊烷磺酸鈉（10.7，C5H11O3SNaH2O），混勻。10.16 固相萃取柱固相萃取柱的填充料為硅藻土和硅膠。）：每根柱填料量為500mg，柱體積5mL。10.17 萊克多巴胺標準溶液：萊克多巴胺貯備液（250g/mL） 精密稱取萊克多巴胺對照品25mg，置100ml容量瓶中，用甲醇（10.2）溶解并定容至刻度，其濃度為250g/mL，置-20冰箱中，可保存3個月。萊克多巴胺稀釋液 (5g/mL) 精密量取1ml萊克多巴胺貯備液（10.16.1），置50mL棕色容量瓶中，用甲醇（10.2）稀釋并定容至刻度，為萊克多巴胺工作液。萊克多巴胺工作溶液 分別準確吸取一定量的標準稀釋液（10.16.3），用2乙酸溶液（10.11）稀釋、定容，配制成濃度為0.05g/mL、0.1g/mL、0.2g/mL、0.5g/mL、1.0g/mL、2.0g/mL的標準溶液。11 儀器設備11.1 高效液相色譜儀（配熒光檢測器）。11.2 冷凍離心機。11.3 振蕩器。11.4 分液漏斗 100mL 。11.5 微孔濾膜 0.45m。11.6 渦旋混合器。11.7 分析天平 精度0.0001g。11.8 旋轉蒸發(fā)儀。11.9 雞心瓶 50mL。11.10 離心管 50mL,10mL。11.11 氮吹儀。12 測定步驟12.1 試樣提取稱取試樣10.0g至50mL離心管中，加10mL乙腈（10.3）提取，渦旋2min，7000rpm離心5min，取上清液于分液漏斗中，加入10mL正己烷（10.8）充分振搖，靜置后分離乙腈相；殘渣另取10mL乙腈重復提取一次，再用同一份正己烷分配，合并兩次分離的乙腈相，加入10mL飽和氯化鈉溶液（10.10）充分振搖，靜置后分離乙腈相，經(jīng)無水硫酸鈉（10.6）過濾，用2mL乙腈洗滌無水硫酸鈉，旋轉蒸干。12.2 試樣凈化用2mL乙酸乙酯（10.4）溶解雞心瓶中的殘留物，過固相萃取柱（10.15，先經(jīng)5mL甲醇和5mL乙酸乙酯潤洗）；另取5mL 3甲醇/乙酸乙酯（10.12）洗滌雞心瓶中的殘留物一次，過柱；再用5mL 50甲醇/乙酸乙酯（10.13）洗脫，氮吹至干。 12.3 定容用2乙酸溶液（10.11）定容到1mL，過膜，上機。12.4 測定高效液相色譜條件色譜柱：C18柱，長250mm，內徑4.6mm，粒度5m，或相當者。保護柱：C18柱，長20mm，內徑3.9mm，粒徑5m，或相當者。流動相：戊烷磺酸鈉溶液（10.14）：乙腈（10.1）80：20，使用前脫氣。流速：1.0mL/min。激發(fā)波長：226nm。發(fā)射波長：306nm。進樣量：50L。上機測定取相應濃度的標準工作液和樣品制備液，分別注入液相色譜儀，作單點或多點校準，以色譜峰面積按外標法積分定量。13 結果計算試樣中萊克多巴胺的含量按下式計算： 1000AiCsVs X AsM 式中：X樣品中萊克多巴胺的含量(g/kg)；Ai樣品峰面積； As對照溶液峰面積； Cs對照溶液濃度（g/ mL）； M樣品重量（g）； Vs定容體積（mL）。測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留2位有效數(shù)字。14 精密度14.1 重復性 實驗室內平行測定間的相對偏差不大于10。14.2 再現(xiàn)性 實驗室間測定的相對偏差不大于15。第三法 氣相色譜-質譜法15 方法原理用乙腈為提取劑提取試樣中游離的萊克多巴胺，然后用固相萃取柱凈化，BSTFA（雙三甲基硅基三氟乙酰胺）+TMCS（三甲基氯硅烷）衍生，最后用GCMS法進行定性定量分析。16 儀器與試劑16.1 氣-質聯(lián)用儀。 16.2 烘箱。16.3 BSTFA（雙三甲基硅基三氟乙酰胺）+1%TMCS （三甲基氯硅烷）。16.4 萊克多巴胺標準貯備溶液（5mg/mL）：準確稱取50mg 萊克多巴胺于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在冰箱中備用。16.5 萊克多巴胺標準工作溶液：取萊克多巴胺標準貯備溶液，用甲醇稀釋至所需濃度。16.6 甲苯。16.7 其它儀器，同11。16.8 其它試劑，同10。17 測定步驟17.1 試樣提取同HPLC法11.1。17.2 試樣凈化同HPLC法11.2。17.3 試樣衍生 蒸發(fā)剩余物加0.1 mL BSTFA+1%TMCS（16.3），加蓋后于旋渦混合器上震蕩，在80的烘箱中加熱1.0 h，氮氣吹干，加0.2mL甲苯（16.5）溶解。取適量的萊克多巴胺標準工作溶液，氮氣吹干，與試樣同法進行衍生化。17.4 色譜條件 色譜柱：5%苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細管柱(30 m0.25 mm0.25m)，或相當者。進樣口溫度：300。柱溫程序：初溫150，保持3 min，然后以10min升至230，保持10min，再以20min升至280保持10min。 載氣：高純氦氣（99.999%）。流速：1.0mL/min，不分流進樣。進樣量：1.0L。17.5 質譜條件 EI源：源溫230。 電子能量：70eV。 接口溫度：280。 電子倍增器電壓：1506V。 質量掃描范圍：30550U。選擇離子監(jiān)測方式（SIM）。監(jiān)測離子（m/z）