GB5413.20-2013食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定.pdf

中華人民共和國國家標準中華人民共和國國家標準GB 5413.2020132013-11-29 發(fā)布2014-06-01 實施食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定GB 5413.202013I前言本標準代替GB/T 5413.201997嬰幼兒配方食品和乳粉 膽堿的測定。本標準與GB/T 5413.201997相比，主要變化如下：修改了標準的名稱；修改了用于酶反應的顯色劑成分；增加了第二法雷氏鹽分光光度法。GB 5413.2020131食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定1范圍本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定方法。本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定。第一法酶比色法2原理試樣中的膽堿經(jīng)酸水解后變成游離態(tài)的膽堿，再經(jīng)酶氧化后與顯色劑反應生成有色物質(zhì)，其顏色的深淺在一定濃度范圍內(nèi)與膽堿含量成正比。3試劑和材料注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T6682 規(guī)定的三級水。3.1試劑3.1.1三羥甲基氨基甲烷(CH2OH)3CNH2。3.1.2苯酚(C6H5OH)。3.1.3濃鹽酸 (HCl)。3.1.4氫氧化鈉(NaOH)。3.1.5膽堿氧化酶：置于-20 保存。3.1.6過氧化物酶：置于 2 8 保存。3.1.74-氨基安替比林(C11H13N3O) 。3.1.8磷脂酶 D：置于-20 保存。3.2試劑配制3.2.1鹽酸(1 mol/L)：量取 85 mL 濃鹽酸加水稀釋至 1000 mL。3.2.2鹽酸(3 mol/L)：量取 125 mL 濃鹽酸加水稀釋至 500 mL。3.2.3Tris 緩沖溶液（0.05 mol/L）：pH =8.00.2。稱取6.057 g三羥甲基氨基甲烷溶入500 mL蒸餾水中，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH至8.00.2，用蒸餾水定容至1000 mL。此溶液在4冰箱中可保存一個月。3.2.4用于酶反應的顯色劑：取 100 120 活力單位的膽堿氧化酶、250280 活力單位的過氧化物酶、75 個100 個活力單位的磷脂酶 D、 15 mg 4-氨基安替比林， 50 mg 苯酚置于 100 mL的容量瓶中， 用 0.05mol/L Tris 緩沖溶液稀釋至刻度。臨用時配制。3.2.5氫氧化鈉溶液(500 g/L)：稱取 500 g 氫氧化鈉，溶于水并稀釋至 1000 mL。GB 5413.20201323.3標準品膽堿酒石酸氫鹽標準品（C9H19NO7）：純度99%。3.4標準溶液配制3.4.1膽堿氫氧化物標準貯備溶液（2.5 mg/mL）：稱取在 1022烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽 523mg 置于 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。冷藏于 42冰箱中，保存不超過 1 周。3.4.2膽堿氫氧化物標準工作溶液（250 g/mL）：吸取 10.0 mL 標準貯備溶液于 100 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度。臨用時配制。4儀器和設(shè)備4.1天平：感量為 0.01 g 和 0.1 mg。4.2恒溫水浴鍋：溫度可控制在 702和 372。4.3pH 計：精度 0.01。4.4分光光度計。5分析步驟5.1試樣制備5.1.1固體試樣稱取 5 g （精確到 0.01 g）混合均勻的試樣，于 100 mL 的錐形瓶中，加入 30 mL 鹽酸溶液（3.2.1） 。5.1.2液體試樣稱取 20 g （精確到 0.01 g） 混合均勻的試樣， 于 100 mL 的錐形瓶中， 加入 10 mL 鹽酸溶液 （3.2.2） 。5.1.3水解將裝有試樣的容器放在 70水浴中，加塞混勻，水解 3 h（每隔 30 min 振搖一次），冷卻。用氫氧化鈉溶液調(diào) pH 為 3.54.0，轉(zhuǎn)入 50 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。5.1.4過濾過濾水解液（5.1.3） 。濾液應是澄清的，否則，用 0.45 m 的濾膜再次過濾。濾液放在 4的冰箱中可以保存 3 d。5.2測定5.2.1標準曲線的制作分別吸取2 mL、4 mL、6 mL、8 mL膽堿氫氧化物標準工作溶液于10 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。準備6支試管，一個試管用作試劑空白（A） ，另五支試管由1至5編號，分別用于標準溶液和標準溶液的四個稀釋度。按表1加入試劑。GB 5413.2020133表1制作標準曲線時的試劑添加量單位為毫升試劑管A管1管2管3管4管5稀釋度1/（50g/mL）0.100稀釋度2/（100g/mL）0.100稀釋度3/（150g/mL）0.100稀釋度4/（200g/mL）0.100標準溶液/（250g/mL）0.100蒸餾水0.100發(fā)色劑3.003.003.003.003.003.00用密封保護膜蓋住試管，混勻，把試管置于37水浴中保溫反應15 min。5.2.2試樣的測定將每個試樣準備 2 支試管（B，C），按表 2 加入試劑。表 2測定試樣時的試劑添加量單位為毫升試劑試管B濾液空白試管C試樣待分析濾液0.1000.100蒸餾水3.00發(fā)色劑3.00用密封保護膜蓋住試管，混勻。把試管置于 37水浴中保溫反應 15 min。5.2.3比色測定將試樣及標準系列溶液從水浴中取出，冷卻至室溫。在波長 505 nm 處，用蒸餾水作空白，測定吸光值。以膽堿標準溶液的濃度為橫坐標，以標準溶液的吸光值減去試劑空白的吸光值為縱坐標，制作標準曲線。6分析結(jié)果的表述6.1凈吸光值的計算通常新鮮配制的試劑會產(chǎn)生輕微顏色， 且由于水解作用濾液也不是無色的， 為了除去這些干擾因素，應該從總吸光值中減去各自的空白值（管A和管B） 。試樣凈吸光值計算如公式（1）所示：exbltotAAAA（1）式中：A 試樣凈吸光值；Atot總吸光值（管C） ；Abl試劑吸光值（管A） ；Aex濾液吸光值（管B） 。Abl和Aex不應大于總吸光值的20%，對于標準曲線，Aex= 0。GB 5413.20201346.2膽堿含量的計算在標準曲線上查出凈吸光值的位置，并記下相應的濃度c，以每100 g試樣中膽堿氫氧化物的毫克數(shù)表示膽堿的含量（X），單位為（mg/100 g） ，試樣中的膽堿氫氧化物含量按公式（2）計算：1000100mVcX（2）式中：X試樣中的膽堿氫氧化物含量，單位為毫克每百克（mg/100 g） ；c自標準曲線上查得的膽堿氫氧化物的濃度，微克每毫升（g/mL） ；V水解液被稀釋的體積（通常為50 mL） ，單位為毫升（mL） ；m 試樣的質(zhì)量，單位為克（g） ；1000換算系數(shù)。計算結(jié)果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留整數(shù)位。7精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的 8%。8其他方法檢出限為 1 mg/100g，定量限為 3 mg/100g。第二法雷氏鹽分光光度法9原理試樣中的膽堿用氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷混合溶液水解抽提，經(jīng)弗羅里硅土層析凈化，與雷納克銨鹽溶液形成粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，用丙酮溶解洗脫，于 526 nm 測定吸收值。在一定濃度范圍內(nèi)，膽堿雷納克銨鹽顏色的深淺與其含量成正比。10試劑和材料注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的三級水。10.1試劑10.1.1弗羅里硅土：100 目200 目，650活化。10.1.2甲醇（CH3OH）。10.1.3三氯甲烷（CHCl3）。10.1.4氫氧化鋇Ba（OH）28H2O。10.1.5冰乙酸（CH3COOH）。10.1.6乙酸甲酯（C3H6O2）。10.1.7丙酮(CH3COCH3)。10.1.8雷納克銨鹽(C4H10CrN7S4)。10.2試劑配制GB 5413.202013510.2.1飽和氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷溶液：稱取 6 g 氫氧化鋇溶于 100 mL 甲醇中， 放入超聲波中溶解后，加入 10 mL 三氯甲烷，混勻。10.2.2冰乙酸-甲醇溶液(1+10)：1 體積冰乙酸與 10 體積甲醇混合。10.2.3雷納克銨鹽溶液：稱取 0.25 g 雷納克銨鹽，加入 10 mL 水中，放入超聲波中溶解后過濾，臨用時配制。10.3標準品膽堿酒石酸氫鹽(C9H19NO7)：純度99%。10.4標準溶液配制膽堿酒石酸氫鹽標準溶液(1 g/L)：準確稱取在 1022烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽 0.1000 g，用蒸餾水定容至 100 mL 容量瓶中。冷藏于 42冰箱中，保存不超過一周。11儀器和設(shè)備11.1天平：感量為 0.01 g 和 0.1 mg。11.2回流裝置：250 mL 磨口錐形瓶及回流裝置。11.3恒溫水浴鍋：溫度可控制在 792。11.4層析柱：長約 10 cm、內(nèi)徑 1 cm 的帶 50 mL 杯口的玻璃柱。11.5分光光度計。12分析步驟12.1試樣制備稱取固體試樣 10 g(精確到 0.01 g)， 稱取液體試樣 20 g(精確到 0.01 g)于磨口錐形瓶中， 加入 50 mL氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷提取液。混合均勻后接入回流裝置，于 792的水浴鍋內(nèi)水解抽提 4 h。每隔 1 h 震蕩一次，以避免試樣結(jié)塊。水解抽提結(jié)束后，取出錐形瓶冷卻至室溫，過濾。濾渣用冰乙酸-甲醇混合液洗滌 3 次4 次，洗液一并收集于 100 mL 容量瓶中。用甲醇定容至刻度，混勻。12.2標準曲線的繪制12.2.1層析柱制備用乳膠管連接層析柱與滴頭，用少量脫脂棉堵住層析柱底部，倒入約 5 cm 左右高的弗羅里硅土，用甲醇浸濕，備用。12.2.2層析分別吸取膽堿標準溶液 0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 注入層析柱中，當溶液完全進入柱床后，依次用 5 mL 和 10 mL 甲醇，20 mL 乙酸甲酯洗滌層析柱。再加入 5 mL 雷納克銨鹽溶液，用適量的冰乙酸洗去過量的雷納克銨鹽，直至層析柱上無雷納克銨鹽附著處呈現(xiàn)硅土原有的白色。用丙酮洗脫粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，收集于 10 mL 的容量瓶中，用丙酮定容（如果洗脫液混濁需過 0.45 m 的濾膜） 。在波長 526 nm 處測定溶液的吸光值，以膽堿酒石酸氫鹽含量為橫坐標（mx） ，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。12.3試樣的測定GB 5413.2020136吸取10 mL試樣水解液（12.1）于層析柱中，其余操作按照 12.2.2進行。自標準曲線上查得10 mL試樣水解液中膽堿酒石酸氫鹽的含量。13分析結(jié)果的表述試樣中的膽堿以膽堿氫氧化物計，以毫克每百克（mg/100g）表示，按公式（3）計算：474. 0100100VmmXx（3）式中：X試樣中膽堿氫氧化物的含量，單位為毫克