DB21T1861.2-2010水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗技術(shù)規(guī)程擴(kuò)增片段長度多態(tài)性法.doc

ICS67.120.30B50DB21遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 21/ T1861.22010水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗技術(shù)規(guī)程 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性法AFLP procedure to detect germplasm for aquaculture species2010 - 12 - 31發(fā)布2011 - 02 - 01實(shí)施遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB21/ T1861.22010前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院提出。本標(biāo)準(zhǔn)歸口單位：遼寧省海洋與漁業(yè)廳。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉衛(wèi)東、高祥剛、赫崇波、李云峰、李宏俊、鮑相渤。附錄A、B、C均為資料性附錄。8 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性法 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)生物擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析（AFLP）的原理、試劑、儀器和設(shè)備、采樣、分析步驟和數(shù)據(jù)運(yùn)算方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)生物種質(zhì)檢測與鑒定等方面的種質(zhì)檢驗工作。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 18654.15-2008 養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗 第15部分：RAPD分析3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）用一對寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷酸（dNTPs）為原料，在合適的溫度、離子條件和耐熱 DNA聚合酶催化下，在體外人工合成特異的DNA片段的過程。3.2 基因型（Genotype） 控制某一性狀的基因組合。3.3 座位（Locus） 基因在染色體上所處的特定位置。3.4 等位基因（Allele）基因的一種變異體，在二倍體細(xì)胞內(nèi)每個基因有兩個等位基因，每個等位基因分別來自于各自的親本。在一個群體中一個基因可能有許多等位基因。3.5多態(tài)性位點(diǎn)百分率 (Percent of Polymaorphic Loci，P) 表示后代所獲得某個等位標(biāo)記來自于它的父親（或母親）的同一個等位標(biāo)記的可能性。3.6 Neis 基因多樣性指數(shù)（Gene Diversity，H）隨機(jī)選擇基因間的非同一的概率。3.7 遺傳距離（Genetic Distance，D）用基因頻率的函數(shù)表示的群體間遺傳差異，它的最適宜的測度是單位長度DNA的核苷酸數(shù)或密碼子的差數(shù)，是用來表示群體或個體之間遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近的一個量化指標(biāo)，其值可以從0至無限大。群體或個體間的遺傳距離越小，它們之間的親緣關(guān)系越近，反之群體或個體間的遺傳距離越大，那么它們之間的親緣關(guān)系將越遠(yuǎn)。3.8 Shannon多樣性指數(shù)(Shannon index，I)用來估算群落多樣性的高低。3.9 聚類分析（Cluster Analysis） 將研究對象分為相對同質(zhì)的群組（clusters）的統(tǒng)計分析技術(shù)。4 原理擴(kuò)增片段長度多態(tài)性法（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）的原理是對基因組總DNA酶切后經(jīng)PCR進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，先將基因組DNA用兩種限制性內(nèi)切酶酶切成大小不等的片段，并與含有粘性末端的人工接頭相連，形成酶切位點(diǎn)不同的限制性酶切片段，然后用與接頭和位點(diǎn)相匹配的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為進(jìn)一步PCR擴(kuò)增的模板，再選用特異引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳將特異的限制性片段分離。由于不同來源DNA的酶切片段存在差異，因而產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)。5 試劑5.1 三羥甲基氨基甲烷（Tris）飽和酚。5.2 三氯甲烷：分析純。5.3 異戊醇：分析純。5.4 無水乙醇：分析純。5.5 20TBE緩沖液：三羥甲基氨基甲烷121g，硼酸61.7g，EDTA 7.44g，加超純水到1L。5.6 冰乙酸：分析純。5.7 瓊脂糖：生化試劑。5.8 核糖核酸（RNA）酶：生化試劑。5.9 蛋白酶K（20 mg/mL）：生化試劑。5.10 丙烯酰胺：分析純。5.11 甲叉雙丙烯酰胺：分析純。5.12 過硫酸銨：分析純。5.13 硝酸銀（AgNO3）：分析純。5.14 四甲基乙二胺（TEMED）：分析純。5.15 無水碳酸鈉：分析純。5.16 Taq DNA聚合酶（生化試劑，5 U/mL）。5.17 標(biāo)準(zhǔn)分子量Markers（100bp）。5.18 硝酸：分析純。5.19 37%甲醛溶液。5.20 乙二胺四乙酸（EDTA）：分析純。5.21 限制性內(nèi)切酶： EcoR、Mse。5.22 20%變性凝膠儲存液：丙稀酰胺38.6g，雙丙稀酰胺1.34g，尿素86g，20TBE緩沖液10mL，加熱溶解，超純水定容到200mL后，用0.25m的微孔濾膜抽濾，放置棕色瓶中4保存。5.23 上樣緩沖液：98甲酰胺，10mM EDTA(pH8.0)，0.01溴酚藍(lán)及二甲苯青。5.24 0.1mol/L硫代硫酸鈉：將2.48g 硫代硫酸鈉（Na2S2O35H2O）溶于100 ml 超純水中。5.25 銀染液：1g硝酸銀溶于1L超純水中，加入37%甲醛溶液1.5ml。5.26顯影液：3g碳酸鈉溶于超純水中，加入37%甲醛溶液1.5ml和0.1mol/L硫代硫酸鈉150l。6 儀器和設(shè)備6.1 凝膠成像分析系統(tǒng)。6.2 梯度PCR儀。6.3 低溫高速離心機(jī)。6.4 普通離心機(jī)。6.5 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。6.6 單道可調(diào)移液器（2.5 mL，10 mL，20 mL，100 mL，200 mL，1000 mL）。6.7 電子天平（量程0.01-300 mg）。6.8 水浴恒溫震蕩器。6.9 電泳槽。6.10 冷凍離心機(jī)。6.11 紫外分光光度計。6.12 超聲波清洗器。6.13 超純水器。6.14 北京六一儀器廠DYY-型電泳儀。6.15 測序凝膠電泳槽。7 采樣 7.1 樣品類型7.1.1 I型樣品：毛發(fā)、皮毛類（儒艮、中華白海豚、斑海豹、海龜）。7.1.2 型樣品：肌肉、臟器組織類（仿刺參、海膽、虹鱒、大菱鲆、鰻鱺、中國對蝦、日本對蝦、中華絨鰲蟹、三疣梭子蟹、皺紋盤鮑、海灣扇貝、蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、文蛤、牡蠣、海蜇等）。7.1.3 III型樣品：藻類（海帶、裙帶菜、鼠尾藻等）。7.2 采樣方法7.2.1珍稀瀕危動物采樣應(yīng)在自然保護(hù)機(jī)構(gòu)、人工養(yǎng)殖部門等協(xié)助下進(jìn)行，以不傷害個體、不破壞其生境為原則，采集其毛發(fā)、皮毛等作為樣品，特殊情況（如出現(xiàn)受傷個體等）可酌情采取其他部位（如肌肉、肝臟等）。樣品數(shù)量應(yīng)不少于10個/群體。所采樣品標(biāo)注后，妥善存放，防止污損，做好采樣記錄。7.2.2重要水產(chǎn)生物采樣隨機(jī)采取正常、健康個體樣品，數(shù)量不少于30個/群體。樣品標(biāo)注后，活體運(yùn)至實(shí)驗室。8 分析步驟8.1 樣品固定8.1.1 型樣品將樣品先用70%乙醇洗1次，再用超純水沖洗2次，-20保存?zhèn)溆谩?.1.2 型樣品從活體中直接采集肌肉或臟器組織， -20冰箱直接凍存。8.1.3 型樣品選取幼嫩藻尖，用毛筆在無菌海水中充分刷洗，解剖鏡下觀察，確定沒有附生雜藻后，在無菌蒸餾水中清洗，晾干備用。8.2 DNA提取8.2.1 型樣品在200L 離心管中放入14根毛發(fā)，毛囊置于離心管底部，剪去高于離心管部分的毛發(fā)，設(shè)置一個空白對照管；在每個離心管中加入15L配制好的毛囊裂解液。毛囊裂解液用1PCR緩沖液(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，0.01%明膠)，加MgCl2至2mmol/L，蛋白酶K 20mg/L；在PCR儀上設(shè)置一個單循環(huán)程序：65 30min，95 15min，4 10min；將上一步驟中的離心管放入預(yù)熱好的PCR儀中，運(yùn)行該程序。程序結(jié)束后，將離心管進(jìn)行瞬時離心，-20保存?zhèn)溆谩?.2.2 型樣品取-20下凍存的肌肉或臟器0.2g，置于液氮中研成粉末；加DNA提取液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，75mmol/L NaCl，0.5%SDS，5mmol/L EDTA)。振蕩均勻后，65水浴1h；按GB/T 18654.15-2008的規(guī)定，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；用50 L TE緩沖液（10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，lmmol/L EDTA）溶解DNA，-20保存。8.2.3 型樣品取鮮樣品50150mg，剪成小塊放入研缽中，加入液氮，待樣品完全冷凍后，快速、用力研磨至粉末狀；將研缽放入65水浴至樣品粉末剛開始融化，向研缽中加入DNA提取液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，75mmol/L NaCl，0.5SDS，5mmol/L EDTA)及RNA酶、蛋白酶K共400L，用力碾磨30s。收集研磨好的組織勻漿移至1.5mL離心管中，65保溫1560min，按GBT 18654.15-2008的方法，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；水相加入0.1倍體積醋酸鈉 (3mol/L，pH5.2) 和兩倍體積無水乙醇沉淀；溶于50L TE緩沖液 (10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，lmmol/L EDTA)，置-20保存?zhèn)溆谩?.3 DNA產(chǎn)物測定8.3.1 DNA純度檢測吸取13 L提取的DNA，用濃度12瓊脂糖凝膠100V電泳 30 min，檢測所提取DNA的質(zhì)量。以DNA條帶的分子量及有無拖尾為標(biāo)準(zhǔn)判斷DNA的質(zhì)量。8.3.2 DNA濃度檢測8.3.2.1紫外吸收定性測試分別于260 nm波長和280 nm波長下測定產(chǎn)物（或產(chǎn)物稀釋液）的紫外吸收值。確定A260A280比值在1.82.0范圍內(nèi)，方可正常進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。8.3.2.2 紫外吸收定量測試260nm波長下測定產(chǎn)物（或產(chǎn)物稀釋液）的紫外吸收值，根據(jù)公式計算DNA濃度。DNA濃度(g/mL)=A260(0.020L)稀釋倍數(shù)，公式中的A260表示被測樣品在260nm波長下的吸光度值，L為比色池厚度，單位是cm。應(yīng)保證DNA濃度在10g/mL以上，方可正常進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗?；蚪MDNA產(chǎn)物完成產(chǎn)物鑒定后，稀釋到100ng/L備用。8.4 AFLP分析8.4.1 限制性內(nèi)切酶消化本規(guī)程統(tǒng)一采用EcoR/ Mse雙酶切組合反應(yīng)體系。按表1配制酶切體系，每40L體系中加入DNA 10L， 37保溫3h， 65保溫3h。表1 限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系試劑原始濃度最終濃度體積（L）酶切緩沖液10X1X5.0EcoR10U/l5U0.5Mse4U/l5U1.25乙?；Ｑ灏椎鞍?0g/l5g0.5超純水32.75基因組DNA50ng/l10l總計50l8.4.2 接頭復(fù)性將EcoR和Mse各自的單鏈接頭等分子數(shù)混合， 94變性3min，37保溫5min。接頭序列見附錄A8.4.3 接頭連接（冰上操作）按表2配制連接體系，混勻，室溫下連接過夜。表2 接頭連接反應(yīng)體系試劑體積（L）基因組DNA酶切液5.0EcoR 接頭(2PM/L)1.0Mse 接頭(2PM/L)1.0T4 DNA 連接酶10X緩沖液2.0T4 DNA 連接酶 (3U/L)0.1Acetylated BSA0.02超純水10.88總計20.08.4.4預(yù)擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增引物序列見附錄B。按表3配制預(yù)擴(kuò)增體系，按表4進(jìn)行PCR反應(yīng)。表3 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系試劑體積(L)EcoR預(yù)擴(kuò)增引物 (50ng/l)1.2Mse預(yù)擴(kuò)增引物 (50ng/l)1.2dNTPs (5mM)0.810X PCR緩沖液2.0Taq酶 (5U/l)0.2MgCl2 (25mM)1.6超純水11.0接頭連接液2.0總計20.0表4 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件94（初始變性）2 min94（變性）1 min26 個循環(huán)56（退火）1 min.72（延伸）1 min.72（終了延伸）5 min.8.4.5選擇擴(kuò)增選擇擴(kuò)增引物序列見附錄C，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10-100倍作為選擴(kuò)增模板，按表5配制選擴(kuò)增體系，按表6進(jìn)行PCR反應(yīng)。表5 選擇擴(kuò)增反應(yīng)體系試劑體積(L)EcoR選擇擴(kuò)增引物 (50ng/l)1.2Mse選擇擴(kuò)增引物 (50ng/l)1.2dNTPs (5mM)0.810X PCR緩沖液2Taq聚合酶 (5U/l)0.2MgCl2 (25mM)1.6超純水12.0預(yù)擴(kuò)增稀釋液1.0總計20表6 選擇擴(kuò)增反應(yīng)條件94（初始變性）2 min94（變性）30 s12循環(huán)，每個循環(huán)降低退火溫度0.765（退火）30 s72（延伸）1 min.94（變性）30 s23個循環(huán)56（退火）30 s72（延伸）1 min.72（終了延伸）2 min.8.4.6凝膠電泳及染色（1）模具處理與安裝：清洗用作模具的玻璃板并晾干，并分別涂上親和硅烷（主板）和剝離硅烷（耳板），安裝好邊條并加緊模具。（2）6變性聚丙烯酰胺凝膠制備：按表7配制6%變性聚丙烯酰胺凝膠。將凝膠液灌入模具至膠液距模具上沿0.6cm，將梳子背面插入膠液中，吸出多余膠液，室溫下聚合2h。表7 6%聚丙烯酰胺變性凝膠配制藥品與試劑體積20膠儲存液15mL超純水34.6mL10過硫酸銨0.4mLTEMED31.5L總體積50mL（3）預(yù)電泳 凝膠聚合后，將梳子正向插入膠頂空處，形成加樣孔，連接好電泳設(shè)備，添加TBE電泳緩沖液，60W恒功率進(jìn)行預(yù)電泳0.5h。（4）清洗上樣孔 關(guān)閉電源，用注射器吸取電泳緩沖液逐個清洗加樣孔。（5）產(chǎn)物變性 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中添加等體積上樣緩沖液混勻，95變性5min，迅速置于冰上。（6）上樣 用微量移液器取變性反應(yīng)物加到加樣孔內(nèi)，每孔上樣量為58L。（7）電泳 采用恒恒功率電泳，至二甲苯青達(dá)凝膠的下2/3處，停止電泳。（8）銀染 取下凝膠板，拆除耳板和邊條，將其置于10冰醋酸中進(jìn)行固定，搖床上搖30min，將膠板轉(zhuǎn)入超純水中清洗3次，每次2min，將膠板置于銀染液中染30min，超純水沖洗5s后立即放入顯影液中，待條帶顯出后，用10冰醋酸定影5min，自來水沖洗1min，晾干。（9）將上述膠板置于凝膠成像儀中，利用相關(guān)圖像采集系統(tǒng)得到清晰的電泳凝膠圖像，用于結(jié)果分析。9 數(shù)據(jù)分析9.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計選擇電泳后清晰的擴(kuò)增片段進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。在相同遷移位置，按每一個體擴(kuò)增片段的有無，出現(xiàn)擴(kuò)增帶記錄為1，無擴(kuò)增帶記錄為0。建立各個群體的01數(shù)據(jù)陣列